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生物樣本中的砷形態(tài)分析研究進展

2016-06-12 01:10林琳沈敏馬棟華東政法大學刑事司法學院上海0004司法部司法鑒定科學技術研究所上海市法醫(yī)學重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺上海00063
中國司法鑒定 2016年3期
關鍵詞:綜述

林琳,沈敏,馬棟(.華東政法大學刑事司法學院,上海0004;.司法部司法鑒定科學技術研究所上海市法醫(yī)學重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺,上海00063)

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生物樣本中的砷形態(tài)分析研究進展

林琳1,沈敏2,馬棟2
(1.華東政法大學刑事司法學院,上海200042;2.司法部司法鑒定科學技術研究所上海市法醫(yī)學重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺,上海200063)

摘要:不同形態(tài)的砷化合物毒性不同,以總砷為基礎的檢測及毒性評判方法已不能滿足科學發(fā)展的要求。不同形態(tài)的砷化合物的毒性、代謝機制、檢測技術等是當前國內外研究的熱點,涉及法醫(yī)毒物學、毒理學、環(huán)境保護、食品安全等領域。綜述生物樣品中砷形態(tài)分析的研究進展,包括生物樣品中砷形態(tài)化合物的分離、鑒別和檢測技術,以期推動探究生物體內砷形態(tài)的代謝機制和毒性作用,關注其在法醫(yī)毒物鑒定中的應用價值。

關鍵詞:砷形態(tài)化合物;砷形態(tài)分析;生物檢材;前處理技術;分析技術;綜述

砷及砷化合物自古以來是法醫(yī)毒物學的關注重點,中外歷史上不乏砷化物中毒致死的案例[1]。砷廣泛分布于自然界中,在自然界中的豐度排第二十位[2],長期暴露在砷環(huán)境下,可引起急、慢性砷中毒,嚴重時會導致基因突變、人體細胞癌變以及胎兒畸形。國際癌癥研究機構(LARC)、美國疾病控制中心(CDC)已經將砷確定為第一類致癌物質[3],砷同時也是全球重點監(jiān)測的30種污染物之一[4]。

自然界中砷以不同的化合價形態(tài)存在,不同形態(tài)的砷化物具有不同的物化性質與生物毒性。因此,傳統(tǒng)的總砷檢測技術已不能滿足鑒別砷形態(tài)化合物以及評估其毒性作用的要求,而砷的形態(tài)分析在法醫(yī)毒物學領域具有特別重要的意義。

1 砷形態(tài)化合物及其毒性評估

1.1藥理毒理

砷的存在形態(tài)總的來說可分為無機砷和有機砷,其毒性也各有差異。前者毒性比后者大,且無機砷中的三價砷的毒性是五價砷的60倍,是甲基砷(如一甲基砷酸和二甲基砷酸)毒性的70倍[6]。以砷化合物的小鼠半數(shù)致死量LD50計,其毒性順序為:AsH3、AsIII、AsV、一甲基胂酸(Monomethylarsonic Acid,MMA)、二甲基胂酸(Dimethylarsonic Acid,DMA)、三甲基胂氧(Trimethylarsine oxide,TMAO)、砷膽堿(Arsenocholine,AsC)、砷甜菜堿(Arsenobetaine,AsB)[7],后兩者通常被認為無毒[8]。砷與體內蛋白質和多種氨基酸具有很強的親和力,能與多種酶蛋白分子上的巰基或羥基結合,使酶失去活性,導致細胞內生物氧化過程發(fā)生障礙或使細胞分裂發(fā)生紊亂,嚴重時可使細胞死亡。砷可直接作用于神經系統(tǒng),麻痹延髓的血管舒縮中樞。砷還可直接損害毛細血管,使之麻痹擴張,通透性增加,導致血漿滲出,甚至紅細胞漏出現(xiàn)象。砷中毒時的胃腸炎癥狀是毛細血管極度擴張及受損的結果,砷中毒還可導致嚴重的嘔吐、腹瀉使水分及電解質大量丟失,引起脫水、酸中毒、低鉀及低鈉血癥。

