胡　美，　許欣婷，　李紅梅，　李珊珊，　吳昌歸

(1解放軍第306醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100101； 2第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710032)

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Notch信號(hào)通路調(diào)控哮喘小鼠氣道上皮下纖維化*

胡美1,2▲，許欣婷2▲，李紅梅1，李珊珊1，吳昌歸2△

(1解放軍第306醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100101；2第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710032)

[摘要]目的： 探討Notch信號(hào)通路在哮喘上皮下纖維化中的調(diào)控作用。方法: 首先針對(duì)I型膠原蛋白啟動(dòng)子進(jìn)行生物信息分析，了解有無Notch信號(hào)通路結(jié)合位點(diǎn)；其次通過DNA-pull down及Western blot 實(shí)驗(yàn)來證實(shí)Notch信號(hào)通路下游關(guān)鍵分子Hes1與人和小鼠I型膠原蛋白亞型基因有無結(jié)合;最后建立哮喘小鼠模型，用免疫熒光檢測(cè)哮喘小鼠肺中I型膠原蛋白2個(gè)亞型在肺組織中的分布情況，并予Notch信號(hào)通路抑制劑KyoT2腺病毒載體經(jīng)鼻干預(yù)，通過EVG染色觀察哮喘氣道上皮下纖維化情況。結(jié)果: 生物信息學(xué)分析證實(shí)I型膠原蛋白2個(gè)亞型的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)附近均存在Notch下游關(guān)鍵分子Hes1的結(jié)合位點(diǎn)。 DNA-pull down及Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)Hes1蛋白結(jié)合于I型膠原蛋白啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)附近。哮喘小鼠模型中I型膠原蛋白的2個(gè)亞型在肺組織中的表達(dá)較正常對(duì)照組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。哮喘小鼠模型經(jīng)Notch抑制劑干預(yù)后肺組織中膠原纖維減少,氣道上皮下纖維化得到緩解。結(jié)論: Notch能調(diào)控哮喘小鼠氣道上皮下纖維化這一氣道重構(gòu)現(xiàn)象，抑制Notch信號(hào)通路減輕善哮喘小鼠氣道上皮下纖維化。

[關(guān)鍵詞]Notch； 膠原蛋白； 哮喘； 上皮下纖維化

哮喘(asthma)是一種慢性病，屬于常見病、多發(fā)病，但其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前對(duì)人類哮喘的認(rèn)識(shí)停留在哮喘癥狀描述上，對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)制的研究仍很有限，故而哮喘的防治仍停留在對(duì)癥處理階段，病因治療難以突破。有關(guān)哮喘氣道重塑的研究是目前研究的難點(diǎn)。氣道上皮下纖維化是哮喘氣道重塑的核心[1-2]。I型膠原(typeⅠ collagen, ColⅠ)是沉積于纖維化部位的細(xì)胞外基質(zhì)的核心成分[3-4]。Notch信號(hào)通路是一種貫穿于細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡等的保守的信號(hào)通路，多項(xiàng)研究表明Notch信號(hào)通路是否參與了心肌纖維化、肺纖維化、腎臟纖維化等疾病的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。那么，Notch信號(hào)通路是否也能調(diào)控哮喘氣道上皮下纖維化尚不清楚。本研究擬通過分子生物實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證Notch信號(hào)通路是否參與了哮喘氣道上皮下纖維化的調(diào)控，抑制Notch信號(hào)通路是否能抑制哮喘氣道上皮下纖維化。

材料和方法

1動(dòng)物和細(xì)胞

24只雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠，6～8周齡，平均體重(18±2) g，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物的管理及使用得到第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

高表達(dá)Notch 胞內(nèi)段(Notch intracellular domain,NICD)的小鼠氣道成纖維細(xì)胞L929(L929-NICD)、對(duì)照細(xì)胞L929、高表達(dá)NICD的人氣道成纖維細(xì)胞MRC-5(MRC-5-NICD)和對(duì)照細(xì)胞MRC-5均由本實(shí)驗(yàn)室留存。而空細(xì)胞L929以及空細(xì)胞MRC-5從中科院上海生科院細(xì)胞庫(kù)獲得。

