劉天增，毛中偉，張巨明

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東省草業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

狗牙根內(nèi)生固氮菌生長條件

劉天增，毛中偉，張巨明

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東省草業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

摘要：從已分離的多個狗牙根(Cynodon dactylon)內(nèi)生固氮菌株中篩選到兩株固氮酶活性較高的菌株7D和BM13，為明確固氮菌株對環(huán)境因子的適應(yīng)性，研究了在不同的生長環(huán)境條件下菌株的生長量。采用Ashby無氮培養(yǎng)基，測定了溫度、pH、滲透壓以及不同氮源和碳源等環(huán)境條件對固氮菌生長的影響。結(jié)果表明，在10～40 ℃的溫度范圍內(nèi)、pH值3.92～9.64的酸堿環(huán)境和30 g·L-1NaCl的高滲透壓下，固氮菌7D和BM13均能正常生長；菌株能耐受0～10 mmol·L-1的NH4+和NO3-，而且能利用蔗糖、甘油、麥芽糖、甘露醇和葡萄糖等多種碳源生長。說明狗牙根內(nèi)生固氮菌株7D和BM13對環(huán)境因子有很強的抗逆性和適應(yīng)性，但兩菌株之間存在一定差異，可望進一步研發(fā)成為優(yōu)良的固氮微生物肥料生產(chǎn)菌種。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生固氮菌；生長條件；生物固氮

氮是草坪生長發(fā)育過程中不可缺少的營養(yǎng)元素，氮肥能加深草坪的顏色、增加密度、延長綠期、提高抗逆性等，所以施用氮肥是獲得高質(zhì)量草坪的重要保證[1]。目前，在草坪養(yǎng)護管理中主要通過施用化學(xué)肥料來解決草坪氮素需求的問題。同時，化肥的不合理施用造成氮素吸收利用率低、地下水污染、土壤板結(jié)等環(huán)境問題[2]。因此，急需尋找和發(fā)掘新的氮素資源，部分替代或減少對工業(yè)氮肥的依賴，可以有效解決以上問題。

植物內(nèi)生固氮菌是近年來發(fā)現(xiàn)的存在于植物中的高效固氮體系，可為許多非豆科植物固氮，是環(huán)境友好、節(jié)能環(huán)保的氮素供應(yīng)者，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究中有重要意義。內(nèi)生固氮菌在宿主植物中傳導(dǎo)、定殖，整個生活周期寄居在植物組織中生存、繁衍，卻不會對寄主植物造成傷害[3]。從1986年開始，研究人員相繼從禾本科作物的根、莖、葉中分離篩選出多種內(nèi)生固氮菌，詳細研究了它們的固氮特性，結(jié)果證明內(nèi)生固氮菌表現(xiàn)出很高的固氮效率[4]。據(jù)報道，內(nèi)生固氮菌能提供寄主植物生長所需的氮素，還可以分泌生長素，促進植物生長，增加生物量，提高植物體內(nèi)氮素含量和促進根系發(fā)育，增強植株抗逆性[5]。隨著對植物內(nèi)生固氮菌研究的逐步深入和不斷發(fā)現(xiàn)的新菌種，生物固氮表現(xiàn)出了巨大潛力和良好的應(yīng)用前景[6-7]。

大量研究[8-9]表明，植物接種固氮菌后一般都有增加氮素營養(yǎng)、促進生長和增產(chǎn)的效果，盡管內(nèi)生固氮菌有巨大的生物固氮潛力，但其固氮效率卻受到各種環(huán)境因子的影響，導(dǎo)致固氮量不能持續(xù)增加，植物增產(chǎn)效果不穩(wěn)定。一般認為，濕度、溫度和鹽度等環(huán)境因子的變化可能會直接或間接影響固氮菌的生長和固氮速率[10-11]。對于草坪生態(tài)系統(tǒng)來說，日常的養(yǎng)護管理措施，如施肥、噴農(nóng)藥等均會影響生物固氮效果。比如，長期大量施用氮肥增加土壤中的有效氮含量，會抑制固氮菌中固氮酶的活性和競爭優(yōu)勢[12]。此外，過量施肥會破壞生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分平衡，使固氮菌的生長和繁殖受到其它養(yǎng)分如磷、鐵的限制，進而影響生物固氮的過程，降低固氮量[13]。因此，環(huán)境條件影響固氮菌的固氮效率，導(dǎo)致接種效果不穩(wěn)定，在很大程度上制約了固氮菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用及商品化進程。