1.2吸收、分布與代謝

砷化合物通過呼吸道、消化道和皮膚吸收進入人體,在人體產生蓄積。經肺和腸胃吸收的砷化合物經血流分布,儲存于腦、肝、心、脾、腎、胸腺、胰腺、前列腺、甲狀腺、主動脈、卵巢、子宮、腸壁、肌肉等全身各種組織中,其中以毛發(fā)、指甲、皮膚濃度最高[9]。

無機三價砷進入體內,主要是通過甲基化反應轉化為MMA、DMA等毒性較低的甲基化砷形態(tài)排出體內,其中主要排出形式為DMA占60%~80%,MMA占10%~20%,其余10%~30%直接以無機砷排出[9]。無機三價砷在人體內轉化,目前有氧化甲基化和還原甲基化兩種學說,氧化甲基化學說認為三價砷進入體內在甲基轉移酶的催化下,利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)作為甲基供體進行甲基化,轉換為MMA、DMA,并最終轉換為五價DMA排出體外[10]。而還原甲基化學說則認為三價砷與帶巰基化合物及蛋白質、酶或還原型谷胱甘肽(GSH)結合,再在甲基轉移酶和SAM作用下,進行還原甲基化代謝。同時砷-谷胱甘肽結合體arsenotriglutathione[iAsⅢ(GS)3]和單甲基砷酸-谷胱甘肽結合體monomethylarsenodiglutathione[MMAⅢ(GS)2]還可以被細胞膜轉運蛋白-多藥耐藥蛋白2/有機陰離子轉運蛋白(MRP2/cMOAT)排泄到膽汁來降低肝臟或器官中的砷濃度[10]。

砷的甲基化代謝水平與體內各形態(tài)砷的相對比例、砷排泄效率及其蓄積程度直接相關。砷的甲基化代謝主要在肝臟進行[11],人體排泄砷有以下幾種途徑:糞便排泄(900 μg/d);尿液排泄(50 μg/d);皮膚排泄等。生物樣品的砷化合物檢測對于中毒評價具有重要意義。人體在攝入砷后,血液中的半衰期十分短,大部分砷能在幾個小時內從血液中消除,血液中可檢測到無機砷、一甲基和二甲基砷化合物及砷膽堿。尿液的半衰期較血液長,約為4 d左右,主要有無機砷、五價一甲基砷和二甲基砷、三價一甲基砷和二甲基砷化合物,用無機砷和代謝產物甲基砷的總量,可對中毒狀況進行評估。砷化物可以與毛發(fā)和指甲中巰基結合而穩(wěn)定存在于毛發(fā)和指甲,其中以三價和五價無機砷為主要形態(tài),也有報道檢出其代謝物。頭發(fā)和指甲中的砷可指示過去的砷暴露的程度,時間的長短取決于頭發(fā)和指甲的生長速度[7]。因此,在司法實踐中,可結合實際案情,選擇不同的生物檢材進行砷化合物檢測,這對于推斷中毒時間及中毒程度等法醫(yī)學評價具有重要的價值。

2 砷形態(tài)化合物的穩(wěn)定性

砷元素各形態(tài)之間會隨樣品基質和周圍環(huán)境條件的改變而發(fā)生轉化,因此對樣品的貯存提出較為苛刻的要求以保證砷元素形態(tài)間不會發(fā)生轉化。

2.1水溶液

據(jù)研究報道[7]:濃度為1mg/L的AsⅤ和AsⅢ水溶液在4℃時可長期保存。0.5~1mg/L的AsⅤ、AsⅢ水溶液在4℃時可穩(wěn)定存在21d。100 μg/L MMAⅢ去離子水溶液在-20℃、4℃條件下,4月后約10%MMAⅢ被氧化,而室溫下,3 d后約10%MMAⅢ被氧化,20 d后約80%被氧化。DMAⅢ水溶液在25℃、4℃或-20℃時分別放置10d、13d、15d后,發(fā)現(xiàn)DMAⅢ被氧化為DMAⅤ。由于MMAⅢ和DMAⅢ容易被氧化,保存穩(wěn)定性較差,因此在樣品保存過程中應予以關注。高濃度的MMAⅤ和DMAⅤ標準儲備液(1000 mg/L)可在4℃下放置1年以上,低濃度的MMAⅤ和DMAⅤ(0.01~10 μg/L)可在室溫下穩(wěn)定保存5~6個月,在硝酸氧化體系中MMAⅤ和DMAⅤ可穩(wěn)定存在。AsB于4℃條件下保存多年不變,而AsC水溶液在室溫條件下,3 d內可被氧化為AsB[7],兩者經硝酸加熱后可轉化為TMAO,但最終轉化為DMA。一般來說,高濃度(>20 mg/L)砷元素各形態(tài)溶液在室溫下可長時間保存。

