孫　平，　肖　樂(lè)，　龔昆梅△,　王昆華

(1昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 2云南省第一人民醫(yī)院， 3昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650034)

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應(yīng)用微陣列芯片分析糖尿病大鼠下肢動(dòng)脈硬化miRNAs差異表達(dá)譜*

孫平1，肖樂(lè)2，龔昆梅2△,王昆華3

(1昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2云南省第一人民醫(yī)院，3昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650034)

[摘要]目的： 通過(guò)建立糖尿病大鼠模型，檢測(cè)糖尿病大鼠動(dòng)脈硬化下肢與糖尿病大鼠無(wú)動(dòng)脈硬化下肢的動(dòng)脈組織中微小RNAs(miRNAs)的差異表達(dá)情況，探究異常表達(dá)的miRNAs參與糖尿病大鼠下肢動(dòng)脈硬化可能的分子機(jī)制。方法: 選取建模成功的患有糖尿病下肢動(dòng)脈硬化和患有糖尿病但無(wú)下肢動(dòng)脈硬化的大鼠，取出下肢動(dòng)脈組織，分別提取總的miRNAs，用miRNAs微陣列芯片進(jìn)行雜交檢測(cè)，經(jīng)過(guò)芯片掃描和數(shù)據(jù)分析，再用RT-qPCR驗(yàn)證芯片的掃描分析結(jié)果，最終獲得糖尿病大鼠下肢動(dòng)脈硬化的miRNAs差異表達(dá)譜。結(jié)果: 篩選出10個(gè)與糖尿病大鼠下肢動(dòng)脈硬化有關(guān)的miRNAs，即 rno-miR-206-3p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-133b-3p、rno-miR-133a-3p、rno-miR-325-5p、rno-miR-675-3p、rno-miR-411-5p、rno-miR-329-3p、rno-miR-335和rno-miR-126a-3p，這10個(gè)異常表達(dá)的mi-RNAs都上調(diào)。RT-qPCR證實(shí)，其中9個(gè)miRNAs與芯片檢查結(jié)果一致，僅僅rno-miR-335的PCR檢測(cè)結(jié)果與基因芯片檢測(cè)結(jié)果相反，表達(dá)下調(diào)。結(jié)論: 有一群miRNAs在糖尿病大鼠下肢動(dòng)脈硬化中起著重要作用，其表達(dá)過(guò)程很可能影響著動(dòng)脈硬化的進(jìn)程。

[關(guān)鍵詞]微小RNAs； 微陣列； 糖尿病； 下肢動(dòng)脈硬化

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類21～25 個(gè)核苷酸組成的，不編碼蛋白質(zhì)的，多物種高度保守性、時(shí)序性和組織特異性表達(dá)的，通過(guò)抑制靶mRNA翻譯或促其降解而參與控制基因表達(dá)的非編碼小RNA，作為生物體正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要基因調(diào)控分子備受關(guān)注?，F(xiàn)在許多研究證實(shí)，糖尿病、多種腫瘤、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化等都存在miRNAs的異常表達(dá)或缺失[1-7]，miRNAs很可能參與了這些疾病發(fā)生的基因調(diào)控。臨床中發(fā)現(xiàn)許多糖尿病下肢動(dòng)脈硬化病人，表現(xiàn)為間隙性跛行、休息痛和缺血性壞疽，與單純的僅患有下肢動(dòng)脈硬化的病人比較，病情嚴(yán)重，更加不易治療，治療效果差，容易反復(fù)。為了準(zhǔn)確了解其發(fā)病機(jī)制，做好對(duì)糖尿病下肢動(dòng)脈硬化的有效預(yù)防和治療，我們搜索了相關(guān)文獻(xiàn)，可是迄今為止尚未見到有關(guān)miRNAs表達(dá)譜在糖尿病下肢動(dòng)脈硬化中被研究及臨床應(yīng)用的報(bào)道。因此為了補(bǔ)充這方面研究，我們首先建立動(dòng)物模型，選取建模成功的患有糖尿病下肢動(dòng)脈硬化(diabetic rats with lower limb arteriosclerosis，DAS)和患有糖尿病但無(wú)下肢動(dòng)脈硬化(diabetic rats with normal lower limb，DN)的大鼠，利用微陣列技術(shù)平臺(tái)[8-10]，在髂動(dòng)脈組織中篩查miRNAs異常表達(dá)譜，為進(jìn)一步研究miRNAs與人患有糖尿病下肢動(dòng)脈硬化的發(fā)病關(guān)系提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1材料

