喻思揚，　王　燕，　曾高峰，　劉　洋，　徐健強，　曾夢雅，　唐業(yè)華，　曾志英，　石小橋，　陳　瑩，　趙國軍

(南華大學附二醫(yī)院 1心血管內科， 2麻醉科， 3衡陽市中心醫(yī)院，湖南 衡陽 421001； 4桂林醫(yī)學院組胚教研室，廣西 桂林 541004)

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阿托伐他汀通過下調NLRP1炎性體表達抑制IL-1β和IL-18的釋放*

喻思揚1▲，王燕2▲，曾高峰1，劉洋1，徐健強1，曾夢雅1，唐業(yè)華3，曾志英2，石小橋2，陳瑩2，趙國軍4△

(南華大學附二醫(yī)院1心血管內科，2麻醉科，3衡陽市中心醫(yī)院，湖南 衡陽 421001；4桂林醫(yī)學院組胚教研室，廣西 桂林 541004)

[摘要]目的： 探討核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白1(NLRP1)炎性體在阿托伐他汀抑制THP-1巨噬細胞白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-18(IL-18)分泌中的作用。方法: 用10 μg/L脂多糖誘導THP-1巨噬細胞分泌IL-1β和IL-18，以不同濃度阿托伐他汀(1、10和20 μmol/L)孵育細胞24 h，或以10 μmol/L阿托伐他汀處理細胞不同時間(12、24和48 h)，或轉染NLRP1 siRNA以沉默細胞內NLRP1的表達。采用RT-PCR檢測細胞內NLRP1炎性體mRNA的表達，Western blot檢測細胞內NLRP1炎性體蛋白的表達，ELISA檢測細胞上清液中IL-1β和IL-18的含量。結果: 阿托伐他汀可抑制THP-1巨噬細胞NLRP1炎性體mRNA和蛋白的表達，且這種效應呈濃度和時間依賴性。轉染NLRP1 siRNA后，THP-1巨噬細胞NLRP1的蛋白表達明顯下降，且阿托伐他汀對IL-1β和IL-18分泌的抑制作用明顯增強。結論: 阿托伐他汀通過抑制NLRP1炎性體表達減少巨噬細胞IL-1β和IL-18的釋放，發(fā)揮抗炎作用，進而延緩動脈粥樣硬化進展。

[關鍵詞]阿托伐他汀； 核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白1炎性體； 白細胞介素-1β； 白細胞介素-18； 動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是一種血管的慢性炎癥性疾病，脂質堆積伴固有免疫激活是As的特征性病理改變之一[1]。阿托伐他汀能有效預防和延緩As形成，這一效果除得益于調脂作用外，還與其抗炎作用密切相關[2]。然而，阿托伐他汀是通過何種機制發(fā)揮抗炎效應，目前不甚清楚。

核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)是一類新發(fā)現(xiàn)的固有免疫模式識別受體，其能調控炎性體活化，參與As等疾病的發(fā)展[3-4]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白1(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1，NLRP1)是第一個被發(fā)現(xiàn)參與炎性體組成的NLRs成員，廣泛存在于單核-巨噬細胞中[5-6]，被細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等物質激活后，NLRP1可協(xié)同半胱天冬酶-1(caspase-1)和凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain，ASC)完成炎性體組裝，促進白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細胞介素-18(interleukin-18，IL-18)的釋放，對炎癥反應起重要作用[7]。本研究旨在通過觀察阿托伐他汀對THP-1巨噬細胞NLRP1炎性體表達及其下游IL-1β和IL-18分泌的影響，探討阿托伐他汀的抗炎機制，為深入認識阿托伐他汀的非調脂作用提供新依據(jù)。

材料和方法

1細胞、主要試劑和儀器

THP-1細胞購于中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞中心；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、LPS購于Sigma；阿托伐他汀鈣購自大連美侖生物技術有限公司；RNA抽提試劑購自GeneCopoeia；Reverse Transcription System購自Promega；TaqMan? Gene Expression Master Mix購于Applied Biosystems；NLRP1、caspase-1、ASC和β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；NLRP1、caspase-1和ASC兔抗人 I 抗購自Life Technologies；β-actin antibody購于Immunechem；辣根過氧化酶標記山羊抗兔 II 抗購自Santa Cruz；jetTEI轉染試劑購于Polyplus；人IL-1β和IL-18酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；CO2培養(yǎng)箱為BiNEDER CB150；電泳裝置及凝膠成像分析系統(tǒng)購自Bio-Rad。

