李麗霞++程小愛++張海平

摘 要：為研究歐李葉片內(nèi)水澇脅迫下還原性糖的變化，從事先準(zhǔn)備好的歐李中取樣，用硫酸-苯酚定糖法測(cè)定歐李葉片中還原性糖，與對(duì)照比較還原糖的變化。結(jié)果顯示，歐李葉片內(nèi)還原性糖含量在水澇脅迫下先增多，而后再減少。研究認(rèn)為歐李葉片內(nèi)還原性糖的變化，使歐李對(duì)水澇脅迫產(chǎn)生了抗性。

關(guān)鍵詞： 歐李；水澇脅迫；硫酸苯酚法；還原性糖

中圖分類號(hào)：S662.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.06.003

Changes of the Reducing Sugar in Prunus humilis Leaves under Waterlogging Stress

LI Lixia1， CHENG Xiaoai2， ZHANG Haiping1

（1.Dingxiang County State Forest of Shanxi Province， Dingxiang， Shanxi 035400，China； 2.Taigu County Agricultural Commission， Taigu， Shanxi 030801，China）

Abstract： The changes of the reducing sugar in leaves of Prunus humilis were studied. Reducing sugar was isolated from leaves of Prunus humilis， and changes of the reducing sugar was detected by the method of phenol- sulfuric acid in the waterlogging stress. The results showed that the content of the reducing sugar was increased in the early stage but decreased in the later during waterlogging stress. The changes of reducing sugar could reflect the physiological changes and this can provide theoretical basis for introducing the Prunus humilis.

Key words： Prunus humilis； waterlogging stress； phenol-sulfuric acid method； reducing sugar

隨著全球氣候不斷上升，海嘯、洪水等災(zāi)害的爆發(fā)頻率不斷增加，世界各國(guó)在防澇抗洪、水土保持等問(wèn)題的研究上注入大量金錢和精力。我國(guó)一直以來(lái)都是個(gè)洪澇災(zāi)難比較嚴(yán)重的國(guó)家，有將近2/3的土地受到不同程度的澇害，嚴(yán)重影響我國(guó)國(guó)民的生活[1]。植物對(duì)水分的需求有一定的標(biāo)準(zhǔn)，水分過(guò)多或者過(guò)少都會(huì)對(duì)植物的新陳代謝、光合作用等造成一定的影響。植物過(guò)度地受到水澇脅迫，可能使其發(fā)芽率降低、生長(zhǎng)不好，甚至爛苗[2]，并且水澇脅迫會(huì)嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，使其遺傳潛力難以發(fā)揮。水澇脅迫不但影響植物的產(chǎn)量，而且限制了植物的廣泛分布。因而，開展植物水澇脅迫研究，可以了解和研究植物對(duì)水澇脅迫的響應(yīng)機(jī)制，從而為合理選擇性和定向培育耐澇新品種提供理論依據(jù)。

歐李（鈣果）Prunus humilis Bunge. 屬于薔薇科，李屬（Prunus.L），是中國(guó)特有的一個(gè)薔薇科櫻桃屬灌木樹種，野生地區(qū)主要包括中西部地區(qū)的山西、陜西、河北、內(nèi)蒙以及東北等地。歐李（鈣果）作為這種植物的專業(yè)名字是植物分類學(xué)家陳嶸先生命名的。

歐李（鈣果）的推廣發(fā)展前景好，作為我國(guó)特有的一個(gè)野生經(jīng)濟(jì)植物具備產(chǎn)業(yè)化開發(fā)潛力。人們對(duì)鈣、對(duì)鐵、對(duì)方便綠色飲料日漸增長(zhǎng)的普遍需求，為歐李（鈣果）深加工提供了極為廣闊和可能的發(fā)展前景，給醫(yī)療保健和食品飲料業(yè)提供了無(wú)限的商機(jī)。在對(duì)歐李（鈣果）研究時(shí)發(fā)現(xiàn)：歐李（鈣果）果汁、果酒、果脯等消費(fèi)必將普及且長(zhǎng)久不衰；鈣果的種仁具有消腫、利尿、通便的功能，是一種很好的藥材，藥材市場(chǎng)收購(gòu)價(jià)格不扉，醫(yī)藥工業(yè)也可以進(jìn)行加工；其果實(shí)中含有多種對(duì)人體有益的礦質(zhì)元素，尤其是鈣的含量比一般的水果高，為了突出其鈣含量高的特點(diǎn)，便誕生了其商品名“鈣果”。