本研究以狗牙根植株中分離篩選獲得的兩株內(nèi)生固氮菌為材料，通過其對不同溫度、酸堿度、滲透壓、氮源和碳源等環(huán)境因子的適應(yīng)性，分析影響內(nèi)生固氮菌生長和固氮酶活性表達的環(huán)境因子，為進一步研究適宜狗牙根草坪的微生物接種劑或菌肥奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

內(nèi)生固氮菌株7D和BM13由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)草坪實驗室從校園內(nèi)生長良好的狗牙根植株內(nèi)分離得到。菌株7D菌落形態(tài)特征：白色透明，圓形，邊緣整齊，短桿狀，革蘭氏陽性菌。菌株BM13菌落形態(tài)特征：黃色，菌落較小，圓形，光滑，桿狀，革蘭氏陽性菌。經(jīng)測定菌株7D和BM13的固氮酶活性分別為148.77和153.42 μmol·(h·mL)-1。經(jīng)過16S rDNA和形態(tài)學(xué)鑒定，菌株7D和BM13分別為Rhizobiummeliloti和Pseudomonasrhodesiae[14]。

1.2培養(yǎng)基

固氮菌株生長培養(yǎng)基均采用Ashby無氮培養(yǎng)基：KH2PO40.2 g·L-1，CaCO35 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，甘露醇10 g·L-1，NaCl 0.2 g·L-1，瓊脂18 g·L-1，CaSO4·2H2O 0.1 g·L-1；pH 7.0。

1.3試驗方法

本試驗以Ashby培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究溫度、pH、滲透壓、氮源和碳源等環(huán)境條件對固氮菌生長的影響[15]。

1.3.1溫度對固氮菌生長的影響設(shè)置10、15、20、25、30、35、40 ℃共7個培養(yǎng)溫度，將固氮菌株7D和BM13按培養(yǎng)基體積2%的接種量接種于Ashby液體培養(yǎng)基中，每組3次重復(fù)，在不同培養(yǎng)溫度的搖床中，150 r·min-1，振蕩培養(yǎng)36 h，UV-1201型分光光度計在600 nm波長處測定菌懸液的光密度值，作為菌株生長量指標。

1.3.2pH對固氮菌生長的影響以液體Ashby培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，將其pH設(shè)為4、5、6、7、8、9、10共7個梯度。高壓蒸汽滅菌后，重新測定滅菌后的7個梯度的pH值。將固氮菌株7D和BM13按培養(yǎng)基體積2%的接種量分別接種于上述培養(yǎng)液中，每個處理3次重復(fù)，30 ℃，150 r·min-1，振蕩培養(yǎng)36 h，UV-1201型分光光度計在600 nm波長處測定菌懸液的光密度值，作為菌株生長量指標。

1.3.3滲透壓對固氮菌生長的影響以液體Ashby培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在不添加NaCl的培養(yǎng)基中加入NaCl，使NaCl的終濃度分別為0.2、10、20、30、40、50、60 g·L-1共7個梯度。高壓蒸汽滅菌后，將固氮菌株7D和BM13按培養(yǎng)基體積2%的接種量分別接種于上述培養(yǎng)液中，每個梯度3個重復(fù)，30 ℃，150 r·min-1，振蕩培養(yǎng)36 h，UV-1201型分光光度計在600 nm波長處測定菌懸液的光密度值，作為菌株生長量指標。

1.3.4不同氮源對固氮菌生長的影響以液體Ashby培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別向培養(yǎng)基中加入KNO3和NH4Cl，使NO3-和NH4+的濃度分別為0、1、2、3、4、5、6 mmol·L-1共7個梯度。高壓蒸汽滅菌后，將固氮菌株7D和BM13按培養(yǎng)基體積2%的接種量分別接種于上述培養(yǎng)液中，每個梯度3次重復(fù)，30 ℃，150 r·min-1，振蕩培養(yǎng)36 h，UV-1201型分光光度計在600 nm波長處測定菌懸液的光密度值，作為菌株生長量指標。

1.3.5不同碳源對固氮菌生長的影響以液體Ashby培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別用等重量的蔗糖、葡萄糖、檸檬酸、蘋果酸、甘油、麥芽糖替代原培養(yǎng)基中的甘露醇，配制7種含不同碳源的培養(yǎng)液。高壓蒸汽滅菌后，將固氮菌株7D和BM13按培養(yǎng)基體積2%的接種量分別接種于上述液體培養(yǎng)基中，每組3個重復(fù), 30 ℃，150 r·min-1，振蕩培養(yǎng)36 h，UV-1201型分光光度計在600 nm波長處測定菌懸液的光密度值，作為菌株生長量指標。