2實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)THP-1細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含青霉素和鏈霉素各1.0×105U/L。培養(yǎng)2～4代后，將狀態(tài)良好、呈對數(shù)生長的細胞用于實驗。實驗前以100 nmol/L PMA刺激細胞24 h，誘導其分化為貼壁的巨噬細胞，換不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)實驗分組，予以相應的處理因素。

2.2RT-PCR采用TRIzol法提取總RNA，測定RNA樣品的純度和含量。取1 μg RNA樣品進行逆轉錄反應，合成cDNA。以cDNA為模板，建立20 μL反應體系，PCR反應循環(huán)為50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min(40個循環(huán))。取5 μL反應底物，瓊脂糖凝膠電泳，電泳后凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像。引物序列和PCR產(chǎn)物片段大小見表1。

表1　RT-PCR的引物序列

F: forward; R:reverse.

2.3Western blot提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度。進行SDS-PAGE分離蛋白，電泳后將蛋白轉移至PVDF膜，S-麗春紅染色觀察PVDF膜上的蛋白條帶，以明確轉膜效率。將PVDF膜置入用TBST配制的含5%脫脂牛奶的封閉緩沖液中，室溫封閉2 h，加入TBST稀釋過的 I 抗，4 ℃冰箱中孵育過夜。室溫復溫后，TBST洗膜3次，每次10 min，加入TBST稀釋過的 II 抗，室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。使用高靈敏ECL發(fā)光試劑進行顯色，采集圖像后保存。

2.4RNA干擾根據(jù)GenBank中人NLRP1 mRNA序列設計siRNA，經(jīng)BLAST明確其特異性。人NLRP1 siRNA的正義鏈序列為5’-UUAAAAUCCUCAUUUUUCCAG-3’，反義鏈序列為5’-GGAAAAAUGAGGAUUUUAACC-3’；另設計陰性對照siRNA的正義鏈序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈序列為5’-ACUUGACACGUUCGGAGAATT-3’；并在BLAST中對其進行同源性分析，確定與其它基因無同源性。用jetTEI轉染試劑將siRNA轉染至THP-1巨噬細胞(具體操作按照試劑盒說明進行)，48 h后采用Western blot鑒定轉染效率。

2.5ELISATHP-1巨噬細胞培養(yǎng)在6孔板中，加入各種處理因素后，收集各孔上清液，IL-1β、IL-18含量的測定嚴格按照ELISA試劑盒操作說明書進行，以450 nm波長測量各孔吸光度，根據(jù)標準曲線計算出樣品實際濃度，并進行統(tǒng)計學分析。

3統(tǒng)計學處理

各組數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用單因素方差分析, 兩兩比較使用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1不同濃度阿托伐他汀對THP-1巨噬細胞NLRP1炎性體表達的影響

THP-1巨噬細胞經(jīng)10 μg/L LPS及不同濃度(1、10和20 μmol/L)的阿托伐他汀處理24 h后，采用RT-PCR和Western blot分別檢測NLRP1、caspase-1和ASC mRNA和蛋白質的表達。結果顯示LPS組NLRP1、caspase-1和ASC的mRNA和蛋白質表達較對照組顯著上調(P<0.05)；經(jīng)不同濃度阿托伐他汀處理后NLRP1、caspase-1和ASC的mRNA和蛋白質表達較LPS組則明顯下降(P<0.05)，且濃度越大，下降越明顯，表明阿托伐他汀可呈濃度依賴性抑制THP-1巨噬細胞NLRP1炎性體mRNA和蛋白質的表達，見圖1、2。

2阿托伐他汀作用不同時間對THP-1巨噬細胞NLRP1炎性體表達的影響

以10 μg/L LPS及10 μmol/L阿托伐他汀處理THP-1巨噬細胞不同時間(12 h、24 h和48 h)后，采用RT-PCR和Western blot分別檢測NLRP1、caspase-1和ASC的mRNA和蛋白質表達。結果顯示LPS組NLRP1、caspase-1和ASC的mRNA和蛋白質表達較對照組顯著上調(P<0.05)；經(jīng)阿托伐他汀處理不同時間后NLRP1、caspase-1和ASC的mRNA和蛋白質表達較LPS組則明顯下降(P<0.05)，且作用時間越長，下降越明顯，表明阿托伐他汀可呈時間依賴性抑制THP-1巨噬細胞NLRP1炎性體mRNA和蛋白質的表達，見圖3、4。

Figure 1.The effect of different concentrations of atorvastatin on mRNA expression of NLRP1 inflammasome in THP-1 macrophages. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

