楊柳依，趙榮秋，劉樂承

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州434025)

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擬南芥eceriferm突變體對表皮蠟質(zhì)合成影響的研究進(jìn)展

楊柳依，趙榮秋，劉樂承

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州434025)

[摘要]植物表皮蠟質(zhì)是覆蓋在所有陸生植物地上大部分器官表面的一層疏水屏障，它對植物的生長發(fā)育以及保護(hù)植物免受生物或非生物危害具有重要的作用。綜述了模式植物擬南芥中不同的eceriferm突變體對超長鏈脂肪酸(VLCFAs)合成、初級(jí)醇途徑和烷烴途徑中蠟質(zhì)合成及成分影響的最新研究進(jìn)展，并闡述了其中尚不明確的地方以及研究前景。

[關(guān)鍵詞]蠟質(zhì)合成；擬南芥；VLCFAs；初級(jí)醇途徑；烷烴途徑

植物表皮蠟質(zhì)是所有陸生植物地上大部分器官表面的一層疏水屏障，具有阻止植物非氣孔性失水、維持植物表面清潔及保護(hù)植物免受生物或非生物危害的作用[1]。植物表皮蠟質(zhì)由各種脂類化合物組成，組成成分復(fù)雜，并且因植物種類的不同而存在差異。目前已鑒定出的植物表皮蠟質(zhì)組分有100多種，主要由超長鏈脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFAs)及其衍生物組成，此外還包括萜類和其他微量的次級(jí)代謝物如固醇和類黃酮類物質(zhì)。VLCFAs的衍生物一般包括C20～C34的脂肪族化合物，如烷烴、酮、醛、蠟酯、初級(jí)醇、次級(jí)醇及脂肪酸等[2，3]。

植物表皮蠟質(zhì)合成是在植物表皮細(xì)胞的不同細(xì)胞器中進(jìn)行的一個(gè)復(fù)雜過程，該過程由多酶復(fù)合體參與[4]。擬南芥是分析表皮蠟質(zhì)合成的遺傳組分方面很好的模式植物，目前其表皮蠟質(zhì)合成生物代謝途徑最為清楚[5]。通過篩選突變表型、甲基硫酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)誘變處理及T-DNA插入突變等方法，人們獲得了許多擬南芥蠟的eceriferm突變體[6～9]。

在植物表皮細(xì)胞內(nèi)，蠟質(zhì)的直接前體物質(zhì)VLCFAs的合成在質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分2步進(jìn)行；而蠟質(zhì)的合成發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，有初級(jí)醇途徑(primary alcohol pathway)和烷烴途徑(alkane-forming pathway)，它們分別主要負(fù)責(zé)偶數(shù)和奇數(shù)碳原子數(shù)蠟質(zhì)的合成[1]。筆者綜述了在VLCFAs合成、初級(jí)醇途徑和烷烴途徑中，擬南芥不同的eceriferm突變體對植物表皮蠟質(zhì)合成及其組分影響的研究進(jìn)展，并討論了其中尚不明確的問題，還對未來的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1擬南芥eceriferm突變體對VLCFAs合成的影響

1.1超長鏈脂肪酸(VLCFAs)的合成

植物表皮蠟質(zhì)的直接前體物質(zhì)VLCFAs的合成分2步在表皮細(xì)胞的不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中進(jìn)行。第一步在質(zhì)體內(nèi)，乙酰輔酶A(C2-CoA)在脂肪酸合成酶復(fù)合物(fatty acid synthase complex,FAS)的催化下，經(jīng)過多個(gè)循環(huán)反應(yīng)，?；溠由斐蒀16或C18?；?ACP；再由?；?ACP硫解酶(acyl-ACP thioesterase,FATB)催化形成自由的C16或C18脂肪酸，然后由長鏈?；o酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase,LACS)催化形成相應(yīng)的酰基輔酶A，再轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)。第二步在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，自由的C16或C18脂肪酸與酰基供體丙二酰輔酶A一起，在脂肪酸延伸酶(multienzyme fattyacid elongase,FAE)復(fù)合體的催化下，經(jīng)過多個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最終形成具有足夠碳鏈長度(C20～C34)的VLCFAs[2]。

