蘇瑞，宋立婷，董允允，鄧嘉胤，蔣少云

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人牙齦成纖維細胞和牙周膜韌帶細胞多向分化潛能的比較

蘇瑞，宋立婷，董允允，鄧嘉胤，蔣少云△

摘要：目的體外培養(yǎng)人牙周膜韌帶細胞（HPDLCs）和人牙齦成纖維細胞（HGFs），對比兩者成骨、成軟骨以及成脂的多向分化潛能的差異。方法運用酶消化結(jié)合組織塊法體外培養(yǎng)HPDLCs和HGFs，選擇生長狀態(tài)良好的3～4 代HPDLCs和HGFs，進行成骨、成軟骨、成脂誘導，未分化誘導的細胞作為對照組。分別用茜素紅染色、油紅O染色以及阿利新藍染色分別檢測兩種細胞的成骨、成軟骨及成脂分化能力。半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測HPDLCs和HGFs中相關(guān)標志基因骨鈣素(OCN)、Ⅰ型膠原蛋白（Col 1）、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ2（PPARγ2）、X型膠原蛋白（Col 10）mRNA的表達。結(jié)果成骨誘導兩種細胞培養(yǎng)至28 d時，細胞周圍均有紅染鈣結(jié)節(jié)形成，HPDLCs形成的鈣結(jié)節(jié)明顯多于HGFs；成軟骨誘導兩種細胞14 d時均可見胞質(zhì)藍染的細胞，HGFs較HPDLCs明顯；成脂誘導兩種細胞21 d時，可見紅色脂肪滴形成，HPDLCs形成的脂肪顆粒明顯少于HGFs。HGFs和HPDLCs分化培養(yǎng)7 d和14 d后，均有OCN、Col 1、RUNX2、PPARγ2和Col 10的表達，在14 d時的表達均高于7 d；HPDLCs中OCN、Col 1、RUNX2的表達高于HGFs，PPARγ2、Col 10的表達低于HGFs（均P＜0.05）。結(jié)論HPDLCs的成骨能力較HGFs強，成軟骨和成脂能力較HGFs弱。

關(guān)鍵詞：人牙周膜韌帶細胞；人牙齦成纖維細胞；細胞分化；成骨分化；成脂分化；成軟骨分化

△通訊作者E-mail: sjiang@tmu.edu.cn

近年來，牙周炎導致牙周附著喪失、牙槽骨的吸收和牙齒的松動，已成為成年人失牙的主要原因。利用組織工程學獲得牙周組織的再生已成為目前的研究熱點。人牙周膜韌帶細胞（human periodontal ligament cells，HPDLCs）和人牙齦成纖維細胞（hu?man gingival fibroblasts，HGFs）是牙周組織中兩種主要的細胞成分，在細胞更新、組織修復以及組織再生中發(fā)揮重要的作用。已有研究證實，這兩種細胞在一定條件下均有多向分化的潛能[1-2]，但至今鮮見兩者多向分化潛能比較的文獻報道。本研究旨在通過對HPDLCs和HGFs進行體外成骨、成軟骨、成脂的分化誘導，比較這兩種細胞多向分化潛力的差異，為牙周組織工程學選擇可靠種子細胞提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料DMEM培養(yǎng)液（低糖），胎牛血清，胰蛋白酶（Gib?co公司，美國）；青/鏈霉素，Ⅰ型膠原酶，地塞米松，抗壞血酸，甘油磷酸鈉，茜素紅（Sigma公司，美國）；吲哚美辛，3-異丁基-1-甲基黃嘌，胰島素，飽和油紅O，轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1，阿利新藍（北京索萊寶公司，中國）；Trizol總RNA提取試劑盒（Invitrogen，美國）、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（Pro?mega，美國）；CO2細胞培養(yǎng)孵箱，低溫高速離心機（Heraeus公司，德國）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus公司，日本）。

