趙偉杰，李　偉，張　晶*（.臺州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化工學(xué)院，浙江臺州38000；.浙江新東港藥業(yè)股份有限公司，浙江臺州38000）

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超聲輔助川黃柏中黃柏堿的提取與含量測定的研究*

趙偉杰1，李偉2，張晶1*
（1.臺州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化工學(xué)院，浙江臺州318000；2.浙江新東港藥業(yè)股份有限公司，浙江臺州318000）

摘要：目的：超聲輔助提取川黃柏中黃柏堿，并利用HPLC法測定川黃柏中黃柏堿的含量。方法：色譜條件：選用Agilent zorbax SB-C18（150mm×4.6mm，5μm），流速1mL·min-1，柱溫40℃,檢測波長284nm。結(jié)果：回歸方程：Y=150.640643X-1.8811429，r=0.99992，線性范圍：0.8144～4.0720μg·μL-1，平均回收率為101.31%，RSD=1.24%。結(jié)論：超聲輔助提取可以明顯提高川黃柏中黃柏堿的提取率，并且經(jīng)過系統(tǒng)的方法學(xué)考察，該方法具有簡便、穩(wěn)定、可重復(fù)的特點(diǎn)，為川黃柏藥材質(zhì)量控制和評價(jià)提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：川黃柏；黃柏堿；HPLC；超聲提取

黃柏具有非常悠久的藥用歷史，是臨床應(yīng)用最為廣泛的中藥之一。黃柏來源于蕓香科植物黃皮樹的干燥樹皮，作為中藥黃柏的基源載入2000年版和2010年版《中國藥典》,分別為通常所稱的關(guān)黃柏和川黃柏［1-3］。川黃柏在我國分布較廣，主要產(chǎn)于四川、湖北、貴州、云南、陜西、廣西等地［4,5］。川黃柏是常用的傳統(tǒng)中藥材，主要活性部位含有小檗堿、巴馬汀、藥根堿、木蘭花堿、黃柏堿等季銨型生物堿，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡等功效［6］現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃柏具有抗菌、抗真菌、抗炎、抗肝炎、抗腎炎、抗?jié)?、抗氧化、抗痛風(fēng)、降血壓、降血糖、抗腫瘤、抗心力衰竭、抑制細(xì)胞免疫等作用［7-13］。黃柏堿作為黃柏藥材的特征性成分和重要活性成分，目前，已廣泛應(yīng)用于黃柏藥材及中藥制劑的質(zhì)量控制，且其藥理活性顯著。研究發(fā)現(xiàn)黃柏堿在降血壓、抗腎炎、抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)、中樞神經(jīng)抑制等方面均具有顯著效果，尤其在抑制細(xì)胞免疫方面的顯著效果，且可將其作用應(yīng)用于抗過敏、舒緩肌膚等化妝品中。因此，對于黃柏堿的深入研究與開發(fā)將具有非常廣闊的應(yīng)用價(jià)值和市場前景。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，頻率40kHz，功率250W）；循環(huán)水式真空泵（臺州市信力電子設(shè)備有限公司）；安捷倫高效液相1260；電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；30B型萬能粉碎機(jī)（江陰市鑫達(dá)藥化機(jī)械制造有限公司）。

乙腈為色譜純（Sigma-Aldrich公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其它試劑均為分析純；川黃柏藥材（批號：12072001，安徽頤生堂中藥飲片有限公司）；鹽酸黃柏堿對照品（批號111895-201303，中國生物制品檢定所）。

1.2色譜條件

色譜柱為Agilent zorbax SB-C18柱（150 mm× 4.6mm，5μm）；流動相為乙睛-［0.05 mol·L-1KH2PO4-三乙胺（用H3PO4調(diào)pH值為4）］（10∶90∶0.3）；檢測波長284nm，流速1mL·min-1，柱溫40℃。

