劉銳　綜述　巴一　審校

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外泌體傳輸microRNA在腫瘤研究中的進展*

劉銳綜述巴一審校

摘要外泌體是一類可以在細胞間傳遞直徑為30～100 nm的內(nèi)吞衍生囊泡，可包含與其來源和功能相關(guān)的蛋白質(zhì)和RNA等物質(zhì)。外泌體作為一種天然的載體，已被視為一種新型的藥物傳輸系統(tǒng)用于腫瘤的治療。microRNA（miRNA）是一類新型的RNA調(diào)控基因，不僅僅存在于細胞內(nèi)，亦存在于細胞外，這些細胞外miRNA可作為分泌型信號分子影響受體細胞表型，并一定程度上反映出供體細胞內(nèi)的分子改變，具有一定的診斷及潛在的治療用途。腫瘤患者血液中外泌體高于正常人，并能夠包裹腫瘤相關(guān)miRNA行使生物學功能，因此機體通過外泌體傳輸特異性miRNA可能在腫瘤的發(fā)病過程中扮演著重要的角色。本文將對外泌體作為miRNA的傳輸載體在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及腫瘤治療等方面的研究進行綜述。

關(guān)鍵詞microRNA外泌體診斷標志物腫瘤

作者單位：天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院消化腫瘤內(nèi)科，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學基金（編號：81201946）資助

外泌體是產(chǎn)生自人體自身直徑為30～100 nm的囊泡，大部分的細胞系均可釋放，幾乎存在于所有的體液中。其可以在相鄰細胞或遠端細胞間運載生物活性分子（如蛋白，脂類及核酸），且攜帶的分子能夠引起受體細胞的信號反應(yīng)，介導(dǎo)細胞間的物質(zhì)交換。因此，外泌體被認為是微環(huán)境的信號分子，能夠運輸功能性RNA，包括外源性的siRNA到受體細胞中，調(diào)節(jié)目的基因表達，從而治療某些疾病。目前外泌體對miRNA的傳輸及其在細胞間的通訊作用越來越受到研究者們的關(guān)注，且其在腫瘤的診斷和治療中具有一定臨床意義。本文將綜述外泌體傳輸miR?NA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物作用，并探討其作為腫瘤診斷標志物及用于臨床治療等方面的價值。

1　外泌體對細胞外miRNA的傳輸及其生物學意義

miRNA是長約22 nt的自然存在、不編碼的RNA。成熟的miRNA由前體miRNA轉(zhuǎn)錄形成，其一般為幾千個核苷酸組成。大量的細胞外miRNA存在于包括血清、血漿、尿液、乳汁等體液之中。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，這些細胞外miRNA表達量的改變與包括腫瘤在內(nèi)的很多疾病相關(guān)［1-2］。盡管細胞外存在高濃度的RNA酶，細胞外miRNA在體液中仍具有較高濃度和結(jié)構(gòu)的完整性，這一現(xiàn)象表明細胞外miRNA可能被包裹在某種特殊的結(jié)構(gòu)中從而防止被酶消化。加入血漿中的無包裹miRNA會立即被消化，而循環(huán)中的miRNA在相同條件下的數(shù)小時內(nèi)是穩(wěn)定且受保護的，可抵抗環(huán)境的改變?nèi)鐦O端溫度、極端酸堿度及反復(fù)的凍融［3-4］。