1.2方法

1.2.1HGFs和HPDLCs的體外分離與培養(yǎng)選擇2014年9月—10月就診于天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院頜面外科的志愿者（無全身系統(tǒng)性疾病和吸煙），年齡18～25歲，因阻生齒（無齲病、牙周?。┬璋纬?，經(jīng)患者知情同意后，術(shù)中收集分離的新鮮健康牙齦組織培養(yǎng)HGFs。HPDLCs則是選擇年齡12～ 18歲的志愿者，經(jīng)患者知情同意后，收集因正畸需要拔除的雙尖牙（無齲病、牙周病），采用Ⅰ型膠原酶消化結(jié)合組織塊法培養(yǎng)HGFs和HPDLCs，兩種細胞均待細胞爬出組織塊并鋪滿瓶底達80%融合時，進行首次傳代，用DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，取第3～4代細胞進行實驗。

1.2.2細胞分化培養(yǎng)取生長狀態(tài)良好的第3～4代HGFs 和HPDLCs，以1×104/mL的濃度接種于6孔板中，37℃溫箱孵育至細胞達到80%融合時，棄原培養(yǎng)液，實驗組加入誘導液。成骨誘導：含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、1×10-8mol/L地塞米松、3%胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基；其對照組為含3%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基。成軟骨誘導：含6.25 mg/L胰島素，10 μg/L TGF-β1，50 mg/L抗壞血酸，3%胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基；其對照組為含3%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基。成脂誘導：含0.25 μg/L地塞米松，2×10-4mol/L吲哚美辛，0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌，10 mg/L胰島素，3%胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基；其對照組為含3%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基。

1.2.3茜素紅染色按照上述成骨誘導方法培養(yǎng)兩種細胞，每周換液2～3次，培養(yǎng)至28 d，棄原培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，4%多聚甲醛進行細胞固定30 min后，PBS漂洗3次，每次2～3 min，加入0.1%茜素紅（Alizarin Red -S），室溫放置30 min，PBS清洗2～3遍，直視及顯微鏡下拍照觀察。

1.2.4阿利新藍染色按照上述成軟骨誘導方法培養(yǎng)兩種細胞，每周換液2～3次，培養(yǎng)至14 d，棄原培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，4%多聚甲醛進行細胞固定30 min后，PBS漂洗3次，每次2～3 min，加入阿利新藍染色液，孵育過夜，3%醋酸漂洗3次，每次5 min，PBS清洗2～3遍，直視及顯微鏡下拍照觀察。

1.2.5油紅O染色按照上述成脂誘導方法培養(yǎng)兩種細胞，每周換液2～3次，培養(yǎng)至21 d，棄原培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，4%多聚甲醛進行細胞固定30 min后，PBS漂洗3次，每次2～3 min，加入油紅O染色液，室溫放置20 min，PBS漂洗2～3次，顯微鏡下拍照觀察。

1.2.6RT-PCR按照1.2.2中3種分化培養(yǎng)基分別培養(yǎng)兩種細胞，每周換液2～3次，取培養(yǎng)至7 d和14 d的細胞，棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗，提取總RNA，按照RT-PCR試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。檢測成骨誘導后HGFs和HPDLCs中成骨基因骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型膠原蛋白（collagen 1，Col 1）和runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）的表達；成脂誘導后HGFs和HPDLCs中過氧化物酶體增殖物激活受體2（peroxisome proliferator-acti?vated receptor gamma 2，PPARγ2）的表達；成軟骨誘導后HGFs和HPDLCs中X型膠原蛋白（collagen 10，Col 10）的表達。PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如下：OCN上游5′-GTCCAAGCAGGAGGGCAG-3′，下游5′-TTGAGCTCACACACCTCCC- 3′；Col 1上游5′- AGGGC?CAAGACGAAGACATC-3′，下游5′-AGATCACGTCATCGCA?CAACA-3′；RUNX2上游5′-TCTGACCGCCTCAGTGATTT-3′，下游5′-CAGCGTCTATGCAAGTGAAACC-3′；PPARγ2上游5′-AGACAACCTGCTACAAGCCC-3′，下游5′-AGCGGGT?GAAGACTCATGTC- 3′；Col 10上游5′- CCCAGCACG?CAGAATCCATC-3′，下游5′-TCTTGGTGTTGGGTAGTGGG-3′；GAPDH上游5′-GCACCGTCAAGGCCTGAGAAC-3′，下游5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′。以上所有引物RTPCR的反應條件均為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)，72℃終末延伸5 min。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下拍照。使用Quantity One凝膠圖像分析軟件處理，以GAPDH作為內(nèi)參基因，進行半定量RT-PCR分析。