此外，由FAE復(fù)合體催化的循環(huán)反應(yīng)包括4種酶，分別是β-酮脂酰輔酶A合成酶(β-ketoacyl-CoA synthase,KCS)、β-酮?；o酶A還原酶(β-ketoacyl-CoA reductase,KCR)、β-羥?；o酶A水解酶(β-hydroxyacyl-CoA dehydratase,HCD)和烯?；o酶A還原酶(enoyl-CoA reductase，ECR)。其中，KCR、HCD和ECR被認(rèn)為是所有微粒體脂肪酸延長酶所共有的，沒有底物特異性；而KCS有嚴(yán)格的底物特異性，其類型決定反應(yīng)速度和?；湹拈L度，是延伸反應(yīng)的限速酶[10，11]。目前，在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了ELO和FAE1 2種類型的KCS[12～14]，而擬南芥中則發(fā)現(xiàn)了4個(gè)ELO類型和21個(gè)FAE1類型的KCS，其中21個(gè)擬南芥基因組的KCS基因已經(jīng)被注釋[15，16]。

1.2擬南芥eceriferm突變體影響VLCFAs合成

擬南芥的CUT1/CER6基因是延長C24超長鏈脂肪酸所必須的，編碼一種FAE1類型的KCS。在擬南芥cer6突變體中，CUT1/CER6基因表達(dá)被抑制，C24的長鏈脂類大量積累，導(dǎo)致莖和角果的蠟質(zhì)嚴(yán)重缺失且條件雄性不育[17]。

在擬南芥的cer2突變體中，超過C28的蠟質(zhì)組分大大減少而≤C28的蠟質(zhì)組分過量積累，暗示cer2是延伸酶的組成成分，主要負(fù)責(zé)28碳VLCFAs的延伸[18]。然而，cer2與任何已知的延伸酶沒有序列相似性，表明cer2可能對后來延伸反應(yīng)中特異性延伸酶系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用[19]。但是，最近的研究表明，cer2位于擬南芥幼莖表皮細(xì)胞的ER中，而這里正是VLCFAs合成的地方，從而支持了其是延伸酶復(fù)合物的組成成分這一假說[20]。CER2的基因家族包括CER2、CER2-like、CER26和CER26-like，它們均有酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，但存在組織和器官的特異性表達(dá)差異[9]。如，CER2基因能在擬南芥的所有地上部器官中表達(dá)，但是cer2突變體對葉的蠟質(zhì)組分沒有影響；然而CER26基因卻在葉中表達(dá)，且與CER2存在功能重疊[9，21，22]。當(dāng)CER26在轉(zhuǎn)基因植物中異位表達(dá)時(shí)，能促進(jìn)C30或更長鏈的VLCFAs的合成，具有很高的組織和底物特異性。擬南芥的cer2和cer26突變體分別影響了超過C28和超過C30蠟質(zhì)組分的合成，此外，在通過T-DNA插入突變的方法獲得的cer2cer26雙突變體中，超過C26的VLCFAs延伸受阻[9]。

擬南芥cer19突變體與cer2突變體在功能上具有相似性：超過C28的蠟質(zhì)組分含量其顯著減少且≤C28的蠟質(zhì)組分過量積累。然而，cer19不是葉所特有的，因?yàn)樵谌~中超過C28的蠟質(zhì)組分含量減少的同時(shí)，C28或C27等≤C28的蠟質(zhì)組分沒有明顯增加[23]。

擬南芥的單拷貝基因ECR編碼一種烯?；o酶A，后來被證明是CER10，也是酵母TSC13 ECR的唯一同源基因[24，25]。對擬南芥cer10突變體的功能分析表明，所有包含VLCFAs的蠟質(zhì)合成都需要CER10的參與。但是，與野生類型相比，cer10突變體仍然具有40%的蠟質(zhì)含量以及一些用于合成種子甘油三酯和鞘酯的VLCFAs。這些表明，CER10不是擬南芥所必須的，其功能也許可以被其他的酶替代。

2擬南芥eceriferm突變體對初級(jí)醇途徑中蠟質(zhì)組分的影響

2.1初級(jí)醇途徑

植物表皮蠟質(zhì)中的初級(jí)醇是由VLCFAs經(jīng)過還原反應(yīng)產(chǎn)生的。目前，該反應(yīng)的過程還不完全清楚，但存在2種觀點(diǎn)：一種是VLCFAs首先應(yīng)還原成醛，然后再還原成初級(jí)醇，表明存在2個(gè)連續(xù)的還原反應(yīng)，如從甘藍(lán)中分離出在VLCFAs合成初級(jí)醇過程中的中間產(chǎn)物醛[26]；另一種是VLCFAs可以被直接還原成初級(jí)醇，如在加州希蒙得木胚芽和豌豆葉片中?；o酶A被脂肪?；€原酶(fatty acyl reductase,FAR)直接還原成初級(jí)醇[27，28]。