2013年美國和德國科學家發(fā)現(xiàn)了細胞囊泡運輸調(diào)節(jié)機制，并由此榮獲諾貝爾獎。外泌體（exosomes）作為人體內(nèi)一類重要的囊泡，其生物學功能受到越來越多的關(guān)注，有研究報道細胞釋放的miRNA主要包裹于小囊泡中（如外泌體、脫落的囊泡和凋亡小體）作為分泌分子影響受體細胞表型［5-6］，或通過結(jié)合到特定細胞的表面受體從而對靶細胞進行調(diào)控［7-8］。功能性的miRNA也通過該機制進行運輸調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)健康受試者血漿中外泌體包裹的miRNA的表達水平與外周血單核細胞相比存在顯著性差異［9-10］，推測血漿外泌體中的miRNA可能是造血的重要調(diào)節(jié)因子。在體外研究中現(xiàn)從胚胎干細胞來源的外泌體可運輸miRNA到小鼠胚胎成纖維細胞中行使功能［11］。另一項研究中發(fā)現(xiàn)，人骨髓間充質(zhì)干細胞釋放的外泌體包含的miRNA可通過與受體細胞的結(jié)合釋放到受體細胞中行使功能［12］。有研究觀察到外泌體包裹著miRNA釋放到細胞外通過與相應(yīng)靶蛋白的作用可抑制脂肪細胞的沉積［8］。還有研究報道絨毛滋養(yǎng)細胞產(chǎn)生的胎盤相關(guān)miRNA通過外泌體分泌進入產(chǎn)婦的循環(huán)系統(tǒng)，并證明胎盤相關(guān)的miRNA可在母體的NK細胞中與靶基因相互作用，從而揭示一種新的母體與胎盤之間信息傳遞的方式［13］。同樣也有研究報道THP-1細胞來源的微囊泡包裹著大量的miR-150輸送到人微血管內(nèi)皮細胞（human microvascular endo?thelial cells，HMEC-1），導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞的miR-150水平升高，并觀察到了其與c-myb之間的靶向調(diào)控作用，促進了細胞的增殖［14］。該研究結(jié)果表明miRNA在單核細胞和血管內(nèi)皮細胞之間通訊可能與心血管系統(tǒng)疾病發(fā)展相關(guān)。

以上研究結(jié)果所示，外泌體不僅特異性靶向于受體細胞改變其蛋白質(zhì)、基因等表達，而且還通過運輸miRNA參與信號傳導(dǎo)。該過程主要是miRNA首先包裹在細胞內(nèi)的外泌體中，然后進入循環(huán)系統(tǒng)，與細胞受體結(jié)合，作為內(nèi)源miRNA行使生物學功能（圖1）。由于miRNA廣泛地靶向于mRNA，這種由外泌體介導(dǎo)的miRNA通訊在細胞間的生物信息傳遞中起著非常廣泛的作用。miRNA的外泌體轉(zhuǎn)移途徑有助于局部與系統(tǒng)間的細胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)移，但又有別于細胞接觸或細胞因子等方式。

2　外泌體miRNA在腫瘤中的關(guān)聯(lián)研究

腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)展過程中起著重要的作用，腫瘤細胞會影響正常細胞的穩(wěn)態(tài)而出現(xiàn)腫瘤特性。腫瘤細胞和正常細胞在微環(huán)境中的動態(tài)交互過程是疾病進展的關(guān)鍵。這種交互作用可能通過分泌的小分子信號完成［15］，這類分泌型小分子已不再局限于細胞因子、趨化因子、生長因子或一些蛋白分子，外泌體包裹的分泌型miRNA亦在其中［16］。有研究證實外泌體小RNA參與了腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸以及微環(huán)境的形成，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，可以作為新的腫瘤生物標志物。腫瘤分泌的miR-214，通過外泌體運輸?shù)绞荏w細胞CD4+T細胞中，下調(diào)PTEN表達，最終影響調(diào)節(jié)性T細胞的功能，引起宿主免疫逃逸以及腫瘤的快速增長。近年來人們已經(jīng)認識到腫瘤細胞能夠操控宿主的免疫功能，機體能夠通過外泌體將腫瘤特異性的miRNA運輸?shù)矫庖呒毎?，使腫瘤發(fā)生免疫逃逸，為腫瘤免疫檢查點治療［17］提供了新的思路。