SD大鼠購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。微陣列芯片選取建模成功后的DN大鼠3只和DAS大鼠3只，DN為對(duì)照組，DAS為實(shí)驗(yàn)組。根據(jù)用于RNA抽提的組織樣品采集規(guī)范流程分別采取其下肢動(dòng)脈組織，迅速置于液氮中(-196 ℃)，用于以后分子實(shí)驗(yàn)。miRNAs微陣列芯片和質(zhì)控探針由Affymetrix提供，采用的芯片型號(hào)為Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 Array，其miRNA探針序列信息來(lái)源于最新Sanger miRBase 20.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)，數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了來(lái)自約40篇新文獻(xiàn)報(bào)道的3 355條新的發(fā)夾前體序列和5 393條新的成熟體miRNA，其中大鼠miRNA增至728條。

2方法

2.1樣本總miRNA的抽提根據(jù)Invitrogen TRIzol說(shuō)明書分別提取DN大鼠和DAS大鼠的總RNA，然后用QIAGEN RNeasy Mini Kit進(jìn)行純化，將總RNA通過(guò)微離心過(guò)濾柱得到miRNA，樣品量至少2 μg。

2.2樣本總miRNA質(zhì)量檢測(cè)(1) NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品總miRNA在260 nm和280 nm下的吸光度(A)值，檢測(cè)miRNA濃度和純度，按以下公式計(jì)算總 RNA 的濃度，即總 RNA 濃度(mg/L)=A260×稀釋倍數(shù)×40 mg/L，以A260/A280值來(lái)檢測(cè)總RNA 的純度，A260/A280值在 1.9～2.1之間時(shí)，可認(rèn)為 RNA 的純度較好。(2) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)miRNA的完整性，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，28S和18S核糖體RNA條帶非常亮而濃，上面一條帶(28S)的密度大約是下面一條帶(18S)的2倍。

2.3樣品miRNA熒光標(biāo)記進(jìn)行Poly (A) 加尾，F(xiàn)lashTag Biotin HSR 連接，生物素標(biāo)記。

2.4微陣列芯片雜交、芯片掃描及數(shù)據(jù)分析把生物素標(biāo)記好的樣品加入到配置好的雜交液中(2×hybridization， 27.5% formamide， DMSO， 20× eukaryotic hybridization controls， control oligonucleotide B2)，離心PCR孵育后再離心，將雜交液注入芯片中，把芯片放在雜交爐架子上后放在雜交爐里雜交，每個(gè)樣品單獨(dú)雜交一張芯片。經(jīng)過(guò)一番洗滌操作后，把芯片放在 Affymetrix 的掃描儀中，點(diǎn)擊Affymetrix Launcher 中的 AGCCScan Control，點(diǎn)擊工具欄中的 Start進(jìn)行芯片掃描生成CEL原始數(shù)據(jù)文件數(shù)據(jù)，然后運(yùn)用Array-Pro(MediaCyber-netics)軟件對(duì)雜交圖像進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)換，獲得實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組檢測(cè)信號(hào)的比值(log2)和t檢驗(yàn)的P值，篩選出有意義的差異表達(dá)miRNAs。其中為了得到芯片合理準(zhǔn)確的質(zhì)量評(píng)估，對(duì)每種類型的樣本進(jìn)行不少于3次重復(fù)，同時(shí)為了保證芯片在探針集水平的評(píng)估結(jié)果，芯片內(nèi)每個(gè)探針雜交布置5個(gè)重復(fù)，所得數(shù)據(jù)用SAM法進(jìn)行分析[11]。