2.2生物樣本

在3℃時,尿液中AsⅢ、AsⅤ可穩(wěn)定存在5 d。室溫放置時,尿液中MMAⅢ可在一周內完全轉化為MMAⅤ,其他溫度條件下例如-20℃、4℃,尿樣中的MMAⅢ穩(wěn)定性也不高,兩者中僅有在-20℃時相對比較穩(wěn)定。而尿液中DMAⅢ極不穩(wěn)定,在25℃、4℃和-20℃條件下DMAⅢ尿樣分別放置1.5 h、12 h、17 h后被氧化為DMAⅤ。尿液中MMAⅤ和DMAⅤ穩(wěn)定性相對較好,在-20℃、3℃和20℃可穩(wěn)定存在30 d以上,更長時間的MMAⅤ和DMAⅤ保存穩(wěn)定性取決于尿樣的特性。另外劉博瑩等[11]考察了反復凍融對尿砷形態(tài)穩(wěn)定性的影響,低溫(-20℃、-80℃)反復凍融3次后對尿樣中各形態(tài)砷(無機砷iAs、MMA、DMA、三甲基砷TMA)進行檢測未見明顯改變。Todor等[12]對血液中2 μg/L的5種砷形態(tài)物質(AsⅢ、AsⅤ、AsB、MMA、DMA)做了穩(wěn)定性研究,24 h后AsB含量上升,AsⅤ、MMAⅤ和DMAⅤ含量下降。更系統(tǒng)性的血液中砷形態(tài)穩(wěn)定性需更進一步研究。

3 砷形態(tài)分析技術

3.1生物樣品前處理技術

由于生物樣本基質較復雜,直接進樣會造成檢測干擾、檢測靈敏度降低、儀器壽命縮短等問題,因此在含砷生物樣品檢測前首先需要經過一系列樣本前處理過程,再進行定性、定量分析。

尿液和唾液前處理相對較為簡單,只需通過簡單過濾就可達到檢測要求,Todor等[12]用1%硝酸稀釋尿樣10倍后直接使用PRP-X100預柱和PRPX100(250 mm×4.1mm,Hamilton)陰離子交換柱高效液相色譜-電感耦合等離子質譜(HPLC-ICP-MS)進行檢測。Yasuomi等[13]直接加相同體積流動相與尿液混溶后過濾取上清進樣,采用HPLC-ICP-MS對AsIII、MMAV、DMAV檢測。Chungang等[14]移取500 μL唾液樣品,并與1mL去離子水渦旋混合超聲后用0.45μm濾膜過濾后直接進樣分析。

血液樣本由于基質十分復雜,樣本前處理過程也相對比較繁瑣。Bin等[15]在對人血清和紅細胞中所含砷進行形態(tài)分析時,將血液樣本分離成血清和紅細胞,并經除蛋白處理后于-4℃儲存,采用HPLC-AFS分析前再經0.45μm薄膜過濾處理。Yasuomi等[13]將血清加相同體積乙腈沉淀蛋白,過濾后取上清液,再加相同體積流動相(10 mM丁烷磺酸鈉/4 mM丙二酸/4 mM氫氧化四甲銨,pH=3.0)稀釋,采用HPLCICP-MS對AsV、AsIII、MMAV、DMAV進行檢測。Yuta等[16]將EDTA抗凝收集的血液樣本于4℃下以1000×g離心10min,分離成血紅細胞和血漿,血紅細胞用磷酸鹽緩沖鹽水清洗兩遍,-80℃環(huán)境下凍干;0.2 g血漿經10-kDa過濾膜超濾后取上清液進HPLC-ICPMS分析。Badal等[17]對血液樣本以1500×g離心5 min,分離血漿和血紅細胞,血漿與三氯乙酸(終濃度5.0%)混合保存冰浴1h后,20000×g離心20min,取上清液經0.45 μm過濾膜(Millex-HV)過濾后用HPLC-ICP-MS檢測。對于血紅細胞用磷酸緩沖鹽溶液(pH=7.4)清洗三遍,凍干取0.50~0.80 g用5 mL冰凍甲醇水溶液(3:2 v/v)溶解,渦旋20 min,重復三次,最終提取物于-80℃保存3~4 h凍干,凍干物用超純水溶解,離心過濾進HPLC-ICP-MS檢測。Kanna等[18]取300μL山羊血用相同體積的乙腈混合振蕩2 min,8 500×g離心10 min,取上清液經0.2 μm尼龍過濾膜過濾后直接分析。