1.3對照品溶液

精密稱取鹽酸黃柏堿適量，加乙腈溶液制成0.2036mg·mL-1溶液，作為對照品溶液。

1.4供試品溶液

精密稱定黃柏堿粉末，加入乙腈溶解，通過0.45μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。

2　結(jié)果與討論

2.1超聲輔助提取工藝研究

2.1.1超聲功率的考察稱取川黃柏小片20.0g，加入提取溶劑HCl-70%乙醇（1∶100），料液比為1∶20g·mL-1，超聲功率分別為100、250和450W，超聲溫度為40℃，超聲60min，趁熱抽濾。加入HCl調(diào)至pH值為2，再加一定濃度的NaCl水溶液攪拌，靜置，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，得黃柏堿粉末。將黃柏堿粉末用乙腈溶解，通過0.45μm微孔濾膜過濾，濾液10μL進(jìn)樣測定，提取率分別為2.96%、4.62%、4.05%。

圖1　超聲功率對提取率的影響Fig.1　 Effect of ultrasonic power on extraction rate

由圖1可知，提取率隨著功率增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在功率為250W時提取率較高。

2.1.2超聲溫度的考察超聲功率選取250W，超聲時間60min，超聲溫度分別選取20、40、60、80℃來考察超聲溫度對黃柏堿提取率的影響。

圖2　超聲溫度對提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate

由圖2可知，提取率分別為3.46%、4.62%、5.35%、4.78%。結(jié)果表明，提取率隨著溫度增加也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在溫度為60℃時提取率較高。

2.1.3超聲時間的影響超聲功率為250W，超聲溫度為60℃，超聲時間分別為30、40、50、60，70min來考察超聲時間對黃柏堿提取率的影響。

圖3　超聲時間對提取率的影響Fig.3　 Effect of ultrasonic time on extraction rate

由圖3可知，提取率分別為4.46%、5.12%、5.98%、6.09%、6.12%。結(jié)果表明，提取率隨著時間增加而增大，但超聲50min后提取率變化幅度較小，因此，考慮提取時間50min為宜。

2.1.4超聲輔助提取方法稱取川黃柏小片20.0g，加入提取溶劑HCl-70%乙醇（1∶100），料液比為1∶20g·mL-1，超聲功率為250W，超聲溫度為60℃，超聲時間為50 min，趁熱抽濾。加入HCl調(diào)至pH值為2，再加一定濃度的NaCl水溶液攪拌，靜置，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，得黃柏堿粉末。將黃柏堿粉末用乙腈溶解，通過0.45μm微孔濾膜過濾得供試品溶液，進(jìn)樣10μL測定。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系考察精密吸取鹽酸黃柏堿對照品溶液4、8、12、16、20μL，注入高效液相色譜儀，以乙腈-［0.05mol·L-1KH2PO4溶液-三乙胺（磷酸調(diào)pH值為4.0）］（10∶90∶0.26）為流動相，用1.2色譜條件測定峰面積，黃柏堿濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸處理，回歸方程：Y= 150.640 643X-1.8811429，r=0.99992，說明線性關(guān)系良好，線性范圍：0.8144～4.0720μg·μL-1。

2.2.2精密度試驗(yàn)精密吸取黃柏堿對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10μL，測得黃柏堿峰面積峰的RSD=1.1%,說明本方法具有良好的精密度。

2.2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)分別于0,2,4,8,12,24,36,48h,精密吸取供試品溶液10μL,注入高效液相色譜儀,測得的黃柏堿峰面積RSD=0.73%,結(jié)果表明供試液在48h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.2.4重現(xiàn)性試驗(yàn)精密稱取同一批川黃柏藥材樣品5份,每份約5g,按供試品溶液制備方法及色譜條件進(jìn)行黃柏堿含量測定,RSD=1.46%,可見本方法有良好的重復(fù)性。

2.2.5回收率試驗(yàn)取川黃柏5份,每份約5.0g,精密加入鹽酸黃柏堿對照品適量,每份樣品進(jìn)樣10μL,按照HPLC條件進(jìn)行含量測定,計(jì)算平均回收率為101.31%, RSD= 1.24%。

2.2.6黃柏堿的含量測定取供試品溶液1mL，經(jīng)0.45μm微孔過濾器過濾進(jìn)樣瓶中，在“1.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定外標(biāo)法計(jì)算，即得樣品中黃柏堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.98mg·g-1。色譜圖見圖4。

