李貴洪，譚　紅，梁發(fā)明，謝　勛

(1貴州大學，貴州　貴陽　550001；2.貴州省分析測試研究院，貴州　貴陽　550001)

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環(huán)境水體中類固醇激素的分析方法研究進展

李貴洪1，譚紅2，梁發(fā)明2，謝勛2

(1貴州大學，貴州貴陽550001；2.貴州省分析測試研究院，貴州貴陽550001)

摘要：類固醇激素是一類新型有機污染物，可通過食物鏈放大作用在生物和人體內(nèi)富集，從而干擾生物和人體正常的內(nèi)分泌機能，因此類固醇激素的研究已逐漸成為國際上環(huán)境和健康領域的研究熱點。對廢水中類固醇激素的前處理方法和儀器分析方法進行了綜述，主要包括樣品萃取、生物技術、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術和液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術。

關鍵詞：廢水；類固醇激素；分析方法；研究進展

類固醇激素(steroid hormone)是一類典型的內(nèi)分泌干擾物，因其在環(huán)境中普遍存在和較強的內(nèi)分泌干擾效應，已是繼臭氧層破壞和全球氣候變暖之后的第三大環(huán)境問題。類固醇激素在極低的劑量即可引起極強的內(nèi)分泌干擾效應[1]，它作為環(huán)境激素的重要成員一直以來都是學術界研究的熱點。它產(chǎn)生于20世紀30年代，人們采用人工合成的方法生產(chǎn)DES(乙烯雌酚)用作藥品以及紡織工業(yè)的洗滌和印染用劑，這種合成激素在誕生的同時就被指出有導致惡性腫瘤的危險。有研究結(jié)果表明類固醇雌激素在 ng / L 水平可誘導卵黃蛋白原生成、引起雄魚雌性化和哺乳動物生殖障礙以及免疫力低下等問題[2，3]。環(huán)境中危害較大、較為典型的類固醇類內(nèi)分泌干擾物有：雌酮(Estrone，E1)、雌二醇(Estradiol，E2)、雌三醇(Estriol，E3)、乙炔雌二醇(Ethynylestradiol，EE2)、孕酮(Progesterone，P)、睪酮(Testosterone，T)、甲睪酮(Methyltestosterone，MeT)、雄烯二酮(Androstenedione，ADD)、甲基炔諾酮(Norgestrel，Ng)等。這類物質(zhì)一旦進入環(huán)境，就會對生物體以及人類產(chǎn)生極大的危害。目前，國內(nèi)外研究了這類物質(zhì)在污水處理廠、地下水、河流、湖泊中的存在狀況[4-7]。但是由于環(huán)境水體中類固醇激素的濃度通常為ng / L或pg / L且基質(zhì)復雜，因此需要靈敏度高的分析方法和能達到富集、消除干擾基體的前處理技術。

1樣品萃取技術

樣品前處理有提取、凈化、濃縮等步驟，可以起到富集目標組分、消除或降低基體干擾、提高靈敏度的作用。樣品前處理操作過程是一個十分容易引入誤差且耗時的步驟，處理的好壞直接影響分析的最終結(jié)果，且樣品前處理這一步驟對環(huán)境造成的污染最大，因此改善和優(yōu)化樣品制備技術是一個關鍵問題。目前已有固相萃取、固相微萃取、液液微萃取等方法。

1.1固相萃取

固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE)是一種當下流行的用固態(tài)吸附劑凈化液體樣品的前處理方法。通常固相萃取小柱是用在樣品前處理過程中，以達到純化、富集和分離目標物的目的。常用的固體吸附劑有鍵和硅膠類(如十八烷基硅烷C18)、鍵和氧化物硅膠(氧化鋁修飾的硅膠)、有機聚合物系列(Oasis HLB、聚苯乙烯共聚物)等。目前廣泛使用的是Oasis HLB固相萃取柱，該柱子即使活化和上樣時抽干了，也能對目標物有保留，其對類固醇類激素的吸附容量很大，一般是硅膠柱的3倍，可用于非極性和極性組分的萃取，回收率可達67 %～109 %[8，9]。固相萃取使兩相分離更簡單、操作簡便、有機溶劑使用量少、樣品量不受限制、能夠自動化、回收率高、重現(xiàn)性好、凈化效果好且價格低廉等優(yōu)點，在環(huán)境水體中類固醇激素的分析過程得到了廣泛的運用。目前有離線固相萃取和在線固相萃取這兩種方式。離線SPE操作繁瑣，在預處理、上樣、洗脫、氮吹這些步驟會耗費大量時間且容易造成目標物的損失。在線SPE克服了離線SPE的缺點，但是該方式儀器要求高、建立方法耗時長。