1.4統(tǒng)計分析

利用SPSS 16.0軟件對不同生長條件下的固氮菌生長量進行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1溫度對固氮菌生長的影響

將供試菌株放在不同溫度下培養(yǎng)。結(jié)果表明，菌株7D和BM13在10～40 ℃范圍內(nèi)均能生長，說明這兩株固氮菌對溫度的適應(yīng)范圍較廣(圖1)。隨著培養(yǎng)溫度升高，兩種菌株的生長量呈先增后減的趨勢，而且二者的最適生長溫度有差異。菌株7D的較適生長溫度為20～25 ℃，與其它溫度間的生長量均有顯著差異 (P<0.05)。菌株BM13的最適生長溫度為20 ℃，菌株生長量顯著高于其它溫度下的生長量。當培養(yǎng)溫度大于各自的最適生長溫度時，菌株生長量逐漸下降?？梢?，菌株7D和BM13都適合在較低溫度下生長。

2.2pH對固氮菌生長的影響

本研究以Ashby液體培養(yǎng)基作為菌株生長培養(yǎng)基，由于Ashby培養(yǎng)基中含有CaCO3，而CaCO3在滅菌的高溫條件下發(fā)生分解，會改變液體培養(yǎng)基的pH。所以，應(yīng)測定滅菌前后培養(yǎng)基的pH，并以，滅菌后的pH為準。滅菌前，7個梯度的pH分別為4.00、5.04、6.01、7.02、8.03、9.03和10.00；滅菌后，相應(yīng)的pH分別為3.92、5.08、5.85、6.93、7.90、8.88和9.64，并以滅菌后的pH為準。

待測菌株的生長量隨pH的變化趨勢如圖2所示。菌株在培養(yǎng)液pH為3.92～9.64的范圍內(nèi)都能生長，說明兩株固氮菌的酸堿適應(yīng)范圍較廣。其中，菌株7D在pH為5.85～6.93的范圍內(nèi)生長量急劇升高，且在pH為6.93時生長量達到最大值，顯著高于其它pH處理(P<0.05)。隨后，隨著pH不斷增加，生長量又很快減小，說明其最適合在pH為6.93接近中性的環(huán)境下生長。菌株BM13在pH為7.90時生長量最大，說明其適合在堿性環(huán)境下生長。菌株BM13在pH分別為6.93、8.88和9.64時，三者間生長量差異不顯著(P>0.05)。

2.3滲透壓對固氮菌生長的影響

不同種類的微生物對滲透壓變化的適應(yīng)能力不相同，本研究用NaCl來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓。不同NaCl濃度的培養(yǎng)基對固氮菌生長量的影響明顯不同(圖3)。菌株7D在NaCl濃度為10～60 g·L-1時生長量并沒有發(fā)生明顯的變化且相互之間差異不顯著(P>0.05)，說明菌株7D具有較高的耐鹽能力且耐高鹽的范圍較大。而菌株BM13在NaCl濃度為0.2～30 g·L-1的范圍內(nèi)，隨著NaCl濃度的增加生長量增大，并在NaCl濃度為30 g·L-1生長量達到最大值，但與NaCl濃度為40和50 g·L-1的生長量之間無顯著差異。當NaCl濃度增加至60 g·L-1時，生長量急劇減小，說明菌株BM13不耐高鹽。

圖1　培養(yǎng)溫度對固氮菌7D和BM13生長的影響

注：同一菌株不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Different lower case letters for the same endophytic diazotroph strain indicate significant difference among different treatments at 0.05 level. The same below.

圖2　pH對固氮菌7D和BM13生長的影響

圖3　滲透壓對固氮菌7D和BM13生長的影響

2.4不同氮源對固氮菌生長的影響

NO3-和NH4+可以為固氮菌的生長提供氮源。當NO3-濃度為1 mmol·L-1時，菌株7D生長量最小，固氮菌的生長受到抑制(圖4)。隨著NO3-濃度的增加，固氮菌的生長量也逐漸增加，在NO3-濃度為6 mmol·L-1時，菌株7D的生長量達到最大，與其它濃度間差異顯著(P<0.05)。而菌株BM13隨著NO3-濃度的增加，生長量也不斷增加，當NO3-濃度為10 mmol·L-1時，生長量最大，但與8 mmol·L-1處理間差異不顯著(P>0.05),表明NO3-能促進菌株BM13的生長。