Meiling等[19]將砷蛋白用20 mM醋酸銨水溶液(pH=8.0)進行蛋白酶消解,然后冰浴5 min,離心(12 000rpm)取上清液適當稀釋,經離子對色譜柱分離,ICP-MS檢測。Eric等[20]對肝細胞制備液直接采用12000×g離心12min后進樣。

對于頭發(fā)樣本,Hongmei等[21]先用去離子水、丙酮清洗頭發(fā)后吹干,取0.5 g頭發(fā)與10 ml去離子水混合于聚丙烯管中,90℃加熱萃取6h。過濾分離萃取液,于4℃存儲過夜,第二天分析。Badal等[22]用國際原子能協(xié)會(IAEA)方法對頭發(fā)樣本進行清洗后,取0.05~0.1g頭發(fā)樣本,用超純水浸濕提取,考察不同時間條件下砷物質浸出情況。頭發(fā)樣本于90℃水浴加熱,浸出物通過0.45 μm針頭式過濾器(Millex-HV)過濾后按時間間距分別進樣檢測。

對于樣本的前處理,需要根據(jù)生物樣品的特點具體處置。但理想的砷形態(tài)前處理技術都會要求良好的回收率,同時要保證砷的形態(tài)在樣品處理過程中不受影響,并滿足檢測要求。

3.2形態(tài)分析技術

砷形態(tài)分析研究進展多年,分離技術已經逐漸成熟,主要有溶劑萃取法、離子交換法、氫化物發(fā)生法(HG)、毛細管電泳法(CE)、色譜法等[23];檢測技術早期多采用光度法[24-25]、中子活化分析、原子吸收光譜法(AAS)、原子熒光光譜法(AFS)、電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)等。聯(lián)用技術的出現(xiàn)大大推動了砷形態(tài)分析的研究[26],與單一的檢測技術相比,聯(lián)用技術選擇性、靈敏度更高,逐漸成為砷形態(tài)分析的重要手段[27]。常用的聯(lián)用技術有光譜分析法聯(lián)用、高效液相色譜-質譜聯(lián)用、離子色譜-質譜聯(lián)用等。表1給出了近年來各分離技術與檢測技術在砷形態(tài)分析中的應用實例。

表1 砷形態(tài)分離分析技術應用實例

目前常用于砷形態(tài)分析的聯(lián)用技術為高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法(HPLC-ICP-MS)。高效液相色譜法(HPLC)具有分離模式多、分離效能高、操作簡便且易實現(xiàn)在線分析等優(yōu)點[23-25,30-33],而電感耦合等離子質譜(ICP-MS)具有干擾少、檢測限低、靈敏度高、動態(tài)線性范圍寬、能跟蹤多元素同位素信號等優(yōu)點[27,32-34],兩者聯(lián)用進行元素形態(tài)的檢測分析,效果較其他聯(lián)用技術好。