中國(guó)中西部地區(qū)廣大廉價(jià)的荒山荒坡，使好栽易活易結(jié)實(shí)的歐李（鈣果）大面積種植成為可能，為其深加工提供了豐富的生產(chǎn)原料，同時(shí)，巨大的市場(chǎng)需求也給加工業(yè)注入了足夠的動(dòng)力，歐李（鈣果）要產(chǎn)業(yè)化也將成為越來(lái)越多人士的共識(shí)。鈣果的莖葉可以喂牛，可以利用其生物量大的特點(diǎn)，帶動(dòng)畜牧業(yè)的發(fā)展。相信我國(guó)在歐李（鈣果）的規(guī)模發(fā)展之后，將會(huì)在歐李加工產(chǎn)業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、畜牧業(yè)及種苗業(yè)等方面形成系統(tǒng)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的良好局面。

在歐李等植物中，糖是一切物質(zhì)代謝的基礎(chǔ)，因此，本論文研究歐李（鈣果）葉片內(nèi)還原性糖的變化。在糖類中，能夠還原斐林（H.von Fehling）試劑或托倫斯（B.Tollens）試劑的糖稱為還原糖。所有的單糖（除二羥丙酮），不論醛糖還是酮糖，都是還原糖。大部分雙糖也是還原糖，蔗糖例外。斐林試劑是含Cu2+ 絡(luò)合物的溶液，還原性糖被還原后得到磚紅色Cu2O的沉淀。苯酚-硫酸法利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，它們都可以用來(lái)鑒定和測(cè)量還原性糖的含量，并且它們各有優(yōu)缺點(diǎn)[3]。所以，分子結(jié)構(gòu)中含有還原性基團(tuán)（如游離醛基或游離酮基基）的糖，叫還原糖。還原性糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖等，都是光合作用的產(chǎn)物，是一切物質(zhì)代謝的基礎(chǔ)。研究表明，植物體內(nèi)的還原性糖是植物進(jìn)行呼吸、光合等能量交換和新陳代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育與抗性緊密相關(guān)[4]。近年來(lái)，學(xué)者對(duì)其在苗木水澇脅迫過(guò)程中所起的作用進(jìn)行了研究：隨著水澇脅迫的加深，花旗松、馬尾松、北美喬松苗木針葉內(nèi)還原性糖的含量呈上升趨勢(shì)[5]；荔枝葉片內(nèi)還原性糖含量增加[6]；通過(guò)多經(jīng)濟(jì)作物葡萄[7]、櫻桃[8]、蘋果[9]等樹的研究表明，水澇脅迫能使還原性糖在植物體內(nèi)積累，從而使植物在水澇脅迫下能夠適應(yīng)并產(chǎn)生抗性。

由于國(guó)內(nèi)外很少對(duì)歐李這一經(jīng)濟(jì)植物進(jìn)行研究，因此，筆者對(duì)歐李葉片在水澇脅迫下的還原性糖、可溶性蛋白、SOD、POD等的變化進(jìn)行試驗(yàn)。硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法由于方法簡(jiǎn)單、快速，試驗(yàn)成本較低，且無(wú)需多糖純品等優(yōu)點(diǎn)被廣泛采用。本試驗(yàn)采用硫酸-苯酚法。傳統(tǒng)的硫酸-苯酚定糖法中，由于平行樣板間的吸光度值相差太大，使其檢測(cè)的結(jié)果重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性較差，也容易出現(xiàn)誤差，因此，用改進(jìn)的硫酸-苯酚定糖法[10]。苯酚-硫酸法是利用硫酸在高溫下使多糖水解并形成糖醛，糖醛在與苯酚形成穩(wěn)定的顯色，生成橙黃色化合物[11]，然后再以比色法測(cè)定。測(cè)定的還原性糖吸光度OD值，再通過(guò)硫酸-苯酚定糖法測(cè)定還原性糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線差的還原性糖的含量，就可以計(jì)算出水澇條件下歐李葉片內(nèi)還原性糖的變化。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)樣品