2主要試劑

胎牛血清購(gòu)于HyClone；培養(yǎng)基DMEM購(gòu)于Gibco；胰酶、M-280 Dynabeads和山羊抗兔IgG(紅色熒光)購(gòu)于Invitrogen；Hes1兔多抗購(gòu)于Santa Cruz；瓊脂糖購(gòu)于上海國(guó)藥；山羊抗兔IgG(H+L)HRP購(gòu)于Byeotime；細(xì)胞核蛋白提取試劑盒購(gòu)于上海生工股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于Pierce；DNA多聚酶購(gòu)于Promega；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)于北京天根生化；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于Beyotime；GAPDH兔多抗購(gòu)于華安生物；小鼠及人COL1A1(編碼ColⅠ的α1鏈)和COL1A2(編碼ColⅠ的α2鏈)基因的引物由上海生博合成；卵蛋白(OVA)購(gòu)于Sigma；EVG染色試劑盒購(gòu)于BASO；表達(dá)KyoT2的腺病毒載體及對(duì)照病毒由上海生博生物技術(shù)公司包裝；ColⅠα1及ColⅠα2抗體購(gòu)于Santa Cruz。

3主要方法

3.1生物信息學(xué)分析從http://www.genomatix.de數(shù)據(jù)庫(kù)中查找小鼠及人的COL1A1和COL1A2基因，利用該數(shù)據(jù)庫(kù)軟件分析COL1A1和COL1A2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)附近有無Hes1的結(jié)合位點(diǎn)，即N-box位點(diǎn)。

3.2DNA-pull down實(shí)驗(yàn)進(jìn)行核蛋白抽提，先將L929空細(xì)胞、L929-NICD細(xì)胞、L929對(duì)照細(xì)胞、MRC-5空細(xì)胞、MRC-5-NICD細(xì)胞及MRC-5對(duì)照細(xì)胞按1×105接種于DMEM培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)72 h，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)收集細(xì)胞按照上海生工核蛋白抽提說明書進(jìn)行操作獲得這幾組細(xì)胞核蛋白后，用BCA試劑盒操作說明進(jìn)行BCA法蛋白定量獲取蛋白濃度后留樣作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分別將小鼠及人COL1A1和COL1A2 DNA作為模板，加入引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶，用紫外線分光光度儀測(cè)量濃度后，將這些擴(kuò)增后的DNA按說明分別加入到Dynabeads M-280 Streptavidin 磁珠內(nèi)，置搖床上室溫清搖3 h，先后用洗滌緩沖液清洗磁珠2次，離心棄洗滌液，加入PBS重懸磁珠，將上述經(jīng)定量的各細(xì)胞核蛋白提取物按照磁珠操作說明取樣后分別加入5 μL鮭魚精DNA，室溫下置搖床輕搖15 min，遂加入到磁珠混合物中，混勻30 min。將各組細(xì)胞來源成分與磁珠的混合物置于磁珠架上固定磁珠，分別收集上清作內(nèi)參照檢測(cè)備用。用PBS清洗磁珠-COL1A1和COL1A2 DNA-核蛋白2次，再用洗脫液洗脫核蛋白，分別收集各組洗脫液用于目的蛋白Hes1的Western blot 檢測(cè)。

3.3Western blot實(shí)驗(yàn)配制濃縮膠為5%，分離膠為10%， 插上上樣梳子，待膠凝固后拔除梳子，將上述洗脫出來的目的蛋白及預(yù)留作為內(nèi)參照用上清液上樣，電泳時(shí)濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，當(dāng)marker 各條帶充分分離后電泳停止。以300 mA電流NC膜轉(zhuǎn)1 h。將NC膜用5%脫脂奶粉-TBST液封閉1 h，將NC膜置于按1∶500稀釋的Hes1抗體中室溫孵育10 min后置于4 ℃冰箱繼續(xù)孵育過夜后取出，室溫孵育30 min，用TBST洗膜3 min 3次，取出NC膜置于用5%脫脂奶粉-TBST按1∶1 000稀釋的山羊抗兔IgG(H+L)HRP液中，室溫?fù)u床輕搖40 min，取出NC膜用TBST洗3 min 6次。將NC膜轉(zhuǎn)移至暗室，滴加ECL反應(yīng)液，置于暗盒覆上X光膠片、關(guān)閉暗盒，曝光10 s后經(jīng)顯影、定影、清洗后晾干膠片，標(biāo)上marker條帶并分析。將每組細(xì)胞的NC膜沸水煮10 min，再經(jīng)封閉后用GAPDH兔多抗作為I抗孵育洗滌后再用II抗山羊抗兔IgG(H+L)HRP孵育，最后經(jīng)滴加ECL、顯影、定影得到內(nèi)參照的條帶供分析。