2　結(jié)果

2.1茜素紅染色對照組細胞周圍均無鈣結(jié)節(jié)形成，而成骨誘導組的HGFs和HPDLCs周圍均有大量紅染的鈣結(jié)節(jié)，但HPDLCs組中鈣結(jié)節(jié)較HGFs組明顯，見圖1。

2.2阿利新藍染色對照組細胞阿利新藍染色陰性，成軟骨誘導組的HGFs和HPDLCs鏡下均可見胞質(zhì)藍染的細胞，但HGFs較HPDLCs明顯，見圖2。

Fig. 1 Alizarin red staining in HGFs and HPDLCs induced in osteogenic medium圖1　HGFs和HPDLCs成骨誘導茜素紅染色

Fig. 2 Alcian blue staining in HGFs and HPDLCs induced in chondrogenic medium圖2　HGFs和HPDLCs成軟骨誘導阿利新藍染色

2.3油紅O染色HGFs加入成脂誘導液5 d后，細胞體積明顯增大，形態(tài)由原來的長梭型變?yōu)榧鈾E圓形或者不規(guī)則形，誘導21 d后細胞形態(tài)改變更加明顯，油紅O染色后鏡下可見細胞質(zhì)內(nèi)大小不一葡萄球樣紅色脂肪顆粒，數(shù)量較多。HPDLCs成脂誘導后，細胞形態(tài)變化緩慢，培養(yǎng)至21 d鏡下可見少量細胞形態(tài)呈不規(guī)則形改變，油紅O染色后極少數(shù)細胞質(zhì)內(nèi)可見球狀紅色脂肪顆粒。HGFs產(chǎn)生的脂肪顆粒明顯多于HPDLCs。對照組油紅O染色陰性。見圖3。

2.4RT-PCR檢測成骨、成軟骨、成脂相關(guān)基因的表達（1）成骨誘導組HGFs和HPDLCs成骨誘導7 d和14 d后，均有成骨基因OCN、Col 1以及RUNX2的表達，成骨誘導14 d時其表達均高于7 d，同時其在HPDLCs中的表達均高于HGFs（均P＜0.05），見圖4、表1。（2）HGFs和HPDLCs成軟骨誘導7 d和14 d后均有Col 10的表達，成軟骨誘導14 d時Col 10的表達均高于7 d，HGFs中Col 10的表達均明顯高于HPDLCs（均P＜0.05），見圖4、表2。（3）HGFs和HPDLCs成脂誘導7 d和14 d后，均有PPARγ2的表達，成脂誘導14 d時PPARγ2的表達均高于7 d，HGFs中PPARγ2的表達明顯高于HPDLCs（均P＜0.05），見圖4、表3。

Fig. 3 Oil red O staining in HGFs and HPDLCs induced in adipogenic medium (×100)圖3　HGFs和HPDLCs成脂誘導油紅O染色（×100）

Fig. 4 The expression levels of OCN, Col 1, RUNX2, Col 10 andPPARγ2 at 7-day and 14-day after differentiation in HGFs and HPDLCs圖4　HGFs和HPDLCs分化培養(yǎng)7 d和14 d后OCN、Col 1、RUNX2、Col 10和PPARγ2的表達

Tab. 2 Expressions of Col 10 at day 7 and day 14 after chondrogenic differentiation in HGFs and HPDLCs表2　HGFs和HPDLCs成軟骨分化培養(yǎng)7 d和14 d后Col 10的表達?。╪=5，±s）

Tab. 2 Expressions of Col 10 at day 7 and day 14 after chondrogenic differentiation in HGFs and HPDLCs表2　HGFs和HPDLCs成軟骨分化培養(yǎng)7 d和14 d后Col 10的表達?。╪=5，±s）

組別HGFs組HPDLCs組t2 7 d 0.351±0.004 0.063±0.004 94.83＊14 d 0.485±0.007 0.107±0.005 82.06＊t1 31.20＊12.40＊