圖1不同濃度阿托伐他汀對THP-1巨噬細胞NLRP1炎性體mRNA表達的影響

3NLRP1 siRNA對阿托伐他汀抑制THP-1巨噬細胞IL-1β和IL-18分泌的影響

為了進一步研究NLRP1炎性體在阿托伐他汀抑制THP-1巨噬細胞IL-1β和IL-18分泌中的作用，我們轉染NLRP1 siRNA以沉默細胞內NLRP1的表達。然后觀察各組細胞IL-1β和IL-18水平的變化，結果顯示與單純LPS組比較，LPS+ATO組或LPS+NLRP1 siRNA組的IL-1β和IL-18分泌顯著減少(P<0.05)；而且，與LPS+ATO組或LPS+NLRP1 siRNA組比較，ATO+NLRP1 siRNA共處理細胞可使LPS誘導的IL-1β和IL-18分泌進一步減少(P<0.05)，表明轉染NLRP1 siRNA下調NLRP1表達能夠促進阿托伐他汀對THP-1巨噬細胞IL-1β和IL-18分泌的抑制作用，見圖5。

Figure 2.The effect of different concentrations of atorvastatin on protein expression of NLRP1 inflammasome in THP-1 macrophages. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

圖2不同濃度阿托伐他汀對THP-1巨噬細胞NLRP1炎性體蛋白表達的影響

討論

血脂代謝異?？赏ㄟ^啟動免疫應答和誘發(fā)炎癥反應，促進血管內壁斑塊形成，進而加速As的發(fā)生發(fā)展[8]。降脂藥阿托伐他汀作為目前最有效的抗As藥物之一，已被證實具備明顯的抗炎效應[9]，但其中的具體機制仍不清楚。NLRP1炎性體是一個由NLRP1、caspase-1和ASC構成的多蛋白寡聚體，受體蛋白NLRP1是其活化和發(fā)揮功能的關鍵分子，與相關配體結合后，NLRP1能啟動炎性體的自我激活，促使IL-1β和IL-18前體分子轉變?yōu)槌墒斓拇傺准毎蜃覽10-11]。本實驗選用THP-1源性巨噬細胞作為模型，觀察了阿托伐他汀對NLRP1炎性體表達的影響，結果顯示阿托伐他汀可呈濃度、時間依賴性抑制NLRP1炎性體mRNA和蛋白質的表達。此外，我們運用siRNA對NLRP1進行沉默，發(fā)現(xiàn)NLRP1表達下調能夠促進阿托伐他汀對IL-1β和IL-18分泌的抑制作用，提示NLRP1炎性體可能在阿托伐他汀的抗炎及抗As作用中扮演了關鍵角色。

Figure 3.The effect of atorvastatin on mRNA expression of NLRP1 inflammasome in THP-1 macrophages for different time. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

圖3阿托伐他汀作用不同時間對THP-1巨噬細胞NLRP1炎性體mRNA表達的影響

Figure 4.The effect of atorvastatin on protein expression of NLRP1 inflammasome in THP-1 macrophages for different time. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

圖4阿托伐他汀作用不同時間對THP-1巨噬細胞NLRP1炎性體蛋白表達的影響

Figure 5.The effect of NLRP1 siRNA on atorvastatin-induced reduction of IL-1β and IL-18 releases from THP-1 macrophages. Western blot was employed to examine the transfection efficiency of NLRP1 siRNA (A). ELISA was used to quantify the secretion of IL-1β (B) and IL-18 (C) in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsLPS;#P<0.05vsLPS+ATO;△P<0.05vsLPS+NLRP1 siRNA.

圖5NLRP1 siRNA對阿托伐他汀抑制THP-1巨噬細胞IL-1β和IL-18分泌的影響

NLRP1炎性體參與炎癥反應及As的發(fā)生發(fā)展[12]。外周動脈疾病(peripheral arterial disease，PAD)是一種由As導致，多因素共同參與的慢性疾病，Bleda等[13]發(fā)現(xiàn)NLRP1炎性體參與PAD患者內皮功能紊亂與炎癥反應過程，并與血管損傷和修復密切相關。阿司匹林是臨床上治療As性疾病的常用藥。Bleda等[14]又發(fā)現(xiàn)NLRP1炎性體表達的下調可能在阿司匹林的抗As過程中發(fā)揮了關鍵作用，這間接驗證了NLRP1炎性體與As的關系，并提示以NLRP1炎性體為靶點治療As存在可能性。固醇調節(jié)元件結合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBP)可調節(jié)脂質合成，是As過程的重要參與者。動物實驗結果顯示，LPS能通過誘導小鼠巨噬細胞SREBP-1a表達上調，促進其下游NLRP1炎性體激活及促炎細胞因子釋放，表明NLRP1炎性體可能是SREBP參與As的途徑之一[15]。我們的研究結果顯示，THP-1巨噬細胞經(jīng)LPS處理后，NLRP1炎性體mRNA和蛋白表達均顯著增加，這與在小鼠巨噬細胞上的發(fā)現(xiàn)一致。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，LPS對NLRP1炎性體的促進作用能被阿托伐他汀有效抑制。