Ruimin等[35]采用HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術,利用陰陽離子交換色譜柱的不同特性,分別分離尿液中AsIII、AsV、DMAV、MMAV和DMAIII、MMAIII、AsB,檢出限達到了μg/L水平。Jens等[36]利用陽離子交換柱(ChromPackIonospher 5C 3.0 mm×100 mm,5 μm)成功分離尿液中DMA、AsB、TMAO、DMAA、TMAP、DMAE砷形態(tài)化合物。而Badal等[17]則是采用HPLCICP-MS聯(lián)用技術,利用陰離子交換柱(ShodexAsahipak ES-502N 7C,7.6 mm×100 mm)對砷暴露的Sahadiarh村的41個血液、尿液、頭發(fā)、指甲樣本進行砷形態(tài)含量分析,證明尿液、頭發(fā)、指甲樣本對飲用水砷濃度呈正相關,并分別測定尿液、血液、頭發(fā)、指甲樣本中AsB、AsIII、AsV、MMAIII、MMAV、DMAIII、DMAV的不同比例,其中,頭發(fā)、指甲樣本中砷形態(tài)含樣本含量最多是AsIII,分別是58.9%、62.4%,尿液、紅細胞、血漿比例最大則是DMAV,分別是47.5%、77.5%、35.1%。并且Badal等[22]也對印度砷暴露West Bengal區(qū)域47個頭發(fā)、指甲樣本進行檢測,更是證明在指甲、頭發(fā)樣本中所占比例最多的是AsIII。表2給出了近年來HPLC-ICP-MS在砷形態(tài)分析中的一些應用實例。

表2 HPLC-ICP-MS在砷形態(tài)分析中的實用實例

4 生物樣本中砷形態(tài)分析的應用

4.1檢材選擇研究

研究人員通過探索除血液、尿液之外的生物檢材來進行對砷形態(tài)含量的實時監(jiān)控。例如陳保衛(wèi)等[10]在砷的代謝機制、毒性和生物監(jiān)測研究中發(fā)現(xiàn)唾液中砷濃度與飲用水砷濃度的相關性系數(shù)與尿液相近。Chungang等[14]對不同濃度砷暴露的唾液建立HPLC-ICP-MS檢測方法,對AsV、AsIII、MMAV、DMAV、MMAIII、DMAIII進行分離,證實唾液用于分析體內砷各形態(tài)濃度的可行性。此外,相較于血液、尿液,唾液具有非侵害性取材的優(yōu)點。

陳保衛(wèi)等[10]還證實頭發(fā)中砷的濃度與尿砷的濃度(r=0.75,p<0.001)、飲用水中的濃度(r=0.74,p<0.001)、砷的日攝入量(r=0.77,p<0.001)都存在顯著的相關性;且指甲中砷的濃度與水中砷的濃度顯著相關(r=0.46,p<0.001)(0.002-66.6 ng/mL)。Badal等[22]采集砷暴露地區(qū)人群頭發(fā)和指甲,判斷其是否可以成為檢測砷暴露程度的生物檢材。研究采取樣本(n=47),用HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術進行檢測,發(fā)現(xiàn)指甲中AsIII占58.6%,頭發(fā)中占60.9%,并且指甲中檢出DMAIII,而頭發(fā)中未檢出,又因頭發(fā)可能存在外源性污染,因此指甲較頭發(fā)更適合用于生物學評價。

因此除了血液、尿液常規(guī)生物樣本外,在特殊情況下還可以在頭發(fā)、唾液、指甲中進行砷形態(tài)的相關分析。

4.2毒理研究

砷是一種廣泛存在的環(huán)境毒物,高劑量的砷暴露地區(qū)、環(huán)境,已經成為危害人類健康的全球性問題。

研究人員采用動物實驗對不同形態(tài)砷含量進行檢測,或者采集砷暴露的人群的生物檢材進行砷含量檢測。例如陳紹占等[37]取4周齡Wistar大鼠4只,體重(50±10)g,分別給藥0.5%CMC(羧甲基纖維素鈉)、0.3 g/kg、0.9 g/kg、2.7 g/kg(以0.5%CMC為混懸介質)的雄黃(As4S4或As2S2)。末次給藥2h后,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,取肝臟和腎臟。稱取0.3~0.4 g粉碎試樣溶解于38 mL水、2 mL 3%乙酸溶液渦旋,60℃水浴超聲2 h后靜置5 min,4℃下,以9 000 r/min離心10 min,取上清液過0.2 μm濾膜后用HPLC-ICP-MS檢測,結果AsB、DMA、AsIII、MMA、AsV檢出限為0.3μg/L、0.3μg/L、0.3μg/L、0.5 μg/L、0.5 μg/L,線性范圍為1~300μg/L,相關系數(shù)大于0.9990,加標回收率為83.8%~111.7%,相對標準偏差RSD<5%(n=6)。對染毒大鼠肝、腎進行檢測發(fā)現(xiàn)雄黃在大鼠肝臟代謝主要以DMA形式存在,并有少量的AsIII和未知物2;腎臟中的砷形態(tài)主要以DMA、MMA、AsIII、未知物1、未知物2和未知物3形式存在。

