胡利群，劉俞君，郭利偉，楊小林，劉國平

（1. 長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；2. 中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125）

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豬水腫病新型亞單位菌苗對小鼠的效力研究

胡利群1，劉俞君2，郭利偉1，楊小林1，劉國平1

（1. 長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；2. 中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125）

摘 要：利用大腸桿菌表達(dá)豬水腫病大腸桿菌的水腫毒素SLT-IIeB，提取表達(dá)產(chǎn)物包涵體，再加入自行分離的我國流行的豬水腫病大腸桿菌Ee株（O139），和油乳佐劑乳化后制成亞單位菌苗，免疫昆明鼠，間隔2 w加強(qiáng)免疫1 次。每次免疫后采血檢測毒素的ELISA 抗體和Ee株的凝集效價，第2次免疫2 w后用5LD50的豬水腫病大腸桿菌Ee株進(jìn)行攻毒。結(jié)果顯示，亞單位菌苗組與滅活菌苗組ELISA抗體水平有顯著性差異，兩種疫苗對Ee的保護(hù)力分別為90%和70%。本研究表明新型亞單位菌苗模式對同型菌株具有較好的保護(hù)力，為進(jìn)一步研制高效的亞單位菌苗打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：分泌毒素表達(dá)蛋白；亞單位菌苗；小鼠；保護(hù)力

豬水腫病由特定血清型的產(chǎn)類志賀氏毒素大腸桿菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，SLTEC）引起，多發(fā)生于斷奶后仔豬，現(xiàn)已成為危害規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一[1-4]。SLT-IIe是致仔豬水腫病的產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌（SLTEC）的主要毒力因子。致豬水腫病大腸桿菌SLTEC以其菌毛F18ab（F107）黏附于小腸上皮細(xì)胞，定居和繁殖的細(xì)菌在腸內(nèi)產(chǎn)生SLT-IIe并被吸收，SLT-IIe通過B亞基與腸上皮細(xì)胞的Gb4受體發(fā)生特異性結(jié)合，介導(dǎo)A亞基進(jìn)入細(xì)胞核糖體，A亞基具有N-糖苷酶活性，特異性地切斷28S rRNA 5'端4324位腺嘌呤的N-糖苷鍵，腺嘌呤殘基因此脫落，使延伸因子EF-1的氨基?；痶RNA不能與60S核糖體亞基結(jié)合，從而阻斷了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，造成代謝功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5-7]。

預(yù)防和治療水腫病的一般原則是盡量降低腸道內(nèi)病原性大腸桿菌的數(shù)量，然而由于抗生素的濫用，導(dǎo)致了耐藥菌株的出現(xiàn)，因而預(yù)防該病的最好方法為免疫接種。隨著人們對仔豬水腫病致病機(jī)理的深入了解，有學(xué)者提出預(yù)防水腫病的發(fā)生，理想的疫苗不僅應(yīng)保護(hù)仔豬抵抗大腸桿菌的附著，同時也應(yīng)保護(hù)仔豬免受其產(chǎn)生的SLT-IIe的攻擊。而目前國內(nèi)用于預(yù)防該病的主要是滅活菌苗，其主要考慮的是O抗原，免疫效果并不穩(wěn)定。國外學(xué)者用純化的SLT-IIe類毒素主動免疫和SLT-IIe高免血清被動免疫后攻毒，取得了令人滿意的免疫效果[8,9]。這說明研制以SLT-IIeB為免疫原來預(yù)防該病是可行的，而利用大腸桿菌的培養(yǎng)物上清液來提取毒素的傳統(tǒng)方法成本較高，而且由于水腫毒素B亞單位分子量小，分離與純化比較困難，不適合大規(guī)模生產(chǎn)的需要。因此，我們以3拷貝的基因工程重組蛋白SLTIIeB代替天然毒素，同時考慮菌體及毒素的保護(hù)力，將基因工程重組蛋白與滅活菌體混合制備亞單位菌苗，探詢亞單位菌苗對小鼠的保護(hù)力，為豬水腫病大腸桿菌新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1質(zhì)粒及菌種 豬水腫病大腸桿菌Ee株，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存[10]；pGEX-KG表達(dá)載體和BL21 （DE3）宿主菌為本試驗(yàn)室保存，表達(dá)3拷貝SLTIIeB的BL21（DE3）菌株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[11]。