近年來，阿托伐他汀的抗炎效應已成為As防治領域的新熱點，但其所涉及的分子機制卻尚未明了。有學者指出NLRP3(NLR family，pyrin domain containing 3)炎性體參與As發(fā)病過程[16]，且阿托伐他汀可通過干預NLRP3炎性體延緩As進展[17]。但是，亦有學者認為炎癥反應及As進展并不依賴于NLRP3炎性體[13, 15, 18]。鑒于NLRP1炎性體在促炎細胞因子分泌中的重要作用及其與As的密切關聯(lián)性，我們觀察了阿托伐他汀對LPS誘導THP-1巨噬細胞NLRP1炎性體表達的影響，發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可明顯下調NLRP1炎性體表達，且伴有IL-1β和IL-18分泌的減少；此外，當NLRP1被siRNA沉默后，阿托伐他汀對IL-1β和IL-18分泌的抑制作用更加明顯。這些研究結果表明NLRP1炎性體是阿托伐他汀抗炎及抗As作用的重要靶點之一。

綜上所述，阿托伐他汀具備抗炎作用，可減少巨噬細胞IL-1β和IL-18的釋放，且其作用途徑與抑制NLRP1炎性體表達有關。這有助于深入認識他汀類藥物的非調脂作用，并為臨床聯(lián)合用藥治療As提供新依據(jù)。此外，不斷深化對炎性體的研究不僅有益于As的早期診斷，以炎性體為靶點設計單克隆抗體、小分子拮抗物等或許能為As的治療開辟新的途徑。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Atorvastatin inhibits IL-1β and IL-18 releases via lowering the expression of NLRP1 inflammasome

YU Si-yang1, WANG Yan2, ZENG Gao-feng1, LIU Yang1, XU Jian-qiang1, ZENG Meng-ya1, TANG Ye-hua3, ZENG Zhi-ying2, SHI Xiao-qiao2, CHEN Ying2, ZHAO Guo-jun4

(1DepartmentofCardiovascularMedicine,2DepartmentofAnesthesiology,TheSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,3TheCentralHospitalofHengyang,Hengyang421001,China;4DepartmentofHistologyandEmbryology,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China.E-mail:zzhcsu@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the role of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1 (NLRP1) inflammasome in atorvastatin-induced reduction of interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-18 (IL-18) releases from the THP-1 macrophages. METHODS: Lipopolysaccharide (LPS, 10 μg/L) was used to trigger the secretion of IL-1β and IL-18 in the THP-1 macrophages. The cells were incubated with different concentrations of atorvastatin (1, 10 and 20 μmol/L) for 24 h, or treated with 10 μmol/L atorvastatin for different time (12 h, 24 h and 48 h). NLRP1 siRNA was transfected into the THP-1 cells. The mRNA expression of NLRP1 inflammasome was detected by RT-PCR. The protein expression of NLRP1 inflammasome was determined by Western blot. The secretion of proinflammatory cytokines IL-1β and IL-18 was quantified by ELISA. RESULTS: Atorvastatin inhibited the mRNA and protein expression of NLRP1 inflammasome in the THP-1 macrophages in a dose- and time-dependent manner. Transfection of NLRP1 siRNA significantly decreased the protein expression of NLRP1 and promoted the suppressive effect of atorvastatin on IL-1β and IL-18 secretion in the THP-1 macrophages. CONCLUSION: Atorvastatin inhibits the production of IL-1β and IL-18 in the macrophages through decreasing NLRP1 inflammasome expression, possibly contributing to the anti-inflammatory effect of atorvastatin on atherosclerosis.

[KEY WORDS]Atorvastatin; Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1 inflammasome; Interleukin-1β; Interleukin-18; Atherosclerosis

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0863- 06

[收稿日期]2015- 12- 04[修回日期] 2016- 02- 04

*[基金項目]湖南省自然科學基金資助項目(No. 14JJ5016)

通訊作者△Tel: 0773-3680365; E-mail: zzhcsu@163.com

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.016

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

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