張英+蘆光新+劉育紅+李淑娟+謝永麗+徐志偉

摘要：溶磷菌能增加土壤中磷元素的有效性，提高植物對(duì)磷素的利用率。本研究采用蒙金娜有機(jī)磷和PKO無機(jī)磷固體培養(yǎng)基，對(duì)高寒牧草燕麥（Avena sterilis）、披堿草（Elymus dahuricus）根際分離的14株溶磷菌進(jìn)行平板培養(yǎng)，在觀察菌落形態(tài)特征的基礎(chǔ)上，采用溶磷圈對(duì)菌株的溶磷能力進(jìn)行了動(dòng)態(tài)測(cè)定。結(jié)果表明，供試菌株大部分顏色為灰白色和淡黃色，菌落中間突起，表面濕潤(rùn)圓滑，生長(zhǎng)速度中等。培養(yǎng)期間，供試菌株對(duì)有機(jī)磷的溶磷能力隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加呈現(xiàn)出先增加后減少再增加的變化趨勢(shì)，供試菌株對(duì)無機(jī)磷的溶解能力隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加逐漸增加。其中，菌株P(guān)YXP4、PYXP5、PYXP16、PYXP21、PYXY1具有較強(qiáng)的溶解有機(jī)磷的能力，菌株P(guān)WXP3、PWXP9、PWXP18具有較強(qiáng)的溶解無機(jī)磷的能力，這些菌株具有開發(fā)溶磷菌肥的潛力，其他特性有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：高寒牧草；根際；溶磷菌；溶磷能力；有機(jī)磷；無機(jī)磷；動(dòng)態(tài)測(cè)定

中圖分類號(hào)：S154.39

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0490-03

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素之一，也是植物的重要組成成分。植物所需的磷素主要來源于土壤中的有效磷，而磷元素主要以難溶態(tài)磷的形式存在于土壤中[1]，土壤中95% 以上的磷為無效磷[2]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中，施入土壤的磷肥80%～95%會(huì)被土壤吸附固定，通過物理吸附、化學(xué)吸附、陰陽離子交換、表面沉淀、獨(dú)立固相沉淀等途徑轉(zhuǎn)化為無機(jī)態(tài)磷，植物難以吸收利用[3-5]。故世界上絕大部分農(nóng)業(yè)土壤缺磷（ 總磷不缺，缺少活性磷），我國(guó)土壤缺磷的面積較大，74% 的耕地土壤缺磷，施入的磷肥當(dāng)季利用率為5%～25%，據(jù)估計(jì)約占總耕地面積的2/3[6]。所以，如何提高磷肥的使用效率，有效利用土壤中被固定的無效態(tài)磷，對(duì)減少農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中磷肥的使用和磷礦資源的消耗有著重要的意義。以往的研究表明，土壤中有許多微生物具有不同程度的將難溶磷轉(zhuǎn)化為有效磷的能力，這類微生物被稱為溶磷菌，它們能夠依靠自身的代謝產(chǎn)物或與其他生物協(xié)同溶解土壤中的難溶性磷素，提高土壤中磷素的利用效率，是解決土壤磷素缺乏的重要途徑之一[7]。目前，很多研究者篩選到多種溶磷細(xì)菌和真菌，但菌株的活性差異較大，了解溶磷菌溶磷能力的動(dòng)態(tài)變化對(duì)溶磷菌的篩選和溶磷機(jī)理的研究有著重要的意義[8]，目前還未見到該方面的研究報(bào)道。本研究就分離自高寒牧草根際的溶磷菌為研究對(duì)象，在觀察菌株生物學(xué)特性的同時(shí)，主要對(duì)菌株的溶磷動(dòng)態(tài)進(jìn)行測(cè)定，掌握溶磷菌的溶磷能力隨時(shí)間的變化特征，對(duì)溶磷菌株的篩選、開發(fā)及研制生物菌肥提供理論依據(jù)和菌株資源。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株分離自西藏阿里高寒地區(qū)優(yōu)良牧草燕麥（Avena sterilis）、披堿草（Elymus dahuricus）根際的14株生長(zhǎng)快、功能優(yōu)良的溶磷菌（表1）。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基為Pikovaskaias（PKO）無機(jī)磷培養(yǎng)基[9]，蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基[10]，LB固體培養(yǎng)基[11]。（1）PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基：Ca3（PO4）2 3.0 g， 蔗糖 10.0 g，NaCl 0.5g，（NH4）2SO4 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.1 g， KCl 0.2 g，MnSO4 trace（stock=0.004 g/L）， Agar 15.0 g，蒸餾水1 000 mL，酵母膏0.5 g，F(xiàn)eSO4 trace（stock=0.004 g/L），pH值7.0；（2）蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g， （NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g， KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g， MnSO4·4H2O 0.03 g，卵磷脂 0.2 g， CaCO3 5.0 g，酵母膏04 g， 瓊脂 20.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0；（3）LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g，總體積1 000 mL（蒸餾水補(bǔ)足），pH值7.0。