盆栽歐李（成都大學(xué)提供）10株，均分成試驗(yàn)組和對(duì)照組2組，試驗(yàn)組水澇脅迫（雙套盆法），對(duì)照組空白對(duì)照，放置于實(shí)驗(yàn)室向陽(yáng)處。

1.2 試驗(yàn)儀器和藥品

7200可見分光光度計(jì)。蔗糖、硫酸、苯酚均為分析純。

1.3 試驗(yàn)試劑的配制

（1）100 μg·L-1蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。精密稱取蔗糖（105 ℃干燥至恒質(zhì)量）0.05 g，加入蒸餾水溶解，用蒸餾水定容于500 mL容量瓶中，備用。（2）顯色液的配制。將50 mL濃硫酸緩緩加入蒸餾水中，冷卻至室溫，加入0.6 g苯酚晶體使其溶解配成顯色液。然后置于錐形瓶中，備用。

1.4 還原性糖的提取

（1）樣品處理。將10顆盆栽歐李平均分成兩組：一組根全部浸入水中，編號(hào)為試驗(yàn)組；一組放入正常條件下，編號(hào)為對(duì)照組，將其放入實(shí)驗(yàn)室向陽(yáng)處。24 h后開始取材，摘取試驗(yàn)組的歐李葉片用剪刀粉碎混勻，精確稱取0.1～0.3 g（精確到0.000 1 g）3份樣品分別裝入試管中，編號(hào)為1、2、3；用同樣的方法摘取對(duì)照組的歐李葉片，粉碎混勻，稱取0.1～0.3 g 3份分別裝入試管中，編號(hào)為4、5、6。

（2）還原性糖的提取。于上述的試管中加入2～3 mL蒸餾水，用封袋封住試管口，放入水浴鍋內(nèi)蒸餾45 min后，放入冷水浴中冷卻至室溫，用漏斗過(guò)濾，分別收集濾液于25 mL錐形瓶中編號(hào)為1、2、3、4、5、6重復(fù)此操作3次。將3次得到的編號(hào)分別位1、2、3、4、5、6中的漏液收集，定容于25 mL容量瓶并編號(hào)為1、2、3、4、5、6，制成待測(cè)液，備用。

1.5 還原性糖的顯色

（1）還原性糖的顯色處理。另取6只試管，編號(hào)為7、8、9、10、11、12。再?gòu)木幪?hào)1、2、3、4、5、6容量瓶取0.05 mL樣品待測(cè)液，分別加入試管7、8、9、10、11、12中。再于試管中加入0.25 mL顯色液，振蕩混勻后，放入沸水浴中保溫30～35 min，再放入冷水浴中冷卻至室溫，備用。

（2） 測(cè)定還原性糖的吸光度OD值。將試管7、8、9、10、11、12中的樣品待測(cè)液，用490 nm分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度OD值，并記錄數(shù)據(jù)。

1.6 計(jì)算方法

利用M=（C×V）/（W×106）×100%，可以計(jì)算出歐李葉片中可溶性糖的含量百分比。式中V為樣品待測(cè)液的總體積；C為樣品提取液的還原性糖的密度；W為植物鮮質(zhì)量；M為可溶性糖含量的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸-苯酚定糖法測(cè)定還原性糖的結(jié)果

按表1制作還原性糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1。試驗(yàn)測(cè)得歐李葉片內(nèi)還原性糖的變化如表2。

試驗(yàn)期間陽(yáng)光等其它不定因素的變化如表3。

2.2 歐李葉片中還原糖的含量變化

通過(guò)試驗(yàn)測(cè)得歐李葉片吸光度OD值，從圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得歐李葉片的還原性糖含量，統(tǒng)計(jì)得歐李葉片內(nèi)還原糖的含量百分比M的變化。從圖2中可以看出：（1）試驗(yàn)開始的72 h試驗(yàn)組歐李葉片內(nèi)還原性糖百分含量分別是13.67%，40.24%，26.95%，而對(duì)照組歐李葉片內(nèi)還原性糖的百分含量分別是26.13%，27.42%，31.33%，即試驗(yàn)組歐李葉片的含糖百分比先增加然后減少，而對(duì)照組歐李葉片的含糖百分比幾乎不變；（2）試驗(yàn)開始后72 h試驗(yàn)組歐李葉片內(nèi)還原性糖的百分含量分別是30.72%，38.26%，37.13%，而對(duì)照組歐李葉片內(nèi)還原糖百分含量分別為30.70%，44.56%，39.79%，可以看出試驗(yàn)組和對(duì)照組都發(fā)生了變化，且變化狀況都相似，即試驗(yàn)組和對(duì)照組歐李葉片中的含糖百分比都是先增加再減少。