圖1　外泌體在細胞間傳輸miRNA示意圖Figure 1 Schematic of exosomal transmission of miRNAs

有研究發(fā)現(xiàn)人膠質(zhì)瘤細胞分泌的外泌體富集mRNA和miRNA，并可作用于HMEC-1行使功能［18］，說明腫瘤細胞產(chǎn)生的外泌體可以通過改變轉(zhuǎn)錄后表達從而影響周圍正常細胞的功能，同樣膠質(zhì)瘤患者的腦脊液中可以檢測到膠質(zhì)瘤特異性miR-21，且其表達水平與腦室轉(zhuǎn)移、腫瘤分級及預(yù)后相關(guān)［19］。另有研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細胞通過外泌體的包裹方式釋放包括miR-214-3p、miR-199a-3p和miR-155-5p在內(nèi)的小分子進入腫瘤微環(huán)境進行信息通訊，調(diào)控黑色素瘤的發(fā)展［20］。用間充質(zhì)干細胞外泌體將antimiR-9分子導(dǎo)入膠質(zhì)母細胞瘤細胞中，實現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)其對替莫唑胺的耐藥性［21］。Ohno等［22］采用基因工程技術(shù)在外泌體包膜上表達表皮生長因子受體（epider?mal growth factor receptor，EGFR）結(jié)合片段GE11，從而將let-7a特異性導(dǎo)入EGFR表達乳腺癌細胞中，進一步的體內(nèi)研究也證實包含let-7的GE11外泌體可在體內(nèi)顯著抑制EGFR陽性乳腺癌細胞的生長。故腫瘤細胞能夠通過外泌體轉(zhuǎn)運miRNA到周圍的細胞，促進腫瘤的生長及發(fā)展。

3　外泌體傳輸miRNA在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用

分泌型miRNA可在生物體液中被檢測出來，并能反映出生物體的生理病理狀態(tài)，因此具有潛在的診斷和預(yù)后標志物的特征。有研究證實其可用于疾病診斷和預(yù)后判斷，在患者血清中檢測病毒分泌的miRNA可判斷疾病預(yù)后［23］，具有膠質(zhì)瘤、胰腺癌、胃癌等特征的miRNA能在相應(yīng)患者的血清中檢出［24-26］，這些研究都證明了腫瘤分泌的miRNA能夠提供診斷信息，從而協(xié)助治療。有研究發(fā)現(xiàn)在肺癌患者中其總外泌體數(shù)量較對照組增多，且其中所包含的miR?NA與其相應(yīng)的肺癌組織相似［27］。另有研究證實卵巢癌患者中的外泌體水平較良性疾病患者明顯升高，而且其水平與腫瘤分期相關(guān)，可用于卵巢癌的早期診斷［28］。M.D.安德森癌癥中心也在Nature雜志發(fā)表了外泌體作為胰腺癌生物標志物的研究成果，除DNA和全細胞之外，腫瘤細胞脫落的外泌體也可作為替代的癌癥生物標志物，其攜帶的DNA、RNA和蛋白質(zhì)可以用來成功區(qū)分患者胰腺癌早期、晚期與良性胰腺疾病或健康受試者［29］。

近年來國外研究證實，原癌基因特性miRNA的反義寡聚核苷酸-抗miRNA寡聚核苷酸，可有效地滅活腫瘤中的“壞的”miRNA，控制腫瘤生長［30-31］從而實現(xiàn)一定的治療作用。2015年Nature雜志發(fā)表了耶魯大學的研究成果，通過靶向輸送anti-miR至淋巴瘤的腫瘤微環(huán)境中，特異性抑制miR-155表達，從而起到抗腫瘤的作用［32］。用于丙肝治療的miR-122拮抗劑已經(jīng)進入了Ⅱ期臨床試驗，用于不能手術(shù)的原發(fā)性肝癌和肝臟受累的轉(zhuǎn)移性癌癥的miRNA療法也有Ⅰ期臨床試驗在研。目前關(guān)于分泌型miRNA轉(zhuǎn)化性的多項研究已陸續(xù)開展，分泌型miRNA用于胰腺癌診斷標志物的研究成果也已完成臨床實驗。外泌體在miRNA運輸中的作用和意義已得到證實，進一步為分泌型miRNA真正應(yīng)用于臨床腫瘤的診斷及治療等方面提供了一條重要的運輸途徑。