1.2主要試劑 弗氏不完全佐劑、SKL（N-lanrayl sarcosine NaSalt， 十二烷基肌胺酸鈉)）購自Sigma公司；IPTG 購自Promega 產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購自SouthernBiotech 公司；溶菌酶以及氧化型、還原型谷胱甘肽購于北京原平皓生物技術(shù)有限公司。

1.3試驗(yàn)動物 6 w雌性SPF昆明系小鼠，購自湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，共56只，隨機(jī)分成4組，每組14只。其中每組4只用于抗體水平檢測，其余10只用于攻毒試驗(yàn)。

1.4細(xì)菌培養(yǎng)及計(jì)數(shù) 大腸桿菌Ee種子菌劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，選取典型菌落接種TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期時（OD600= 0.6～1.0）。每1000mL培養(yǎng)液接種100μL種子菌液，培養(yǎng)24 h后測定菌液OD值，計(jì)算菌體總數(shù)。

1.53拷貝SLT-IIeB基因的表達(dá)與純化 取甘油保存的含有目的質(zhì)粒的BL21菌株，接種細(xì)菌瓶小量培養(yǎng)過夜，d 2按1:100的比例接種大瓶，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期時（OD600= 0.6～1. 0），加入IPTG 至終濃度為1 mmol/ L，進(jìn)行3 h的誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)菌體用高頻超聲波處理數(shù)次，離心后將沉淀的包涵體溶解于含0.6 %SKL 的TE中，室溫靜置0.5～2h 后離心，取上清進(jìn)行透析復(fù)性。取樣進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮蘭（R250）染色鑒定包涵體的純度。蛋白質(zhì)濃度用紫外分光光度計(jì)測定。

1.6疫苗的制備及免疫 疫苗種子菌Ee株的培養(yǎng)按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行，培養(yǎng)后離心，加入甲醛磷酸鹽緩沖液進(jìn)行滅活。之后把滅活好的Ee株菌體和表達(dá)蛋白按一定的比例混合，進(jìn)行乳化制苗，稱為亞單位菌苗（其中每毫升含Ee株10億，含水腫毒素表達(dá)蛋白約100μg）。同時制備單價Ee株菌滅活苗，菌體濃度與亞單位菌苗相同。將制備的亞單位菌苗與單價苗分點(diǎn)進(jìn)行皮下注射免疫小鼠，間隔2 w后加強(qiáng)免疫1 次。對照組用PBS 緩沖液乳化后同樣進(jìn)行接種。一免后隔周采集血清，每次采集血清后，將同一組血清等量混合，采用間接ELISA及菌體凝集試驗(yàn)分別檢測各組的毒素平均抗體水平及菌體平均凝集效價。

1.7抗體的檢測 毒素的抗體按文獻(xiàn)[11]自行建立ELISA方法進(jìn)行檢測。Ee株菌體抗體的檢測按微量凝集試驗(yàn)進(jìn)行[12]。

1.8小鼠感染試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[10]測定Ee株的LD50，以1.3×109CFU（5LD50）劑量的大腸桿菌Ee株對小鼠進(jìn)行腹腔攻毒。攻毒后15 d內(nèi)定期觀察實(shí)驗(yàn)鼠的臨床表現(xiàn)并記錄。

2　結(jié)果

2.1毒素包涵體的提取 取表達(dá)產(chǎn)物的包涵體，進(jìn)行變性和復(fù)性，取少量進(jìn)行SDS-PAGE 電泳以檢測其純度。結(jié)果如圖1，箭頭所指的分別為表達(dá)3拷貝SLT-IIeB融合蛋白，大小約為56 kDa 。

圖1　表達(dá)毒素包涵體的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 1 The SDS-PAGE results of the expressedSLT-IIeB inclusion body1、2: 包涵體; 3: 蛋白分子標(biāo)記1,2 : SLT-IIeB inclusion body; 3: Protein Marker (蛋白質(zhì)標(biāo)記)