1.2固相微萃

固相微萃取(Solid Phase Micro—Extraction，SPME)是加拿大Pawliszyn教授的研究小組于1989年為解決氣相色譜快速進樣問題而首次進行開發(fā)研究的一項樣品前處理技術[10]。該技術是在固相萃取的基礎上發(fā)展起來的，保留了固相萃取的全部優(yōu)點，掘棄了需要柱填充物和使用有機溶劑進行解析的缺點[11]。這種無溶劑技術允許集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，且操作簡單、快速、靈敏，適用于不揮發(fā)、半揮發(fā)和揮發(fā)性的化合物，因此這種方法被運用于富集環(huán)境水體中的類固醇激素，該方法的回收率在71 %～121 %之間[12，13]。但是SPME存在一些弊端：如使用時間有限，涂層纖維價格昂貴且選擇性差。為解決固相微萃的缺點，目前發(fā)展起來的有分子印跡涂層固相微萃(Molecularly imprinted polymers coatedSPME)、管內(nèi)固相微萃(In—tube SPME)、攪拌子吸附萃取(StirBarSorptiveExtraction，SBSE)等技術。但這些技術也存在不足之處：分子印跡涂層固相微萃由于穩(wěn)健性低每次需要新的MIP且操作難；管內(nèi)固相微萃由于毛細管容易堵塞，因此需要十分干凈的樣品；攪拌子的涂層聚二甲基硅氧烷是非極性，因此攪拌子吸附萃取只能運用于非極性和弱極性的化合物。

1.3液相微萃

液相微萃取(Liquid—phase microextraction，LPME)是20世紀90年代由Jeannot和Cantwell等最初報導的一種樣品前處理新技術，其基本原理是目標分析物在樣品與小體積有機萃取溶劑之間達到分配平衡，從而實現(xiàn)溶質(zhì)的微萃取[14]。LPME是在液液萃取技術的基礎上發(fā)展起來的，與液液萃取相比，它克服了操作技術繁瑣、污染大、有機溶劑使用量大等弊端，同時該技術集采樣、萃取、濃縮于一體，然后直接進樣到GC或HPLC進行分離分析。該技術是一項環(huán)境友好的樣品前處理新技術，特別適用于環(huán)境樣品中痕量級別污染物的測定。目前運用于類固醇激素的檢測有中空纖維液相微萃取(Hollow—fiber liquid—phase microextraction，HF—LPME)、單滴液相微萃取(Solid—drop microextraction，SD—LPME)，這些方法的回收率都在80 %～120 %之間[15，16]。HF—LPME技術的主要優(yōu)點是樣品可以攪拌或劇烈振動，提取液也不會有任何損失，但缺點在于膜需要預先處理且當膜重復利用時具有記憶效應。SD—LPME技術操作簡便、成本低廉、富集效果好，但主要缺點是提取溶劑的選擇有限且需要冷凍提取。