3 結(jié)論與討論

從結(jié)果分析中知，試驗(yàn)的前期階段在未受到陽(yáng)光等環(huán)境因素影響下，水澇脅迫引起的歐李葉片內(nèi)淀粉減少，還原性糖增加，其主要生理作用是還原性糖參加歐李葉片內(nèi)滲透調(diào)節(jié)[12-13]。植物的滲透作用使歐李等植物適應(yīng)環(huán)境，增強(qiáng)抗逆性的基礎(chǔ)[14]。還原性糖增加的主要原因有幾點(diǎn)。（1）歐李在水澇脅迫下，使根缺氧，根缺氧會(huì)影響葉片的光合作用，這首先導(dǎo)致葉片氣孔關(guān)閉，增大CO2向葉片擴(kuò)散的阻力，繼而影響相關(guān)酶的活性[15-17]。（2）淀粉等糖的主動(dòng)水解，以維持樹木、葉片等體內(nèi)的滲透勢(shì)，保持其生理代謝功能的正常進(jìn)行。（3）水澇對(duì)植物造成脅迫，使可溶性糖不能被光合作用正常利用，造成可溶性糖的積累[15]。研究表明，還原性糖的積累是反抗水澇脅迫的有效指標(biāo)之一[16]。

在水澇脅迫下，歐李葉片內(nèi)還原性糖先增加后減少，可以看出植物對(duì)水澇脅迫的適應(yīng)性。植物對(duì)水澇脅迫的適應(yīng)性——抗性，有兩種方式。（1）避逆性：植物在水澇脅迫中，能夠建立起某種屏障，完全或者部分阻止脅迫因子進(jìn)入它的內(nèi)部，以避免脅迫因子對(duì)它造成傷害。（2）耐逆性：植物在水澇脅迫中，能夠完全或者部分忍受脅迫因子對(duì)它造成的傷害，而不至于受到脅迫的傷害，或引起比較小的傷害[17]。

在水澇脅迫下，可使歐李發(fā)生生理和結(jié)構(gòu)的變化，得出植物對(duì)水澇脅迫的耐性。（1）水澇脅迫下，植物由于缺氧其呼吸代謝以乙醇發(fā)酵為主，中間產(chǎn)物乙醛和末端產(chǎn)物乙醇過(guò)多積累對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒素，一些植物可以通過(guò)其它代謝途徑，如蘋果酸發(fā)酵、乳酸發(fā)酵等代替乙醇發(fā)酵，減少乙醛、乙醇等積累以減少傷害，適應(yīng)缺氧環(huán)境[18-21]。（2）水澇脅迫下，一些對(duì)水澇脅迫敏感的植物的無(wú)氧呼吸加強(qiáng)，有氧呼吸下降，有氧呼吸的場(chǎng)所中線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的變化，內(nèi)膜消失，內(nèi)膜脊腫脹，形狀不規(guī)則。（3）水澇脅迫下，一些對(duì)水澇適應(yīng)較好的植物，一方面可以加快體內(nèi)乙烯的合成，另一方面在體內(nèi)擴(kuò)散能力減少。與此同時(shí)，土壤厭氧微生物釋放的乙烯被植物吸收，而乙烯對(duì)植物沒(méi)有毒害作用，反而可以增加植物適應(yīng)水澇環(huán)境。（4）水澇脅迫下，有些植物的某些基因才能夠完全表達(dá)，這能夠使植物適應(yīng)水澇環(huán)境[17]。

試驗(yàn)后期階段，由于歐李受到陽(yáng)光等不定因素變化的影響，使其葉片內(nèi)還原性糖變化受到影響。由于陽(yáng)光等的變?nèi)?，使葉片的蒸騰作用減弱，葉片氣孔關(guān)閉，光合作用減弱，葉片為了維持其滲透勢(shì)，加快多糖等的水解，使還原性糖增加。

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