2.5RT-qPCR驗(yàn)證查閱相關(guān)文獻(xiàn)[12]根據(jù)miRNA基因芯片檢測(cè)結(jié)果，對(duì)篩選出的差異表達(dá)的10個(gè)miRNA進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，內(nèi)參照選擇snRNA U6(表1)。cDNA序列的翻譯、酶切位點(diǎn)分析、引物設(shè)計(jì)以及擴(kuò)增產(chǎn)物、熔解曲線都是運(yùn)用生物分析軟件DNAMAN(5.0版)所得。反轉(zhuǎn)錄程序: 25 ℃ 5 min； 50 ℃ 60 min； 70 ℃ 15 min。PCR反應(yīng)程序(擴(kuò)增和熔解曲線): 95 ℃ 10 s； 60 ℃ 30 s， 70 ℃ 45 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。在PCR反應(yīng)體系中加入過(guò)量SYBR染料，按Ct值來(lái)計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)水平。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1總RNA提取質(zhì)量分析

瓊脂糖凝膠電泳后有清晰的28S和18S兩條條帶，上面一條帶(28S)的密度大約是下面一條帶(18S)的2倍，低分子量RNA(tRNA和5S核糖體RNA等)條帶微弱。由表2可知，所測(cè)RNA總量和濃度滿足儀器上樣(miRNA芯片要求：濃度不低于50 mg/L，總量不低于1 μg)，A260/A280值介于1.9～2.1之間，質(zhì)檢綜合評(píng)定合格，可以繼續(xù)進(jìn)行miRNA芯片檢測(cè)。

表1　用于RT-qPCR驗(yàn)證的引物序列

R： reverse； F： forward.

表2　總RNA樣本質(zhì)檢報(bào)告

2miRNA微陣列芯片表達(dá)譜分析結(jié)果

微陣列芯片雜交結(jié)果分析顯示，與患有糖尿病但無(wú)下肢動(dòng)脈硬化的大鼠相比，患有糖尿病下肢動(dòng)脈硬化的大鼠下肢動(dòng)脈組織中異常表達(dá)的miRNA有10個(gè)，分別是rno-miR-206-3p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-133b-3p、rno-miR-133a-3p、rno-miR-325-5p、rno-miR-675-3p、rno-miR-411-5p、rno-miR-329-3p、rno-miR-335和rno-miR-126a-3p，均為表達(dá)上調(diào)，其中上調(diào)明顯的是rno-miR-206-3p、rno-miR-133a-5p和rno-miR-675-3p，見圖1、表3。

3RT-qPCR驗(yàn)證miRNA基因芯片差異表達(dá)譜結(jié)果

miRNA基因芯片中這10種miRNA在組織中表達(dá)差異較大，相比DN，都在DAS組織中表達(dá)上調(diào)。運(yùn)用RT-qPCR技術(shù)對(duì)miRNA基因芯片篩選出差異表達(dá)的10個(gè)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證工作，設(shè)定miRNA在DN組織中表達(dá)量為對(duì)照，計(jì)算miRNA在DAS組織內(nèi)相對(duì)表達(dá)水平(圖2)。對(duì)比DAS與DN miRNA的RT-qPCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果，這10種miRNA的PCR檢測(cè)結(jié)果與基因芯片結(jié)果雖然在數(shù)值上有些差異，但是趨勢(shì)基本一致，僅僅rno-miR-335的PCR檢測(cè)結(jié)果與基因芯片檢測(cè)結(jié)果相反，為表達(dá)下調(diào)，見圖3、表4，所以miRNA芯片結(jié)果基本可靠。RT-qPCR驗(yàn)證也顯示rno-miR-206-3p、rno-miR-133a-5p和rno-miR-675-3p在DAS下肢動(dòng)脈組織高表達(dá)。

Figure 1. Differentially expressed miRNAs detected by microRNA chips. Mean±SD.n=3.