2檢測方法

2.1生物技術

目前，測定類固醇激素的生物技術有放射免疫法(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，雖然這兩種靈敏度比較高、速度快、所需樣品體積小，但是放射性免疫法容易受與類固醇激素具有類似結(jié)構(gòu)物質(zhì)的干擾；酶聯(lián)免疫法樣品制備復雜、影響因素多且一次只能分析一種物質(zhì)。Nelius Swart等[17]用酶聯(lián)免疫吸附法測定污水中雌酮、雌二醇、雌三醇的含量，樣品經(jīng)C18固相萃取柱凈化濃縮，該方法檢出限達到了0.2～5.0 ng / L，回收率在84 %～110 %之間，批間和批內(nèi)的準確率都在10 %內(nèi)。Shishida等[18]使用酶聯(lián)免疫的方法檢測工業(yè)試驗規(guī)模的污水處理廠出水中的雌二醇，方法的檢測限達到了10 ng / L。Tschmelak等[19]用選擇性的生物傳感器檢測雌酮，檢測限達到 1.4 ng / L。雖然有以上相關文獻報道，但是生物技術檢測污水中的類固醇激素還不夠完善。表1列出了一部分生物技術在檢測環(huán)境水體中類固醇激素的應用。

表1　生物技術在類固醇激素檢測中的應用

備注：E1：雌酮；E2：雌二醇；E3：雌三醇； EE2：乙炔雌二醇 Pro：孕激素；Tes：睪酮；Influent：污水處理廠進水；effluent：污水處理廠出水；potable water：飲用水；raw water：未處理過的水

2.2氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Gas Chromatography—Tandem Mass spectrometry，GC—MS / MS)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Gas Chromatography—Mass spectrometry，GC—MS)已經(jīng)發(fā)展成為一種成熟且涉及領域廣泛的分離檢測技術，該技術結(jié)合了氣相色譜分離效率高和質(zhì)譜定性能力強等優(yōu)點，因此具有靈敏度高、選擇性好、能效高、速度快等特點，已成為檢測類固醇激素的主要方法。但是類固醇激素目標物不容易揮發(fā)，因此樣品需要在氣相色譜-質(zhì)譜法分析前進行衍生化處理，將目標物轉(zhuǎn)化成易于分析檢測的化合物。樣品衍生化這一步驟使得前處理操作變得復雜，因此可能造成目標物損失且不同目標物的衍生的效率差別很大，這成為氣相色譜-質(zhì)譜測定類固醇類激素的弊端。Lihua Yang等[25]用氣相色譜質(zhì)譜法檢測廣東三角區(qū)河水中雌酮、雌二醇、睪酮的含量，前處理用全自動固相微萃和在纖維上衍生，檢測限在0.001～0.124 μg / L之間。Kolodziej等[26]使用氣質(zhì)聯(lián)用法檢測農(nóng)場附近地表水中的雌二醇、孕酮、雄烯二酮等類固醇激素化合物，檢測限在0.1～0.2 ng / L之間。過去的十多年中，應用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分離檢測類固醇激素的工作已經(jīng)取得良好的結(jié)果[27—30]。表2列出了一部分氣相色譜-質(zhì)譜法在檢測環(huán)境水體中類固醇激素的應用。

表2　氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法在類固醇激素檢測中的應用

備注：E1：雌酮；E2：雌二醇； EE2：乙炔雌二醇；DES：乙烯雌酚；Influent：污水處理廠進水；effluent：污水處理廠出水；Sewage water：污水。