3.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將BALB/c鼠隨機(jī)分成4組(每組6只)：正常對(duì)照(control)組、哮喘(asthma)組、哮喘對(duì)照空載腺病毒干預(yù)(placebo)組和哮喘KyoT2腺病毒載體干預(yù)(target)組。Asthma組、placebo組及target組分別在第1天和第7天予腹腔注射0.2 mL卵清蛋白/氫氧化鋁-PBS混懸液致敏，于第14天始將小鼠置于自制密閉玻璃容器內(nèi)，用5%卵清蛋白生理鹽水超聲霧化吸入激發(fā)(每日1次，每次25 min，連續(xù)4周)，期中placebo組及target組分別在第8 天經(jīng)鼻滴入空載腺病毒及載KyoT2腺病毒5×108pfu。而control組用同等量的PBS腹腔注射，霧化也均用PBS。上述4組小鼠最后一次霧化后72 h內(nèi)處死，取肺組織10%甲醛固定48 h、石蠟包埋、切片留作染色用。

3.5免疫熒光染色將上述control和asthma組的小鼠肺組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后用PBS液清洗3次，每次3 min后，先用枸櫞酸鈉緩沖液將肺組織抗原進(jìn)行微波修復(fù)后，用動(dòng)物非免疫血清封閉1 h，去除封閉液，加入ColⅠα1或ColⅠα2抗體，每張切片50 μL，室溫靜置1 h后放4 ℃冰箱孵育過夜。取出切片37 ℃復(fù)溫40 min，PBS液清洗10 min 3次。除凈PBS液，加入帶紅色熒光的山羊抗兔IgG, 避光室溫下孵育1 h后再用PBS液清洗并用50 μL DAPI行核染色5 min，再PBS清洗后封片劑封片，熒光顯微鏡拍照觀察。

3.6EVG染色將上述4組小鼠肺組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后按照操作規(guī)程用高錳酸鉀氧化、蒸餾水洗、草酸漂白后再予蒸餾水清新，用95%乙醇清洗后浸入Elastin染液中24 h，再次用95%乙醇分化，并先后用自來水、蒸餾水清洗，最后用Van Gieson染液對(duì)比染色1 min，95%乙醇急速分化數(shù)秒，無水乙醇脫水、二甲苯透明、樹膠封固待干后顯微鏡下觀察。

3.7氣道上皮下纖維化的觀察將上述經(jīng)EVG染色后的小鼠肺組織切片置于顯微鏡下觀察，每個(gè)切片在高倍鏡下(×400)至少觀察10個(gè)視野，找到完整的細(xì)支氣管橫斷面，以細(xì)支氣管為中心用NIS-Elements系統(tǒng)測(cè)量分析細(xì)支氣管上皮下膠原纖維的厚度，每個(gè)小鼠隨機(jī)測(cè)量6支細(xì)支氣管，每組小鼠至少測(cè)量3只，最后計(jì)算平均厚度。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用單因素方差分析法進(jìn)行分析(one-way ANOVA)，用最小顯著性差異法(LSD法)進(jìn)行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1COL1A1及COL1A2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)上游發(fā)現(xiàn)Hes1結(jié)合位點(diǎn)

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在人和小鼠I型膠原蛋白的2個(gè)亞型基因上存在Hes1蛋白的結(jié)合位點(diǎn)CACNAG, 這與我們過去的分析一致[7]，見圖1。

Figure 1.Bioinformatic analysis showed there are Hes1 binding sites in human or mouse type I collagen promoters. The blue markers were the binding sites.