圖1芯片中miRNA的差異表達(dá)

表3　DAS中異常miRNA表達(dá)譜

討論

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，報(bào)道克隆技術(shù)和Northern blot分析技術(shù)也經(jīng)常運(yùn)用于miRNAs的確認(rèn)[13]，且費(fèi)用相對(duì)來(lái)說(shuō)比較低，可是對(duì)大量miRNA的差異表達(dá)譜篩選，二者存在著工作量大，靈敏度低的缺點(diǎn)，難以在單一一次實(shí)驗(yàn)中分析出數(shù)百個(gè)miRNA的差異表達(dá)情況，非常不便于對(duì)差異基因的篩選。隨著能同時(shí)檢測(cè)成百上千差異基因的高通量基因芯片技術(shù)的普及與推廣，我們選擇Affymetrix提供的miRNA基因芯片技術(shù)，采用的芯片型號(hào)為Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 Array，其miRNA探針序列信息來(lái)源于最新Sanger miRBase 20.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)，能夠檢測(cè)約28 700個(gè)注釋完好基因的約31 000個(gè)轉(zhuǎn)錄本。其中為了得到芯片合理準(zhǔn)確的質(zhì)量評(píng)估，每種類型的樣本不少于3次重復(fù)，同時(shí)為了保證芯片在探針集水平的評(píng)估結(jié)果，芯片內(nèi)每個(gè)探針雜交布置5個(gè)重復(fù)，運(yùn)用了μParaflo?技術(shù)，芯片內(nèi)和不同芯片間陣列點(diǎn)的一致性都非常好，所以miRNA芯片是研究大量樣本和樣本中大量miRNA最常用的高通量方法[14-15]。

雖然高通量技術(shù)檢測(cè)出來(lái)的信息穩(wěn)定性差，錯(cuò)誤率高，且費(fèi)用也比較昂貴，但是隨著近幾年基因芯片技術(shù)的發(fā)展，數(shù)據(jù)庫(kù)的增強(qiáng)，芯片數(shù)據(jù)準(zhǔn)確率逐年攀升。因?yàn)樾酒嬖谳^大錯(cuò)誤率，所以還需RT-qPCR和Northern blot實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，對(duì)后續(xù)功能檢測(cè)確定，這個(gè)步驟也是非常關(guān)鍵和必要的。

Figure 2. The expression levels of miRNAs determined by RT-qPCR detection. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs DN.

圖2RT-qPCR檢測(cè) miRNA相對(duì)表達(dá)水平

Figure 3. Comparison of the microarray and RT-qPCR results. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs microarray.

圖3芯片和RT-qPCR結(jié)果的對(duì)比

由于動(dòng)脈硬化具體詳細(xì)的發(fā)病機(jī)制還未闡明，同時(shí)鮮有關(guān)于糖尿病下肢動(dòng)脈硬化的miRNA差異表達(dá)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)率先將miRNA芯片技術(shù)應(yīng)用到糖尿病下肢動(dòng)脈硬化發(fā)病機(jī)制的研究中去，做出差異表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)的miRNAs，為研究糖尿病下肢動(dòng)脈硬化發(fā)病機(jī)制提供了重要實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充。本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)自動(dòng)物模型不同的病例樣本，選自所有芯片表達(dá)趨勢(shì)一致的差異miRNA，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性?；蛐酒@示有10個(gè)明顯差異表達(dá)的miRNA，RT-qPCR驗(yàn)證與芯片趨勢(shì)一致，只是rno-miR-335在實(shí)時(shí)定量PCR中表達(dá)為下調(diào)，與芯片結(jié)果相反。進(jìn)行RT-qPCR數(shù)據(jù)與基因芯片對(duì)比，DAS相對(duì)DN miRNA差異表達(dá)最為明顯的是rno-miR-206-3p、 rno-miR-133a-5p和rno-miR-675-3，為表達(dá)明顯上調(diào)。基于篩選出的關(guān)鍵miRNA，利用網(wǎng)上共享數(shù)據(jù)庫(kù)Gene Ontology(GO)分析(http://www.geneontology.org)進(jìn)行GO分類，包括GO分析、Passway分析、基因網(wǎng)絡(luò)分析、GSEA分析和KEGG Pathway分析和了解相關(guān)的信號(hào)通路和基因功能，后期將針對(duì)關(guān)鍵miRNA構(gòu)建miRNA擬似物和miRNA抑制物寡核苷酸，進(jìn)行過(guò)表達(dá)和抑制實(shí)驗(yàn)。根據(jù)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，有一群miRNAs在糖尿病大鼠患有下肢動(dòng)脈硬化中起著重要作用，其表達(dá)過(guò)程很可能影響著血管動(dòng)脈硬化的進(jìn)程。本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為以后進(jìn)行miRNA靶向調(diào)節(jié)基因表達(dá)研究，闡明糖尿病下肢動(dòng)脈硬化發(fā)病基因調(diào)控機(jī)制提供了重要實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