2.2兩次免疫后的抗體水平變化 首免2 w后對小鼠進(jìn)行斷尾采血，檢測SLT-IIeB的ELISA 抗體及菌體凝集價。亞單位菌苗組平均抗體水平陽性，滅活菌苗組平均抗體水平為陰性，菌體抗體凝集價兩組均為1:4。第2 次免疫2 w后檢測結(jié)果顯示，亞單位菌苗組ELISA平均抗體水平達(dá)到最高，滅活菌苗組ELISA平均抗體水平為陽性并呈下降趨勢，菌體抗體凝集價均為1:32。首免和二免的具體情況見圖2、3?？梢钥吹?，二免后亞單位菌苗及滅活菌苗免疫組的ELISA平均抗體水平及凝集價在二疫后升高，并處于一個較高的水平，滅活疫苗組的ELISA抗體水平全部陽轉(zhuǎn)，但抗體水平較低（圖2）。菌體凝集價亞單位菌苗組的菌體凝集價的峰值較滅活菌苗組要高（圖3）。

2.3攻毒的結(jié)果 二免2 w后試驗(yàn)組和對照組分別用5LD50Ee株進(jìn)行攻毒。對照組的小鼠于12 h內(nèi)全部死亡，小鼠腹腔注射4～12h后發(fā)病，眼瞼、面部水腫，伴隨著共濟(jì)失調(diào)、麻痹或驚厥等神經(jīng)癥狀。剖檢發(fā)現(xiàn)肺有出血點(diǎn)，肝脾腫大，腸系膜和胃壁漿液性水腫，腸明顯水腫，且有出血現(xiàn)象。心、肝、脾、心血、腦脊液等分離到感染菌。試驗(yàn)組中亞單位菌苗組在攻毒后1只小鼠6 h后死亡，其余小鼠攻毒后24 h 精神沉郁，不食，扎堆，之后逐步恢復(fù)正常，d 3時和攻毒前無異，保護(hù)率為90%（9/10）。滅活菌苗組于攻毒后6～12 h 內(nèi)死亡3 只，其他小鼠攻毒后24 h 精神沉郁，不食，扎堆，之后逐步恢復(fù)正常，觀察到d 3和攻毒前無異，保護(hù)率為70% （7/10）。

圖2　免疫后SLT-IIeB ELISA抗體水平檢測Fig. 2 ELISA IgG titres against SLT-IIeB after fi rst immunization (mean OD630)

圖3　免疫后菌體凝集價檢測Fig. 3 Agglutination titers after fi rst immunization

表1 免疫后小鼠攻毒保護(hù)率結(jié)果Table 1 Immunization protection rate

3　討論

豬水腫病在世界各地都有發(fā)生，我國也常見報道，是多年來困擾我國養(yǎng)豬業(yè)的問題之一。本病呈地方性流行，或零星散發(fā)。在發(fā)病的豬群中，發(fā)病率為30～40%，死亡率可達(dá)80%～100%。該病主要發(fā)生在斷乳后1～2 w的仔豬，尤其在發(fā)育良好的仔豬群，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，是斷奶仔豬危害較嚴(yán)重的疾病。豬群發(fā)病率不高，但死亡率很高，雖然除了疫苗接種外也有一些防控措施，但效果并不明顯，因而研制高效的疫苗成為控制此病的首選。

豬水腫病大腸桿菌雖然血清型較為特定，但主要血清型也有十幾種之多，這給該病的防制帶來了難度，傳統(tǒng)的滅活菌苗對于此病的防治顯然不夠。鑒于豬水腫病大腸桿菌的致病因子比較固定（SLTIIe及F18），而水腫毒素SLT-IIe是引起水腫癥狀的直接致病因子，其B亞單位（SLT-IIeB）無酶活性，是水腫毒素的保護(hù)性抗原，因此SLT-IIeB對各型間的交叉保護(hù)可能起著重要的作用。因此，同時考慮菌體及毒素的保護(hù)力的新型疫苗有可能是防治豬水腫病的高效疫苗。