圖1人和鼠I型膠原蛋白啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析

2COL1A1及COL1A2基因探針沉淀出Hes1蛋白

本研究分別用小鼠及人COL1A1和COL1A2基因探針，從上調(diào)了Notch信號(hào)的人和鼠氣道成纖維細(xì)胞中沉淀出了與之相結(jié)合的Hes1蛋白，反映了Hes1與COL1A1和COL1A2啟動(dòng)子存在相互作用,見圖2。

3哮喘小鼠肺組織中ColⅠα1及ColⅠα2表達(dá)增多

哮喘模型小鼠及正常對(duì)照小鼠肺組織中均有ColⅠα1及ColⅠα2的表達(dá)，而且哮喘時(shí)肺組織中這2種蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.The results of DNA-pull down and Western blot. A: type I collagen promoter genes pulled down the binding protein Hes1 in mouse airway fibroblasts (L929, L929-NICD and L929-control); B: type I collagen promoter genes pulled down the binding protein Hes1 in human airway fibroblasts (MRC-5， MRC-5-NICD and MRC-5-control).

圖2DNA-pull down 和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Figure 3.The expression of ColⅠα1 (A) and ColⅠα2 (B) in the lung tissues of asthmatic mouse model observed by immunofluorescentce staining. Red is for collagen, while blue is for DAPI. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control.

圖3免疫熒光染色觀察哮喘模型組肺組織中ColⅠα1和ColⅠα2的表達(dá)

4KyoT2下調(diào)哮喘小鼠氣道上皮下纖維化

哮喘模型小鼠經(jīng)Notch抑制劑KyoT2腺病毒載體經(jīng)鼻滴入后，觀察肺組織切片氣道上皮下纖維化的情況，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于哮喘小鼠未處理組及哮喘空載病毒處理組，給予KyoT2腺病毒載體處理的哮喘小鼠肺組織內(nèi)氣道上皮下纖維化明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，且其氣道上皮下纖維化程度與正常小鼠組接近，見圖4。這表明抑制Notch信號(hào)通路能改善哮喘小鼠氣道上皮下纖維化。

Figure 4.Airway subepithelial fibrosis in the asthamtic mice (EVG staining,×40). Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs placebo.

圖4肺組織EVG染色觀察哮喘模型小鼠的肺組織細(xì)支氣管上皮下膠原纖維增生和厚度變化以及Notch抑制劑KyoT2干預(yù)的影響

討論

哮喘氣道上皮下纖維化是哮喘氣道重塑的核心事件，而氣道上皮下纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)是膠原蛋白在氣道上皮下的沉積。本研究首先通過對(duì)人和鼠I型膠原蛋白基因COL1A1和COL1A2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)附近的生物學(xué)信息分析提示其上存在Notch下游關(guān)鍵分子Hes1結(jié)合位點(diǎn)CACNAG序列，即N-box結(jié)合位點(diǎn)。通過DNA-pull down實(shí)驗(yàn)證實(shí)用COL1A1和COL1A2基因?yàn)樘结樐艹恋沓雠c之結(jié)合的Hes1蛋白，進(jìn)一步驗(yàn)證了I型膠原蛋白基因轉(zhuǎn)錄可能受到Hes1蛋白的調(diào)控。本研究又通過建立哮喘小鼠模型，通過免疫熒光方法檢測(cè)哮喘模型鼠及對(duì)照小鼠肺組織內(nèi)ColⅠα1及ColⅠα2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠中前述2種蛋白的表達(dá)明顯增多。進(jìn)而用Notch信號(hào)通路抑制劑KyoT2腺病毒載體干預(yù)小鼠后行病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠肺組織內(nèi)氣道上皮下纖維化即膠原蛋白在氣道上皮下的沉積明顯較對(duì)照組減輕，因此我們認(rèn)為Notch信號(hào)的確參與了哮喘氣道上皮下纖維化這一氣道重塑現(xiàn)象，而抑制Notch信號(hào)通路可以減輕氣道重塑。本課題組過去在細(xì)胞水平的研究中曾發(fā)現(xiàn)，將NICD轉(zhuǎn)染人和小鼠氣道成纖維細(xì)胞時(shí)，這2種細(xì)胞ColⅠα1及ColⅠα2的表達(dá)增多，這與我們本研究中哮喘小鼠氣道ColⅠα1及ColⅠα2的表達(dá)增多一致[7]。