隨著NH4+濃度的增加，兩種菌株生長量呈先增后減的趨勢(圖5)。菌株7D最適NH4+濃度為4 mmol·L-1，NH4+濃度在4～10 mmol·L-1范圍內(nèi)，菌株生長量無顯著變化(P>0.05)。而BM13最適NH4+濃度為2 mmol·L-1，當NH4+濃度超過2 mmol·L-1時，菌株生長量隨著NH4+濃度增加而出現(xiàn)輕微下降，但無顯著差異(P>0.05)。說明高濃度NH4+可能會不同程度地抑制固氮菌的生長。

總體而言，NO3-在促進菌株7D和BM13的生長方面比NH4+更明顯，但是氮源的濃度與菌株固氮酶活性之間的關(guān)系還有待研究。

2.5不同碳源對固氮菌生長的影響

碳源是微生物生長不可缺少的物質(zhì)，碳源能為固氮菌進行固氮作用提供能量來源，但固氮菌利用碳源的能力有所差異。菌株7D和BM13在檸檬酸和蘋果酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上基本不生長(圖6)，說明這兩株固氮菌利用檸檬酸和蘋果酸的能力很低。除檸檬酸和蘋果酸外，菌株7D可利用其它幾種碳源，且不同碳源間無顯著差異(P>0.05)。菌株BM13在蔗糖、甘油和麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上生長良好，生長量顯著高于以甘露醇和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基(P<0.05)，且菌株BM13利用蔗糖、甘油和麥芽糖的能力大于菌株7D。而菌株7D則能更好地利用甘露醇和葡萄糖。在這7種碳源中菌株BM13在甘油中生長量最大，而菌株7D在麥芽糖中生長最好。

圖4　不同NO3-濃度對固氮菌7D和BM13生長影

圖5　不同NH4+濃度對固氮菌7D和BM13生長的影響

圖6　不同碳源對固氮菌7D和BM13生長的影響

3討論與結(jié)論

植物內(nèi)生固氮菌的應(yīng)用和發(fā)揮固氮作用除了受寄主植物品種、菌系影響外，還與生態(tài)環(huán)境條件有密切關(guān)系[16]。溫度是影響固氮菌生長和存活最重要的因素。根據(jù)以往的研究報道，一般固氮菌菌株的生長適宜溫度范圍在20～30 ℃[17]。本研究顯示，固氮菌7D和BM13在25 ℃左右的溫度下生長量最大，與前人的研究結(jié)果一致[18]。當溫度低于15 ℃時，固氮菌生長、繁殖緩慢，酶活性較低。當培養(yǎng)溫度高于15 ℃時，固氮菌酶活性逐漸升高，能利用培養(yǎng)基中更多的營養(yǎng)物質(zhì)，加快繁殖速率，生長量大幅增加。但溫度超過35 ℃時，固氮酶活性受到抑制，酶促反應(yīng)變慢，可利用的營養(yǎng)物質(zhì)減少，部分固氮菌可能死亡，生長量逐漸降低。

pH過高或過低都不利于固氮菌的生長，從pH影響研究結(jié)果來看，兩株內(nèi)生固氮菌對酸堿度的適應(yīng)范圍較廣，在試驗設(shè)定的pH范圍內(nèi)均能生長。pH為中性或略微偏堿的條件下生長最好。這說明固氮菌能通過自身代謝分泌物對周圍環(huán)境酸堿度進行調(diào)節(jié)，進而找到適宜生長的pH范圍[19]。7D在中性條件下生長量達到最大，BM13在堿性條件下生長良好，說明BM13比7D更能適應(yīng)鹽堿性的土壤，這為菌肥的開發(fā)提供了有利條件。

NaCl在維持細胞滲透壓方面起著重要作用。一般認為，NaCl通過調(diào)節(jié)細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性來平衡細胞內(nèi)外的滲透壓[20]。滲透壓影響固氮菌生長的機理較復(fù)雜，目前國內(nèi)對其研究較少。研究結(jié)果表明，兩株固氮菌都耐較高的滲透壓。據(jù)報道，在高NaCl濃度下，菌株細胞會發(fā)生質(zhì)壁分離，細胞脫水死亡，活菌數(shù)下降[21]。7D比BM13具有更高的耐鹽能力和更寬的耐高鹽的范圍。