研究表明，擬南芥中存在著參與初級(jí)醇合成的類似FAR，它通過直接還原途徑獲得初級(jí)醇[29]。隨后，在蠟質(zhì)合成酶/甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶(wax synthase/diacylglycerol acyltransferase,WS/DGAT)的催化下，初級(jí)醇與飽和脂肪酸縮合形成烷基酯(alkyl esters)。該途徑一般形成?；滈L度為偶數(shù)碳原子數(shù)的蠟質(zhì)成分，主要包括以自由體形式存在的C26、C28、C30和C32初級(jí)醇和C38～C52烷基酯[30，31]。

2.2初級(jí)醇途徑中不同的擬南芥eceriferm突變體

擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)編碼類似FAR蛋白的基因，其中CER4已經(jīng)被克隆。在野生擬南芥蠟質(zhì)組分中，自由醇的積累是由CER4編碼的脂酰還原酶催化形成的，所形成的C24～C28的自由醇還可以作為底物進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，包括烷基酯的形成[29]。Lai等[31]也得到了相同的結(jié)論，但他們指出，酯合成酶必須與cer4共同位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上或者阻斷醇在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸或向質(zhì)膜運(yùn)輸，烷基酯才能形成。并且，在擬南芥cer4突變體中，葉表皮蠟質(zhì)組分中的初級(jí)醇和烷基酯的成分明顯減少，也證明了上述觀點(diǎn)[19]。此外，擬南芥的cer24突變體莖中C28和C30初級(jí)醇的含量明顯下降，但cer23突變體莖中C28初級(jí)醇積累[8]。

在擬南芥花莖中，被鑒別的烷基酯的碳鏈長度在C38到C52之間。烷基酯的含量，野生型為0.15 μg·cm-2，cer2突變體最高為1.20 μg·cm-2。野生型中烷基酯主要為C42、C44、C46，在cer2和cer6突變體中C42占優(yōu)勢，而在cer3和cer23突變體中C44占優(yōu)勢。在擬南芥的野生類型和所有突變類型中，烷基酯的形成受C16脂肪酸的?；鶊F(tuán)調(diào)控，被酯化的醇的?；滈L度為C20到C32。野生型中，烷基酯最大的?；滈L度為C28醇；而在cer2、cer6和cer9突變體中，C26酯化醇大量積累，這與相應(yīng)的自由醇變化一致。此外，在cer1、cer3、cer10、cer13和cer22突變體中，C30酯化醇的量增加，僅有部分與相應(yīng)自由醇的變化一致。這些結(jié)果表明，底物的組成以及酯合成酶的特異性與烷基酯的形成有關(guān)[31]。

3擬南芥eceriferm突變體對烷烴途徑中蠟質(zhì)組分的影響

3.1烷烴途徑

在擬南芥表皮蠟質(zhì)合成過程中，雖然與初級(jí)醇途徑相關(guān)的酶已經(jīng)被確定，但催化烷烴形成的酶仍然是一個(gè)謎。目前，僅發(fā)現(xiàn)了與烷烴途徑有關(guān)的酶MAH1，它是一種細(xì)胞色素P4502D6依賴型的中鏈烷烴羥化酶(cytochrome P450-dependent midchain hydroxylase)，催化2個(gè)連續(xù)的反應(yīng)[32]。擬南芥的烷烴途徑中，VLCFAs被酶(該酶目前尚不明確)還原成醛；然后在醛脫羧酶(aldehyde decarbonylase,AD)的催化下，醛脫羧形成烷烴；烷烴經(jīng)中鏈烷烴羥化酶(mid-chain alkanehydroxylase,MAH1)催化形成二級(jí)醇；二級(jí)醇由MAH1催化形成酮。該途徑主要負(fù)責(zé)奇數(shù)碳原子數(shù)蠟質(zhì)的合成，并且合成的主要蠟質(zhì)成分為烷烴[33]。