4　外泌體傳輸miRNA的優(yōu)勢與不足

外泌體作為體內(nèi)小分子的傳輸載體相對于傳統(tǒng)的運輸方式有其獨特的優(yōu)勢。首先，外泌體來源于內(nèi)源性細胞，是一種天然的載體，具有良好的免疫原性，從而具有高效和良好的免疫耐受性，用于生物體而不易引起毒性與免疫反應(yīng)。其次，外泌體直徑僅30～100 nm，是一種可以避免被巨噬細胞吞噬的理想的運輸miRNA方式，能夠?qū)⒁职﹎iRNA或原癌miRNA反義序列特異性運輸至靶位點從而調(diào)控蛋白表達起到治療的作用，這種作用方式被稱為“exo?cure”［33］。故外泌體作為miRNA的運輸載體，具有一定的實際應(yīng)用前景，有助于推動miRNA的基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。但將外泌體作為miRNA載體應(yīng)用于臨床治療仍存在一些亟待解決的問題。首先如何大批量生產(chǎn)外泌體是制約其進一步應(yīng)用的關(guān)鍵，目前尚無能夠大量生產(chǎn)外泌體的細胞，雖然無限增殖的干細胞可生產(chǎn)用于治療的外泌體，但這一技術(shù)仍然涉及到慢病毒且尚無人源細胞系可用于外泌體的分離，而異源細胞產(chǎn)生的外泌體存在組織相容性問題，安全性不能保證，同時受技術(shù)的限制導(dǎo)致外泌體的提取成本非常昂貴。其次，如何能使外泌體特異高效地結(jié)合于病灶部位是其真正走向臨床應(yīng)用的另一問題，目前主要通過對外泌體表面蛋白的改造與具有靶向能力的肽段結(jié)合使其具有特異性組織結(jié)合能力，故外泌體進入體內(nèi)針對不同組織的的靶向傳輸miRNA特性仍有待研究。

5　展望

目前，細胞外miRNA已經(jīng)在各種生理病理條件下被檢測到，大量的miRNA可被同時釋放，同時調(diào)控多個靶點，從而激活一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)傳導(dǎo)，這些細胞外miRNA來自于細胞自身并穩(wěn)定存在于外泌體中，被分泌到微環(huán)境中并與相應(yīng)的受體細胞結(jié)合后作用于靶點mRNA改變蛋白表達行使生物功能，同時在多種腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)了一定的表達規(guī)律，使其成為近年來新興的一類腫瘤生物標志物及治療靶點。隨著研究不斷深入，外泌體miRNA生物學功能將會進一步得到充實，外泌體介導(dǎo)的小RNA運輸系統(tǒng)目前正在被開發(fā)并嘗試運用到腫瘤的診斷與治療中。

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（2016-03-25收稿）

（2016-04-28修回）

（編輯：武斌校對：楊紅欣）

劉銳專業(yè)方向為消化系統(tǒng)腫瘤表觀遺傳學相關(guān)研究。E-mail：liurui9003@163.com

·綜述·

Progress on exosomal transmission of microRNAs in cancer research

Rui LIU，Yi BA

Department of Digestive Oncology Internal Medicine，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81201946）

Correspondence to：Yi BA；E-mail：bayi@tjmuch.com

AbstractExosomes are cell-derived vesicles that contain protein and RNA from the same source and function.The vesicle has a diameter between 30 and 100 nm.Exosomes are the natural carriers and have been recently used as drug delivery system for cancer treatment.MicroRNAs（miRNAs）function in RNA silencing and regulation of gene expression.They can exist as intracellular and extracellular miRNAs.Extracellular miRNAs can function as secreted signaling molecules that affect receptor cell phenotype.They can also reflect molecular changes in donor cells.Therefore，extracellular miRNAs can be potentially used for diagnosis and therapeutics.Studies show that the volume of exosomes in cancer patients' blood is higher than that in normal controls.The ability to package cancer-related miRNAs is a biological function of exosomes.In conclusion，specific miRNAs transferred by exosomes may play an important role in the pathogenesis of tumor or cancer.This paper presents a summary of research on exosomes as the carrier of miRNAs in the development and treatment of cancer.

Keywords：microRNA，exosomes，diagnosis，markers，tumor

doi：10.3969/j.issn.1000-8179.2016.10.336

通信作者：巴一bayi@tjmuch.com

作者簡介