表4RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果與miRNA芯片結(jié)果比較

Table 4.The results of RT-qPCR detection (2-ΔΔCt) for validating the results of microarray

miRNAFoldchange2-ΔΔCtrno-miR-206-3p99.7294251910.851567rno-miR-133a-5p39.1195914.72300241rno-miR-133b-3p8.13405610.36273802rno-miR-133a-3p6.593266.423383055rno-miR-325-5p1.8488844.500233938rno-miR-675-3p18.80794127.53764599rno-miR-411-5p8.0398885.42641731rno-miR-329-3p6.3770545.735820992rno-miR-3353.6472670.659753955rno-miR-126a-3p1.5126671.032875715

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Microarray-based miRNAs profiling in lower limb arteriosclerosis of diabetic rats

SUN Ping1, XIAO Le2, GONG Kun-mei2，

(1MedicalFacultyofKunmingUniversityofScienceandTechnology，2FirstPeople′sHospitalofYunnanProvince,3FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650034,China.E-mail:kunhuagongkunmei@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To establish the profiling of microRNAs (miRNAs) in the lower extremity arterial tissue between diabetic rats with lower limb arteriosclerosis (DAS) and diabetic rats with normal lower limb (DN), and to explore the possible molecular mechanisms involved in aberrant miRNA expression in DAS. METHODS: The rat models of DAS and DN were successfully established. The respective lower extremity arterial tissue was isolated. The total miRNAs were purified for a hybridization detection by miRNA microarray. The results of chip scanning and data were analyzed and verified by RT-qPCR. RESULTS: Ten miRNAs related to DAS, including rno-miR-206-3p, rno-miR-133a-5p, rno-miR-133b-3p, rno-miR-133a-3p, rno-miR-325-5p, rno-miR-675-3p, rno-miR-411-5p, rno-miR-329-3p, rno-miR-335 and rno-miR-126a-3p, were determined. All 10 abnormally expressed miRNAs were up-regulated. The validating results of RT-qPCR confirmed 9 of the miRNAs in line with chip expression. Just rno-miR-335 showed the opposite between PCR detection and microarray result. CONCLUSION: A group of miRNAs in diabetic rats suffering from lower limb arteriosclerosis plays an important role in the vascular atherosclerosis process. The abnormal expression of miRNAs is likely to affect the vascular atherosclerosis process.

[KEY WORDS]MicroRNAs; Microarray； Diabetes mellitus; Lower limb arteriosclerosis

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)05- 0917- 06

[收稿日期]2015- 11- 27[修回日期] 2016- 02- 16

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81260066; No. 81360069); 云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(No. 2012FB089； No. 2013FB199)

通訊作者△Tel: 0871-63638564； E-mail: kunhuagongkunmei@163.com

[中圖分類號(hào)]R587.1; R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.025

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

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