固氮菌主要吸收NH4+和NO3-兩種形態(tài)氮素，固氮菌對不同氮源的吸收利用有所差異。從本研究結(jié)果來看, 低濃度的NH4+和NO3-會促進固氮菌的生長，高濃度的NH4+和NO3-會抑制固氮菌的生長，而且NH4+下培養(yǎng)的固氮菌生長量高于NO3-下培養(yǎng)。此結(jié)果與Andre等[22]的報道一致，即內(nèi)生固氮菌隨著培養(yǎng)基中氮元素含量的增加，其生長被抑制得越來越嚴重。同時有研究也表明NH4+和NO3-均不同程度地抑制固氮酶活性，但NO3-對固氮菌的抑制作用明顯高于NH4+[23-24]。

碳源能提供固氮菌生長所需要的能量，也是構(gòu)成固氮菌細胞碳架的物質(zhì)之一。本研究中，兩株固氮菌在以蔗糖和葡萄糖、甘露醇、甘油、麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上生長較好，而在檸檬酸和蘋果酸為碳源的培養(yǎng)基上均不能生長，說明菌株在生長過程中有機酸不是最主要的碳源。對羊草(Leymuschinensis)和小麥(Triticumaestivum)根際固氮菌的研究中發(fā)現(xiàn)，最佳碳源為蔗糖，而在檸檬酸培養(yǎng)基上同樣不能正常生長[25-26]。陳倩等[27]對固氮菌Paenibacillus的研究表明，在甘油和蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長良好，在以檸檬酸和蘋果酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上基本不生長。從成本來看，蔗糖的價格較低，容易獲取，因此，蔗糖是固氮菌體系最好的碳源。

本研究從狗牙根中分離的內(nèi)生固氮菌對溫度的適應(yīng)范圍較廣，對高溫的忍耐能力高于對低溫的忍耐能力，這表明菌株的固氮活性可能與菌株生長的熱帶環(huán)境以及菌株分離的季節(jié)相關(guān)。本研究所用菌株是在廣州春季草坪剛返青時分離得到的，所以菌株的最適生長溫度在20 ℃左右。此外，固氮菌株酸堿適應(yīng)范圍寬，有一定的耐鹽耐高氮能力，表現(xiàn)出對環(huán)境因子的良好適應(yīng)性。對狗牙根內(nèi)生固氮菌株的最適生長條件進行測定和分析，可以為后續(xù)確定最佳發(fā)酵條件和生態(tài)適應(yīng)性評價以及在熱帶、亞熱帶地區(qū)地生產(chǎn)利用提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯王芳)

Growth conditions of endophytic diazotroph isolated fromCynodondactylon

Liu Tian-zeng, Mao Zhong-wei, Zhang Ju-ming

(College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University，Guangdong Engineering Research Center of Grassland Science, Guangzhou 510642, China)

Abstract:Effects of environmental factors on the growth of endophytic diazotroph strains 7D and BM13 isolated from Cynodon dactylon were investigated in our experiment. In this study, strains 7D and BM13 were examined for their adaptability to the stress of temperature, pH, NaCl, NH4+, NO3- and carbon sources by Ashby media. The results showed that the two strains could grow under wide range of temperature of 10～40 ℃ and pH from 3.92～9.64. The strains could also tolerate NaCl concentrations of 30 g·L-1, NH4+ and NO3- concentrations of 0～10 mmol·L-1, respectively. The strains were capable of using various carbon sources. It was suggested that the strains 7D and BM13 had superior tolerance to stress of diverse environment factors, but their tolerance abilities differed partly. Endophytic diazotroph strain is a candidate to be further developed for microbial fertilizer production.

Key words:endophytic diazotroph; growth condition; biological nitrogen fixation

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0706

*收稿日期：2015-12-12

基金項目：廣東省自然科學(xué)基金(2015A030310200)；廣東省科技計劃項目(2012B020302002)

通信作者：張巨明(1963-)，男，甘肅景泰人，副研究員，博士，主要從事草坪與草地生態(tài)研究。E-mail：jimmzh@scau.edu.cn

中圖分類號：S543+.9;S154.38+1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-0629(2016)5-0835-08*1

Corresponding author:Zhang Ju-mingE-mail：jimmzh@scau.edu.cn

劉天增，毛中偉，張巨明.狗牙根內(nèi)生固氮菌生長條件.草業(yè)科學(xué),2016,33(5)：835-842.

Liu T Z,Mao Z W,Zhang J M.Growth conditions of endophytic diazotroph isolated fromCynodondactylon.Pratacultural Science，2016,33(5)：835-842.

接受日期：2016-03-14

第一作者：劉天增(1984-)，男，甘肅永昌人，講師，博士，主要從事草地病理學(xué)研究。E-mail：liutianzeng@scau.edu.cn