1.3 測(cè)定方法

將LB斜面培養(yǎng)基中保存的菌株在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行活化后點(diǎn)接于PKO無機(jī)磷及蒙金娜有機(jī)磷平板上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至6 d時(shí)觀察待測(cè)菌株的形態(tài)特征，同時(shí)分別于培養(yǎng)3、 5、7、9、11 d時(shí)測(cè)量菌落直徑（d）和其形成的溶磷圈直徑（D），根據(jù)菌株相應(yīng)的D值和d值的比值初步確定該菌株溶磷能力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株活化及形態(tài)特征的觀察

將保存在LB斜面培養(yǎng)基上的供試溶磷菌株在LB平板培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，并在PKO無機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d，觀察并記錄菌落形態(tài)特征（表2）。結(jié)果表明，供試菌株大部分顏色為灰白色和淡黃色，菌落中間突起，表面濕潤(rùn)圓滑，生長(zhǎng)速度中等。

2.2 菌株溶磷能力的動(dòng)態(tài)測(cè)定

2.2.1 有機(jī)磷培養(yǎng)基上溶磷能力的動(dòng)態(tài)測(cè)定 對(duì)溶磷菌株經(jīng)蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基培養(yǎng)3、5、7、9、11 d 時(shí)分別測(cè)定相應(yīng)的菌落直徑（d）和溶磷圈直徑（D）（圖1）。結(jié)果表明，供試菌株在蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)期間，除了PYXP7和PYXY13菌株外，大部分菌株隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加溶磷能力呈現(xiàn)出先增加后減少再增加的變化趨勢(shì)。其中，PYXP21在培養(yǎng)期間，除了培養(yǎng)9 d之外均表現(xiàn)出最強(qiáng)的溶磷能力。在培養(yǎng)3 d時(shí)溶磷能力較強(qiáng)的PYXY13菌株，到5 d以后溶磷能力一直最小。培養(yǎng)3 d時(shí)菌株P(guān)YXP7和PYXY13溶磷能力顯著高于PYXY1菌株，而PYXY1菌株在培養(yǎng)11 d時(shí)的溶磷能力卻顯著高于PYXP7和PYXY13菌株。所以，溶磷菌在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基培養(yǎng)的不同時(shí)間所表現(xiàn)的溶磷能力不同，并且差異顯著。

2.2.2 無機(jī)磷培養(yǎng)基上溶磷能力的動(dòng)態(tài)測(cè)定 對(duì)溶磷菌株經(jīng)PKO無機(jī)磷固體培養(yǎng)基培養(yǎng)3、5、7、9、11 d時(shí)分別測(cè)定相應(yīng)的菌落直徑（d）和溶磷圈直徑（D）（圖2）。結(jié)果表明，供試菌株在PKO無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加溶磷能力逐漸增加，到11 d時(shí)，PWXP18表現(xiàn)出最強(qiáng)的溶磷能力，PWXP25的溶磷能力最低。在培養(yǎng)期間，菌株P(guān)WXP9和PWXP18的溶磷能力變化幅度最大，顯著超過了培養(yǎng)初期時(shí)溶磷能力較強(qiáng)的各菌株，在培養(yǎng)9 d以后溶磷能力又各不相同，菌株P(guān)WXP18溶磷能力繼續(xù)增大，而PWXP9溶磷能力表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。溶磷菌在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基培養(yǎng)的不同時(shí)間所表現(xiàn)的溶磷能力的動(dòng)態(tài)變化特征也不同，并且差異也比較顯著。