這類動物實驗旨在探究砷形態(tài)在生物體內的代謝過程,對生物砷暴露之后的體內的代謝過程有更好的掌控,以便應用到對砷暴露人群進行更好的治療。

4.3臨床研究

砷化合物同時也是一種治療用藥物,研究人員發(fā)現(xiàn)砷可以有效治療急性骨髓性白血?。╝cute promyelocytic leukemia,APL)。

研究人員還對砷治療的APL病人采取例如血液、尿液等生物檢材來實時監(jiān)控砷形態(tài)在APL病人體內的含量變化,以正確制定治療方案。對于APL病人的相關研究:Yasuomi等[13]應用砷形態(tài)分析方法對APL病人進行日常0.08 mg/kg砒霜治療35 d病情緩解后對其血漿、尿液(Days 4、5)進行分析,得到第四天24 h中AsIII、MMAV、DMAV血漿總含量為18 μg/L~41μg/L,尿液中總量為4 464 μg/d,獲得治療APL細胞僅需要血漿中有nM水平的砷就足夠的結論。Baowei等[38]對9位進行砷治療的APL患者的唾液進行HPLC-ICP-MS聯(lián)用分析,發(fā)現(xiàn)唾液中占總砷含量71.8%的是AsIII,隨著治療進程,砷甲基化程度明顯減少,表明在大劑量砷注射之后,甲基化進程趨向飽和。

通過APL患者的血液、尿液、唾液等生物檢材實時監(jiān)測病人體內砷形態(tài)代謝后含量變化,可以合理利用砷的醫(yī)用價值,達到治療APL的效果。

5 展望

生物樣本中砷的形態(tài)分析對于研究砷的代謝機制、毒性評價、生物監(jiān)測等方面研究具有重要意義。隨著以形態(tài)為基礎的毒理學的研究深入,金屬形態(tài)分析將會越來越多的應用于法醫(yī)學金屬元素中毒案件。同時,隨著研究人員對金屬形態(tài)學領域認識的進一步深化,金屬形態(tài)分析也將會越來越多地受到研究人員的關注。

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(本文編輯:卓先義)

Recent Progress in the Analysis of Arsenic Species in Biological Samples

LIN Lin1,SHEN Min2,MA Dong2
(1.College of Criminal Justice,East China University of Political Science and Law,Shanghai 200042,China;2. Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,P.R. China Shanghai 200063,China)

Abstract:Different species of arsenicals have different toxicity. The measurement and toxicity evaluation based on the total arsenic can not meet the requirement of scientific development. The toxicity,metabolism and measurement of different arsenic compounds have become international research hotspots in the fields of forensic toxicology,environmental protection,food safety,et al. This review summarized the research advance in the analysis of arsenic species in biological samples,including separation,identification and detection,in order to improve the understanding of the metabolism and toxicity of different arsenic species in organisms,as well as its application in forensic toxicology.

Key words:arsenic compound;speciation analysis;biological sample;pretreatment technique;analyzing technique;review

中圖分類號:DF795.1

文獻標志碼:A

doi:10.3969/j.issn.1671-2072.2016.03.012

文章編號:1671-2072-(2016)03-0072-07

收稿日期:2016-01-07

基金項目:國家自然科學基金項目(81302613);上海市技術標準專項(13DZ0503001);中央級科研院所社會公益研究資助項目(GY1102);上海市法醫(yī)學重點實驗室(14DZ2270800);上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺資助項目(16DZ2290900)

作者簡介:林琳(1991—),女,碩士研究生,主要從事毒物分析研究。E-mail:idea00@yeah.net。

通信作者:馬棟(1978—),男,副研究員,主要從事毒物分析研究。E-mail:modong@ssfjd.cn。

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