許多研究表明，關(guān)于烷烴途徑的中心反應(yīng)，即碳鏈長度從偶數(shù)變?yōu)槠鏀?shù)的反應(yīng)，是?；绑w損失一個(gè)碳原子，而不是增加一個(gè)碳原子[23,34]。雖然這一觀點(diǎn)已經(jīng)被證明，但是碳原子損失的具體過程還不清楚。關(guān)于碳原子損失過程，許多假說被提出，但是迄今只有一個(gè)假說得到了一定程度的驗(yàn)證。該假說認(rèn)為，C-C鍵的斷裂是由一個(gè)脫羰反應(yīng)(損失一個(gè)CO分子)引起，該反應(yīng)還產(chǎn)生中間產(chǎn)物醛，因此烷烴途徑又被成為脫羰途徑[35]。

3.2烷烴途徑中不同的擬南芥eceriferm突變體

擬南芥的許多eceriferm突變體，如cer1、cer2、cer3、cer8、cer19和cer22，在莖的蠟質(zhì)組分中都表現(xiàn)出烷烴含量減少。目前，CER19和CER22基因沒有被克隆，有些基因(CER1、CER2和CER3)雖然已經(jīng)被克隆，但是它們編碼的蛋白質(zhì)的具體生化功能尚不明確[5,36]。

目前，擬南芥中CER8(LACS1)基因被證明能編碼一種長鏈酰基輔酶A合成酶，參與自由的長鏈脂肪酸到相應(yīng)的酰基輔酶A的形成。然而，擬南芥的cer8突變體在使C26～C30自由脂肪酸過量積累的同時(shí)，減少了烷烴途徑產(chǎn)物的形成[36]。這說明了烷烴的形成可能需要長鏈?；o酶A，但是原因尚不清楚。

擬南芥中CER13基因的產(chǎn)物能參與C30脂肪酸形成C30醛的過程，但并不影響C30初級(jí)醇的形成以及C30脂肪酸?；湹难由臁Ｔ赾er13突變體中，C30醛以及隨后反應(yīng)中的C29烷烴、二級(jí)醇、酮等含量減少，但是C30初級(jí)醇和C31烷烴含量卻增加，剛好與上述觀點(diǎn)一致[23]。此外，cer20突變體莖中，C29烷烴到C29二級(jí)醇的過程被中斷，導(dǎo)致C29烷烴積累，同時(shí)C29二級(jí)醇和C29酮含量減少，并且cer20突變體是唯一具有這種作用的eceriferm突變體[23]。

擬南芥中CER1和CER3基因均位于表皮光滑基因的上游，當(dāng)它們共同表達(dá)時(shí)，造成了表皮蠟質(zhì)的減少。此外，關(guān)于cer1和cer3突變體導(dǎo)致了烷烴、次級(jí)醇以及酮顯著減少的報(bào)道，證明了這些蛋白質(zhì)與烷烴的形成有關(guān)[6,19,34]。然而，cer1和cer3突變體的表型并不完全一致，cer3突變體在烷烴及其衍生物減少的同時(shí)，C30初級(jí)醇的含量增加；而cer1突變體則會(huì)使C30醛積累。這些結(jié)果表明了cer1在cer3的下游起作用，這一觀點(diǎn)也在Goodwin等的cer1cer3雙突變體分析中得到證明[37]。Bourdenx等[38]研究表明，cer3本身對于烷烴的形成不是必要的，但是其對于cer1在擬南芥中所起的作用是至關(guān)重要的。這證明了cer1是一種醛脫羧酶(AD)，并且cer3的作用是為cer1提供產(chǎn)生烷烴所需的醛或已知的代謝中間物。

然而，CER1的功能到目前為止還是未知的，部分是因?yàn)槿狈Ψ肿铀缴铣L鏈烷烴形成的激活信息以及其底物未知，而且超長鏈醛也是不容易獲得的。此外，當(dāng)CER1在異源性的系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，烷烴也不能形成[38]。因此，CER1的功能對于超長鏈烷烴的形成仍是一個(gè)有待研究的關(guān)鍵性問題。