致豬水腫病大腸桿菌鄂E株（Ee）是本實(shí)驗(yàn)室從武漢分離的地方菌株，動物致病性試驗(yàn)表明該菌對小鼠有較強(qiáng)的致病性，該菌肉湯培養(yǎng)物的無菌濾液能致死小鼠且剖檢見相關(guān)臟器水腫，并可引起Vero細(xì)胞死亡。靜脈注射斷奶仔豬能復(fù)制典型水腫病癥狀[10]。因此我們選擇Ee株為疫苗候選菌株。水腫毒素B亞單位分子量小，分離與純化比較困難，不適合大規(guī)模生產(chǎn)的需要，利用基因工程的方法則可解決這一問題。經(jīng)過前期的研究發(fā)現(xiàn)，3拷貝SLTIIeB的融合表達(dá)提高了表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性與免疫原性[11]，因此，我們選擇了3拷貝SLT-IIeB的融合表達(dá)產(chǎn)物為候選毒素。

抗體監(jiān)測結(jié)果顯示，水腫毒素B亞單位ELISA抗體水平亞單位菌苗組與普通滅活菌苗有顯著提高，這說明添加的重組蛋白具有生物學(xué)活性，表現(xiàn)了良好的免疫原性。有趣的是亞單位菌苗組菌體凝集價與菌苗雖然趨勢相同，但亞單位菌苗組菌體凝集價相對要高，具體機(jī)制并不清楚，據(jù)推測，可能是因?yàn)檠軆?nèi)皮細(xì)胞具有水腫毒素受體，重組SLT-IIeB促進(jìn)了機(jī)體對疫苗的吸收與應(yīng)答[13]，那么SLT-IIeB是否既是免疫原，同時也發(fā)揮類似佐劑的作用？這有待進(jìn)一步的證實(shí)。

攻毒結(jié)果初步表明，亞單位菌苗組對Ee株的攻擊具有較好的保護(hù)力（90%），表明我們表達(dá)的毒素有望取代天然毒素作為滅活菌苗的成份來提高普通滅活菌苗對于強(qiáng)毒株的保護(hù)。盡管如此，無論是滅活菌苗組還是亞單位疫苗菌苗組對于同型菌株的保護(hù)力均沒有達(dá)到100%的保護(hù)力。這主要與我們的試驗(yàn)設(shè)計(jì)有關(guān)，本試驗(yàn)的目的主要是探討亞單位菌苗的可行性，也就是添加的重組蛋白是否對疫苗的保護(hù)力有顯著性提高，為重組蛋白能否替代天然毒素提供試驗(yàn)支持，因此我們在疫苗制作時選擇了較低的菌體濃度。結(jié)果表明重組蛋白替代天然毒素作為疫苗添加成份及亞單位菌苗在實(shí)踐上是可行的。

總的來說，亞單位菌苗兼具滅活疫苗及基因工程亞單位的優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)踐上具有可操作性，這為進(jìn)一步研制高效的新型豬水腫病大腸桿菌疫苗打下了基礎(chǔ)。

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·研究論文·

PROTECTION OF A GENETIC SUBUNIT BACTERIN AGAINST PORCINE EDEMA DISEASE IN MOUSE MODEL

HU Li-qun1, LIU Yu-jun2, GUO Li-wei1, YANG Xiao-lin1, LIU Guo-ping1

(1. College of Animal Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, China; 2. China Animal Disease Control Center, Beijing 100125, China)

Key words:Porcine edema disease; exotoxin SLT-IIeB; subunit bacterin; protection

Abstract:The exotoxin SLT-IIeB of Escherichia coli Ee strain was expressed in E.coli and purifi ed. The recombinant protein was mixed with inactivated Ee strain and then emulsifi ed with oil adjuvant to prepare a mixed subunit bacterin. Mice were immunized twice at week 0 and 2 and challenged intraperitoneally with virulent Ee strain at week 4. Antibodies were detected in ELISA and agglutination test. After the second immunization, antibody level increased obviously and the immune protection against virulent Ee strain was 70% and 91.7% in subunit bacterin group and whole bacterin group, respectively. In conclusion, the mixed subunit bacterin induced good protection against virulent Ee strain, which was promising for development of a highly effi cacious vaccine against porcine edema disease.

中圖分類號：S852.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1674-6422（2015）06-0057-05

收稿日期：2015-11-02

基金項(xiàng)目：國家863計(jì)劃（2006AA10A206）；湖北省教育廳中青年重點(diǎn)項(xiàng)目（No. D20121205）

作者簡介：胡利群，女，博士生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

通信作者：劉國平，E-mail：hhaaiieerr@163.com