3 討論

自Staltrom等發(fā)現(xiàn)并報(bào)道溶磷菌[12]以來，很多的學(xué)者對(duì)溶磷菌進(jìn)行了廣泛的研究，取得了很多成果。Sachett等從土壤中篩選到36株能形成肉眼可見溶磷圈的細(xì)菌[13]。Kelly等研究了硝化細(xì)菌對(duì)磷酸三鈣的溶解能力[14]。陳廷偉等從小麥根際土壤中分離到產(chǎn)酸桿菌（Bacillus sp.），經(jīng)測(cè)定具有較強(qiáng)的溶解磷酸三鈣的能力[15]。姚拓等從小麥、燕麥、三葉草、苜蓿、垂穗披堿草、青稞等根際分離獲得了高效溶磷菌株（Azotobacter、Azospirillus、Pseudomonas、Zoogloea）等，對(duì)各菌株的溶磷能力、培養(yǎng)特性、菌株分泌IAA、菌株的抗病特性等方面做了大量的研究工作，各菌株不但具有溶解無機(jī)磷能力，同時(shí)還具有分泌植物生長(zhǎng)素、固氮特性和良好的促生效能，不同菌株的溶磷能力存在差異[16-23]。孫珊等研究發(fā)現(xiàn)，溶磷菌株GJT-1能溶磷磷酸三鈣、磷酸鐵和磷酸鋁，對(duì)開陽磷礦粉和宜昌磷礦粉的溶磷量為194.25 mg/L和120.59 mg/L[24]。辛楨凱等研究了溶磷菌的溶磷能力，菌株XH1和XH2溶解磷酸鈣的能力很強(qiáng)，液培 7 d 時(shí)溶磷量為267.08 mg/L和 415.69 mg/L[25]。本研究結(jié)果表明，不同菌株的溶磷能力不同，差異顯著，與以往各位學(xué)者的研究結(jié)果相一致。但本研究結(jié)果也表明，不同菌株在培養(yǎng)的不同時(shí)間所表現(xiàn)的溶磷能力及變化趨勢(shì)和變化幅度也各不相同，而且差異比較顯著。在菌株培養(yǎng)的不同時(shí)間，篩選溶磷能力強(qiáng)的菌株結(jié)果可能不同，這可能會(huì)影響優(yōu)良菌株的篩選。目前，很多學(xué)者采用溶磷圈法篩選功能優(yōu)良的溶磷菌株，培養(yǎng)的時(shí)間也各不相同，培養(yǎng)的時(shí)間對(duì)優(yōu)良菌株的篩選有著重要的影響，所以，如何去確定菌株篩選時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間還須開展進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究供試的14株溶磷菌株在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d，顏色為灰白色和淡黃色，大部分菌落中間突起，表面濕潤(rùn)圓滑，生長(zhǎng)速度中等。從培養(yǎng)的動(dòng)態(tài)變化過程分析，菌株P(guān)YXP4、PYXP5、PYXP16、PYXP21、PYXY1具有較強(qiáng)的溶解有機(jī)磷的能力，菌株P(guān)WXP3、PWXP9、PWXP18具有較強(qiáng)的溶解無機(jī)磷的能力，這些菌株具有開發(fā)溶磷菌肥的潛力，其他特性有待進(jìn)一步研究。不同菌株在培養(yǎng)的不同時(shí)間所表現(xiàn)的溶磷能力及變化趨勢(shì)和變化幅度也各不相同，而且差異比較顯著，為了篩選優(yōu)良的溶磷菌株，如何去確定菌株篩選時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間還須開展進(jìn)一步研究。

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