到目前為止，研究發(fā)現(xiàn)的CER1的等位基因共有6個(gè)，分別為CER1-1(CS31)、CER1-2(BRL11)、CER1-3(CER1-m)、CER1-4(SALK_008544)、CER1-5(SALK_014839)和CER1-6(CER22)[39]。在擬南芥的cer22突變體中，C30醛形成C29烷烴的過程被阻止，導(dǎo)致C30醛積累；然而cer23突變體卻能促進(jìn)莖中C29烷烴向C29二級(jí)醇、C29酮的轉(zhuǎn)變[8]。在cer1N端結(jié)構(gòu)域中，一些保守的組氨酸是突變基因的直接位點(diǎn)，這些結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)對于cer1的激活是很關(guān)鍵的[40]。但是cer22的突變發(fā)生在C端結(jié)構(gòu)域中，它們是可溶的并且位于胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，決定cer1的功能。因此，cer22突變體對于未來探索烷烴形成過程中cer1結(jié)構(gòu)域中C端的生化功能是很有價(jià)值的[39]。

4展望

圖1　擬南芥不同的eceriferm突變體對植物表皮蠟質(zhì)合成過程的影響

表皮蠟質(zhì)不僅具有一些生理功能，如阻止植物非氣孔性失水、維持植物表面清潔與植物表面防水、抵御病蟲害、防止有害光線對植物的損傷等，而且對植物葉片和果實(shí)的形態(tài)發(fā)育和花粉發(fā)育也有重要影響，從而影響植物的育性[41]?；诒砥は炠|(zhì)功能的多樣性與重要性以及到目前為止最為清楚的擬南芥表皮蠟質(zhì)生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，筆者綜述了擬南芥不同的eceriferm突變體對植物表皮蠟質(zhì)合成及其組分影響的研究進(jìn)展，其中具體生化功能明確的突變體總結(jié)如下(圖1)。

由圖1可知，cer6、cer2cer6、cer2、cer19突變體分別影響了擬南芥莖中C24、C26、C28VLCFAs的延伸，而cer26則影響了葉中C30VLCFAs的延伸，并導(dǎo)致了相應(yīng)碳鏈長度的VLCFAs的積累。在擬南芥莖的初級(jí)醇途徑中，cer24突變體阻止了C28、C30初級(jí)醇的產(chǎn)生，而cer23卻促進(jìn)了C28初級(jí)醇的產(chǎn)生。在烷烴途徑中，cer13、cer1、cer22、cer20突變體分別阻止了莖中C30醛、C29烷烴、C29二級(jí)醇的產(chǎn)生，從而影響了烷烴途徑中相應(yīng)后續(xù)產(chǎn)物的含量；而cer23卻能促進(jìn)莖中C29烷烴到C29酮的過程。

植物地上部表皮蠟質(zhì)的合成是一個(gè)復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，由許多酶協(xié)同調(diào)節(jié)。從Koornneef等[6]通過觀察表型的改變發(fā)掘并篩選擬南芥突變體開始，到分子遺傳學(xué)方法的成功應(yīng)用，使得該網(wǎng)絡(luò)中許多酶的功能被成功地鑒定，有些基因也被克隆。目前，擬南芥的蠟質(zhì)合成代謝生物通路最為清楚，但也有許多不清楚的地方。這些地方包括：烷烴途徑的合成機(jī)理，尤其是該途徑中將VLCFAs還原成醛的酶尚不明確；雖然有些相關(guān)基因還沒被克隆，但被克隆的相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)具體生化功能不明確。

隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展以及先進(jìn)的研究方法和技術(shù)的應(yīng)用，使得第二代測序技術(shù)、酵母雙雜交、RNA干涉、基因芯片等廣泛應(yīng)用于植物表皮蠟質(zhì)生物合成以及調(diào)控過程的研究，包括突變體的獲得、相關(guān)基因的克隆及功能分析等，這為進(jìn)一步闡明植物表皮蠟質(zhì)生物合成與代謝調(diào)控機(jī)理打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2016-01-04

[基金項(xiàng)目]長江大學(xué)科研發(fā)展基金(8011900124、7011902102)。

[作者簡介]楊柳依(1992-)，女，碩士生，研究方向?yàn)閳@藝植物生物技術(shù)。通信作者：劉樂承，lchliu18@yangtzeu.edu.cn。

[中圖分類號(hào)]Q946.4

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-1409(2016)09-0053-06

[引著格式]楊柳依，趙榮秋，劉樂承.擬南芥eceriferm突變體對表皮蠟質(zhì)合成影響的研究進(jìn)展[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2016，13(9)：53～58.