2.3液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Liquid Chromatography—Tandem Mass spectrometry，LC—MS / MS)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(Liquid Chromatography—Mass spectrometry，LC—MS)對于高沸點、難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定化合物的分離和測定具有極大的優(yōu)勢而成為近年來發(fā)展很快的一種新的分析檢測技術。目前，隨著超高液相色譜技術和三重四級桿質(zhì)譜技術的發(fā)展，大幅度地改善了水體中痕量類固醇激素分析時的分離度、靈敏度和準確性，備受越來越多科研工作者的青睞[36]。Sara等[37]采用SPE—LC—ESI—MS / MS同時檢測河水及污水中的雌酮、雌二醇、雌三醇、乙炔雌二醇等物質(zhì)，該方法前處理時間僅需要1h，檢測限在0.02～1.02 ng / L之間，回收率在74 %之上，重現(xiàn)性在1.43 %～3.89 %之間。Qin等[38]通過親水性色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的方法檢測人體尿液中的雌激素，其檢出限為2～1 000 pg / L，回收率在92 %～109 %之間。Vulliet E等[39]采用SPE—LC—ESI—MS檢測了污水處理廠中類固醇激素的含量，在噴霧器壓力60 psi；干燥氣體N2溫度350 ℃；干燥氣體流量13 L / min；毛細管電壓5000 V；碰撞電壓75 V的條件下，該方法檢測雌激素的檢出限在0.9—4—3ng / L，雄激素和孕激素的檢測限為1ng / L。Will J.Backe[40]用液液萃取加衍生的方式檢測河水中5種雌激素，該方法僅僅用了7.5 ml的樣品檢出限就低至0.13 ng / L。在實際應用中，大部分科研工作者都使用ESI離子源接口，負離子狀態(tài)檢測雌激素，正離子檢測孕激素和雄激素。因為這幾類化合物的極性弱，比較難電離，靈敏度不是很好，在優(yōu)化各個條件時發(fā)現(xiàn)毛細管電壓、離子源溫度和去溶劑流速，對靈敏度都會有顯著的影響[41]。目前，由于LC—MS與LC—MS / MS價格高昂，其使用的廣泛性受到了一定限制。表3列出了一部分液相色譜—質(zhì)譜法在檢測環(huán)境水體中類固醇激素的應用。

表3　液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法在類固醇激素檢測中的應用

備注：E1：雌酮；E2：雌二醇； E3：雌三醇；EE2：乙炔雌二醇；Pro：孕激素；Tes：睪酮；PGT ：孕酮；MTA ：六甲強龍；PRE ：潑尼松；MET：安宮黃體酮；NT：諾龍；ADD：雄烯二酮；MTTR：甲基睪酮BET：倍他米松；glucocorticoids：糖皮質(zhì)激素；Influent：污水處理廠進水；effluent：污水處理廠出水；Sewage water：污水；Urine：尿液；Surface water：地表水

3結(jié)語

隨著樣品前處理技術、色譜、質(zhì)譜及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術的迅猛發(fā)展，科研工作者對類固醇激素在環(huán)境中的污染來源、污染特征、遷移規(guī)律、降解機理和在生物體內(nèi)的生物效應等方面的核心問題有了逐漸的了解。在痕量類固醇激素的檢測和分析過程中，樣品的前處理發(fā)揮著重要的作用。目前很難找到一個完善的方法從高度復雜的樣品基質(zhì)中萃取出類固醇激素目標物，因此樣品前處理過程仍然是類固醇激素分析的“瓶頸”步驟。建立高通量的樣品預處理技術，將會大大降低檢測和分析成本與時間，建立在線同時處理、分離和檢測類固醇激素的方法和技術，將是類固醇激素分析方法發(fā)展的一個趨勢。雖然國內(nèi)外都對一些水域中的類固醇類激素進行了檢測，但調(diào)查范圍十分有限，大多數(shù)集中在污水處理廠及受納水體和集約化養(yǎng)殖場，特別是我國目前缺少對該類物質(zhì)在全國水域范圍內(nèi)的全面調(diào)查，污染現(xiàn)狀及其變化趨勢還尚不清楚。

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投稿日期：2015-12-29；修回日期：2016-01-20

Progress of analysis method on steroid hormones in wastewater

LI Guihong1，TAN Hong2，LIANG Faming2，XIE Xun2

(1GuizhouUniversity，Guiyang550001，China；2GuizhouAcademyofanalysistest，Guiyang550001，China)

Abstract：Steroid hormone is a new type of organic pollutant，which can be enriched in biological and human body through the food chain，so as to interfere with the normal endocrine function of organism and human body.Therefore，the study on Steroid hormone has become an international research focus.The pretreatment method and instrumental analysis method on steroid hormone in wastewater were summarized，including sample extraction，biological technology，gas chromatography—mass spectrometry technology and liquid chromatography—mass spectrometry technology.

Keywords：wastewater；steroid hormone；analysis method；research progress

中圖分類號：X 830

文獻標識碼：A

文章編號：1003—6563(2016)02—0064—06

作者簡介：李貴洪(1993-)，女，四川南充人，碩士。研究方向：環(huán)境分析。