目前的研究認(rèn)為，Notch配體與受體結(jié)合后Notch信號(hào)通路即被啟動(dòng)，NICD釋放，并最終與下游的蛋白效應(yīng)器CSL(C-promoter binding factor-1/suppressor of hairless/LAG1)結(jié)合后募集MAML(mastermind-like family members)形成NICD-CSL-MAML三聯(lián)復(fù)合物[8]，下游的關(guān)鍵因子Hes1等基因被啟動(dòng)，從而調(diào)控目的基因的表達(dá)最終影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖及凋亡。KyoT2通過與CSL相互作用而負(fù)性調(diào)節(jié)Notch信號(hào)[9]。最近的一些研究認(rèn)為Notch信號(hào)通路可直接調(diào)控α-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子活性從而誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞[10]、腎小管上皮細(xì)胞[11]及主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞分化，并認(rèn)為Notch信號(hào)對(duì)心肌的修復(fù)、皮膚的纖維化[12]、肝臟的纖維化[13]也均有影響。有研究也發(fā)現(xiàn)抑制Notch途徑能改善慢性腎炎引起的腎纖維化[14-15]。但是另一項(xiàng)有關(guān)松弛肽抑制心肌細(xì)胞纖維化的研究卻提示Notch信號(hào)通路抑制了膠原蛋白的合成[16]，這與本研究有差異，可能與Notch信號(hào)在不同臟器中的特異性調(diào)控有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。

總之，我們發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路在氣道上皮下纖維化中有調(diào)控作用，抑制Notch信號(hào)通路途徑能下調(diào)哮喘氣道上皮下膠原蛋白的表達(dá)從而降低哮喘氣道上皮下纖維化，Notch信號(hào)通路的抑制劑可能成為哮喘治療的新藥物，尤其是對(duì)那些以氣道重塑為核心的難治性哮喘的治療，Notch信號(hào)通路抑制劑的選擇可能是治療的新策略。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Notch signaling regulates airway subepithelial fibrosis in asthmatic mice

HU Mei1, 2, XU Xin-ting2, LI Hong-mei1, LI Shan-shan1, WU Chang-gui2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine, 306thHospitalofPLA,Beijing100101,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:changguinew@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of Notch signaling in regulating airway subepithelial fibrosis in the asthmatic mice.METHODS: The binding sites of Notch signaling molecules in type I collagen gene promoter were analyzed by bioinformatic methods. DNA-pull down assay and Western blot were further performed to verify Hes1 binding to type I collagen gene. The mouse asthmatic model was established and the type I collagen expression in the lung tissues were detected by immunofluorescence staining. To explore the Notch efficacy on asthmatic airway subepithelial fibrosis, mouse asthmatic model was intranasally administered recombinant adenovirus vectors containing KyoT2. Then the airway subepithelial fibrosis of asthmatic mouse model was evaluated by EVG staining.RESULTS: The results of bioinformatic analysis showed that Hes1 binding to type I collagen gene near to its transcription site was observed. The results of DNA-pull down assay and Western blot confirmed this binding. The expression of type I collagen in the asthmatic mice was higher than that in the normal mice (P<0.05). Furthermore, EVG staining showed more severe airway subepithelial fibrosis in the asthmatic model than that in the control (P<0.01). CONCLUSION: Notch signaling has great efficiency in regulating airway subepithelial fibrosis in asthmatic mouse model, and the Notch signaling repressor down-regulates airway subepithelial fibrosis in the asthmatic mice.

[KEY WORDS]Notch; Collagen; Asthma; Subepithelial fibrosis

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)05- 0781- 06

[收稿日期]2015- 09- 08[修回日期] 2016- 03- 09

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81170020)

通訊作者△Tel: 029-84775233; E-mail: changguinew@126.com

[中圖分類號(hào)]R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.002

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