Tab. 3 Expressions of PPARγ2 at day 7 and day 14 after adipogenic differentiation in HGFs and HPDLCs表3　HGFs和HPDLCs成脂分化培養(yǎng)7 d和14 d后PPARγ2的表達?。╪=5，±s）

Tab. 3 Expressions of PPARγ2 at day 7 and day 14 after adipogenic differentiation in HGFs and HPDLCs表3　HGFs和HPDLCs成脂分化培養(yǎng)7 d和14 d后PPARγ2的表達?。╪=5，±s）

組別HGFs組HPDLCs組t2 7 d 0.376±0.018 0.075±0.002 29.43＊14 d 0.583±0.009 0.136±0.004 98.97＊t1 18.25＊22.49＊

Tab. 1 The expression levels of OCN, Col 1 and RUNX2 at day 7 and day 14 after osteogenic differentiation in HGFs and HPDLCs表1　HGFs和HPDLCs成骨分化培養(yǎng)7 d和14 d后OCN、Col 1和RUNX2的表達　（n=5，±s）

Tab. 1 The expression levels of OCN, Col 1 and RUNX2 at day 7 and day 14 after osteogenic differentiation in HGFs and HPDLCs表1　HGFs和HPDLCs成骨分化培養(yǎng)7 d和14 d后OCN、Col 1和RUNX2的表達?。╪=5，±s）

t1為配對t檢驗所得t值，t2為獨立樣本t檢驗所得t值；＊P < 0.05；表2～3同

組別HGFs組HPDLCs組t2 OCN 7 d 0.178±0.002 0.276±0.003 42.07＊14 d 0.452±0.006 0.733±0.010 42.63＊t1 70.69＊78.54＊Col 1 7 d 0.121±0.005 0.376±0.006 55.53＊14 d 0.423±0.003 0.692±0.008 55.67＊t1 92.16＊54.48＊RUNX2 7 d 0.079±0.002 0.094±0.003 6.45＊14 d 0.184±0.008 0.357±0.004 34.06＊t1 22.31＊88.38＊

3　討論

本課題組前期研究顯示，HPDLCs和HGFs作為牙周組織中兩種主要的細胞成分，不僅參與炎癥反應[3-4]，而且具有成骨分化能力[1-2]，均有望成為牙周組織再生中的細胞來源。OCN是骨組織中最豐富的非膠原蛋白，能夠反映骨形成的速率，是骨代謝和骨細胞活性的特異性指標，其能夠維持骨正常的礦化速率，抑制軟骨的礦化速率[5]；Col 1是成骨細胞分化過程中的重要基質(zhì)，為組織的礦化提供基礎(chǔ)；RUNX2是成骨分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控成骨細胞的成熟和分化，是骨形成的關(guān)鍵基因。本研究結(jié)果顯示，茜素紅染色后，成骨誘導組的HGFs和HPDLCs周圍均有大量紅染的鈣結(jié)節(jié)，且HGFs和HPDLCs成骨誘導7 d和14 d后均有成骨基因OCN、Col 1、RUNX2的表達，進一步證實了HGFs和HPDLCs均能在體外誘導環(huán)境中成骨，與Jin等[6]和Mostafa等[7]的研究結(jié)果一致。另外，本研究顯示，成骨誘導后HPDLCs組中鈣結(jié)節(jié)較HGFs組明顯，且HPDLCs成骨誘導7 d和14 d后OCN、Col 1、RUNX2的表達均高于HGFs，提示HPDLCs成骨向分化的能力較HGFs強。有研究顯示HGFs基線水平即有一定成骨相關(guān)基因的表達，雖然相對于HPDLCs中Ⅰ型和Ⅲ型膠原強陽性的表達而言，HGFs的表達能力較弱，但HGFs仍具有HPDLCs的一些特性[8-9]，此結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致。但Chio等[10]研究顯示，HGFs無明顯的成骨能力，可能是由于成骨誘導培養(yǎng)基成分不同所致。本研究所采用成骨誘導培養(yǎng)基中地塞米松的濃度較Chio等[10]實驗高，從而能更好地誘導HGFs成骨分化[11]。