圖4　鹽酸黃柏堿對照品溶液（A）、供試品溶液（B）和陰性對照液（C）的HPLC圖Fig.4 HPLC chromatograms of reference substance, sample（B）and negative control（C）

3　小結(jié)

本文采用超聲輔助從川黃柏中提取出黃柏堿,并通過高效液相色譜檢測其含量，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，該檢測方法具有簡便、快速、穩(wěn)定、可靠、可重復(fù)的特點(diǎn)，為川黃柏藥材質(zhì)量控制和評價(jià)提供了參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］周松,劉永剛,張國祥,等.黃柏化學(xué)成分及質(zhì)量控制研究進(jìn)展［J］.中國藥房,2012,23（39）:3740-3742.

［2］中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000. 251-252.

［3］中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2010.286-287.

［4］廉蓮,咸曉燕,楚冬海,等.川黃柏的化學(xué)成分研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19（19）:149-152.

［5］沈力,付紹智,馬羚,等.川黃柏野生資源調(diào)查研究［J］.中國野生植物資源,2009,28（4）:25-59.

［6］李紅玲,莫炫永.HPLC法同時測定川黃柏中鹽酸黃柏堿和鹽酸小檗堿的含量［J］.中國藥房,2014,25（27）:2562-2564.

［7］梁園園,于天浩,等.黃柏的藥理活性及在化妝品中的應(yīng)用［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)報(bào)，2013,15（1）:149-151.

［8］嘉瑞,張冰,張光敏.黃柏藥理作用研究進(jìn)展［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥. 2009,5（11）:160-162.

［9］Mori H,Fuchigami M,Inoue N,etal.Principleofthe bark of Phellodendron amurense to suppressthe cellularimmuneresponse［J］.Plantamed,1994,60（5）:445-449.

［10］廖靜,鄂征,聶毓秀，等.中藥黃柏的光敏抗癌作用研究［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1999,20（3）:153-155.

［11］吳達(dá)榮,鄭有順,蘇用波.黃柏對幽門螺桿菌的抑菌臨床研究［J］.華南藥訊,1995，（4）:30.

［12］張志軍.黃柏提取物的抗?jié)冃Ч跩］.國外醫(yī)學(xué)（中醫(yī)中藥分冊）,1994,16（1）:29.

［13］宏君.培育捆束水浸應(yīng)激性潰瘍易發(fā)系小鼠以及黃柏提取物成分的藥理遺傳學(xué)解析［J］.國外醫(yī)學(xué)（中醫(yī)中藥分冊）,1992,14 （1）:52.

Abstrcat：Objective：The phellodendrine was extracted by ultrasound assisted and the content was determined by HPLC method. Methods：The chromatographic conditions were:Agilent zorbax SB-C18column（150mm×4.6mm，5μm）, flow rate being 1mL·min-1, column temperature 35℃, detection wavelength at 284nm for phellodendrine. Results：The regression equation: Y=150.640643X-1.8811429, r=0.99992, the linear range：0.8144～4.0720μg·μL-1, the average recovery was 101.31%, RSD=1.24%.Conclusion Ultrasonic assisted extraction can improve the extraction rate of phellodendrine and after the system of methodology, the method has the characteristics of simple, stable, repeatable, provides the reference for the quality control and evaluation of Cortex Phellodendri.

Study on the extraction and content determination of phellodendrine in cortex phellodendri*

ZHAO Wei-jie1，LI Wei2，ZHANG Jing1
（1.Department of Biological & Chemical Engineering; Taizhou Vocational & Technical College,Taizhou 318000，China; 2.Zhejiang Neo-Dankong Pharmaceutical Co., Ltd., Taizhou 318000，China）

Key words：cortex phellodendri；phellodendrine；HPLC；ultrasonic extraction

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16247/j.cnki.23-1171/tq. 20160424

收稿日期：2016-01-22

基金項(xiàng)目：臺州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.1301ky58）

作者簡介：趙偉杰（1978-），男，漢族，講師，主要從事無機(jī)、有機(jī)及分析化學(xué)教學(xué)和科研工作。