阿利新藍染色是細胞成軟骨分化的重要標志。本研究中HGFs和HPDLCs成軟骨分化誘導14 d時阿利新藍染色均為陽性，提示二者均具有成軟骨分化的潛能。Col 10是重要的軟骨肥大標志分子，在成軟骨分化誘導7 d和14 d后，HGFs中成軟骨相關(guān)基因Col 10的表達較HPDLCs強，且阿利新藍染色結(jié)果顯示HGFs產(chǎn)生的陽性細胞多于HPDLCs，提示HGFs向成軟骨分化的能力強于HPDLCs。

在體外成脂誘導的研究中發(fā)現(xiàn)，HGFs在誘導后5 d即發(fā)生細胞形態(tài)的明顯變化，表現(xiàn)出脂肪細胞的形態(tài)；從成脂分化誘導7 d到14 d的過程中，細胞內(nèi)成脂分化標志基因PPARγ2的表達逐漸上調(diào)，決定了HGFs成脂分化的方向，從而出現(xiàn)21 d油紅O染色陽性明顯的結(jié)果。但是，HPDLCs成脂誘導后，細胞形態(tài)變化緩慢，產(chǎn)生的脂肪顆粒明顯少于HGFs，且HPDLCs中PPARγ2的表達明顯低于HGFs，以上結(jié)果均證實HGFs較HPDLCs有更強的成脂分化能力。

總之，HPDLCs和HGFs均具有成骨、成軟骨、成脂的多向分化潛能。二者在不同分化方向中的能力有差別，HPDLCs的成骨分化潛能較強，而HGFs的成軟骨和成脂分化潛能較強。由于HPDLCs臨床來源有限，而HGFs的細胞來源豐富，HGFs有望成為牙周組織工程學中的種子細胞，但其可能需要其他細胞因子的輔助，促進其成骨。

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（2015-09-22收稿2015-10-16修回）

（本文編輯陳麗潔）

作者單位：天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院牙周科（郵編300070）

The comparison on pluripotent differentiation between human gingival fibroblasts and human periodontal ligament cells in vitro

SU Rui, SONG Liting, DONG Yunyun, DENG Jiayin, JIANG Shaoyun△
Department of Periodontology, Hospital of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
△Corresponding Author E-mail: sjiang@tmu.edu.cn

Abstract:Objective To investigate the the multi-directional differentiation potential between pluripotent of human gingival fibroblasts (HGFs) and human periodontal ligament cells (HPDLCs). Methods HPDLCs and HGFs were obtained from the primary culture. HPDLCs and HGFs at 3rd-4thpassage were cultured in osteogenic, adipogenic or chondrogenic me?dium. Cells without differentiation were taken as control. Alizarin red, Alcian blue and oil red O staining were performed to detect osteogenic differentiation, chondrogenic and adipogenic differentiation in vitro, respectively. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was applied to examine the expression of osteocalcin (OCN), runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and collagen 1 (Col 1), peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARγ2) and collagen 10 (Col 10). Results HPDLCs and HGFs cultured in osteogenic medium showed massive calicium nodulus at day 28, but HP?DLCs formed more calicium nodulus than those of HGFs. The expressions of OCN, RUNX2 and Col 1 were significantly high?er in HPDLCs than those in HGFs (P＜0.05). In chondrogenic medium both cells were found blue deposit at day 14, and the expression of Col 10 was significantly higher in HGFs than that of HPDLCs (P＜0.01). Furthermore, in adipogenic medium HGFs showed more lipid-filled droplets stained with oil red O than HPDLCs at day 21. The expression of PPARγ2 was sig?nificantly higher in HGFs than that of HPDLCs (P＜0.01). Conclusion HPDLCs has the better potency of osteogenic differ?etiation than HGFs, however, HGFs has the better potency of adipogenic and chondrogenic differentiation.

Key words:human periodontal ligament cells; human gingival fibroblasts; cell differentiation; osteogenic differentia?tion; adipogenic differentiation; chondrogenic differentiation

中圖分類號：R781

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150183

基金項目：天津市應用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃-自然科學基金重點項目（12JCZDJC22700）

作者簡介：蘇瑞（1987），女，碩士研究生，主要從事牙周炎發(fā)病機制及牙周再生的研究