（信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 信陽 464000）

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征與豬偽狂犬病混合感染的診斷

連慧香

（信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 信陽 464000）

為了解信陽某豬場發(fā)病仔豬死亡原因，通過流行病學(xué)調(diào)查、病理解剖、偽狂犬病毒PCR檢測、PRRSV的PCR檢測、PRRSV分離株ORF5基因的PCR擴(kuò)增及序列分析等方法，對(duì)該豬場發(fā)病豬進(jìn)行了診斷。結(jié)果表明，該豬場豬只為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV)和偽狂犬病病毒（PRV）的混合感染。

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒；豬偽狂犬病毒；混合感染；診斷

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome）又稱豬藍(lán)耳病，該病以母豬繁殖障礙、仔豬呼吸道疾病為主要臨床特征。自1997年報(bào)道以來，PRRS在我國不斷有發(fā)生，特別是2006年高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HPPRRSV）毒株出現(xiàn)以來，被認(rèn)為是豬“高熱病”的主要病原[1-2]，HP-PRRSV在我國不同規(guī)模的養(yǎng)豬場流行，且常與豬瘟、豬圓環(huán)病毒病等多種病混合感染，不僅給診斷帶來很大的麻煩，還常常耽誤治療，也給養(yǎng)豬業(yè)的疾病防控帶來巨大挑戰(zhàn)[3]。豬偽狂犬?。╬seudorabies，PR）是一種由偽狂犬病毒引起的急性傳染病[4]，以母豬的繁殖障礙、仔豬的高死亡率且伴有嚴(yán)重神經(jīng)癥狀為特征,也是目前嚴(yán)重影響中國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疫病之一。

筆者就一起高致病性豬繁殖與呼吸綜合征及豬偽狂犬病混合感染病例的診斷進(jìn)行報(bào)道?，F(xiàn)將詳細(xì)情況報(bào)道如下：

1 材料與方法

1．1 材料

豫南地區(qū)某豬場送檢的3頭發(fā)病仔豬。

1．2 試劑

TaKaRa LA Taq，RNAiso Plus，RNase inhibitor（40U/μL），M-MLV（Rnase H-）（200U/μL），dNTP Mixture，Premix Ex TaqTM試劑，PMD18-T vector，DNA Marke等工具酶均為大連寶生物公司（TaKaRa）產(chǎn)品；RNA抽提試劑盒，膠回收試劑盒均購于愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；大腸桿菌（DH5α）為廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院惠贈(zèng)。

1．3 流行病學(xué)調(diào)查及病理剖解

通過詢問畜主了解豬群發(fā)病情況，按常規(guī)方法對(duì)送檢病豬進(jìn)行剖解，觀察病豬臟器的病理變化。

1．4 實(shí)驗(yàn)室診斷

1.4.1 細(xì)菌的分離

在無菌條件下，采集病死豬各組織，進(jìn)行細(xì)菌劃線分離。

1.4.2 PRV的PCR檢測

將該豬場死亡的仔豬在無菌操作下分別采集腦、肺臟、肝臟、脾臟等組織，常規(guī)方法進(jìn)行研磨，-20 ℃反復(fù)凍融3次后，抽提DNA,應(yīng)用PCR方法分別進(jìn)行PRV的檢測。PRV引物序列：F：5'-CACGGAGGACGAGCTGGGGC T-3’，R：5'-GTCCACGCCCCGCTT GAAGCT-3’，擴(kuò)增片段217 bp；PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25μL/樣品）：LA Taq(5U/μL)0.5 μL，2×GCBuffer12.5 μL，dNTP mixtue2 uL，上下游引物各（10μM/L）各1.0 μL，模板DNA3μL，補(bǔ)水至25μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4.3 PRRSV的檢測

1.4.3.1 病料的處理和總RNA的提取

將病料剪碎研磨，反復(fù)凍融3次后8 000 r/min離心5 min，取上清液，采用Trziol法抽提病毒的總RNA，RT擴(kuò)增條件：42 ℃恒溫作用1 h，95 ℃5 min，合成的cDNA-20 ℃保存?zhèn)溆没蛘咧苯佑糜谥蟮腜CR反應(yīng)。

1.4.3.2 病料的檢測

以上述cDNA作為模板，PRRSV檢測引物序列：F：5'-AAGCTGTT AAACAGGGAGTGG-3'，R：5'-C CAAAGAATACCAGCCCATCA-3’，擴(kuò)增片段443 bp；PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25μL/樣品）：上、下游引物（10μM/ L）各1.0μL，Taq Mix12.5μL，RNase Free dH2O7.5μL，cDNA3μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過凝膠（1.2%瓊脂糖）電泳進(jìn)行檢測。

1.4.4 PRRSV陽性毒株ORF5基因的擴(kuò)增及序列分析

利用ORF5引物對(duì)PRRS陽性標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PRRSVORF5引物序列：F：5'-AGGTGGGCAACCGTTTTA-3'，R：5'-CATCACTGGCGTGTAGGT AAT-3'，擴(kuò)增片段738 bp；反應(yīng)體系50 μL/樣品：cDAN2 μL，LATaq（5 U/μL）（TaKaRa）0.5μL，10×LA Taq Buffer 5μL，dNTPs（2.5 mMeach）8 μL，上、下游引物（10 μM/L）各1.0 μL，RNase Free dH2O32.5μL。ORF5基因PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。用10%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物膠回收純化后與PMD-18T載體連接，用ORF5引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后送至上海杰李公司進(jìn)行序列測定。測序所獲得的基因序列應(yīng)用生物軟件Lasergene分析。

2 結(jié)果

2．1 流行病學(xué)調(diào)查及病理解剖

該豬場存欄繁殖母豬55頭，后備母豬50頭，公豬4頭，斷奶前仔豬180頭，育肥豬300頭。2015年12月未斷奶仔豬與育肥豬相繼出現(xiàn)了體溫升高、呼吸困難、部分病豬耳朵、四肢內(nèi)側(cè)、腹部發(fā)紺，拉黃色稀糞，個(gè)別仔豬還出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈等癥狀,隨后倒地死亡。同時(shí)，該場懷孕母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎等現(xiàn)象。發(fā)病初期使用黃芪多糖、多種抗生素治療效果不佳，疫情迅速擴(kuò)散至全場。

剖檢可見肺實(shí)變、腫脹；全身多處淋巴結(jié)腫大、出血；喉頭有點(diǎn)狀出血；腎腫大表面有出血斑，脾腫大表面有出血點(diǎn)，膀胱內(nèi)膜有散在出血點(diǎn)。

2．2 PRV的PCR檢測

將采集的病料經(jīng)常規(guī)方法處理后，提取總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果見圖1，擴(kuò)增出一條約217 bp的片段，因此判定該死亡豬只感染了PRV。

2．3 PRRS的檢測結(jié)果

2.3.1 PCR檢測

圖1 偽狂犬病毒的PCR檢測

圖2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR檢測

將病料按常規(guī)方法處理后，提取基因組作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并經(jīng)瓊脂糖電泳，結(jié)果見圖2，擴(kuò)增出一條443 bp左右的片段，因此判定死亡豬只感染了PRRSV。

2.3.2 ORF5基因的擴(kuò)增及序列分析

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，得到的核苷酸片段與預(yù)期結(jié)果大小符合，為738 bp（圖3）。暫命名為HN-XY株。

利用Lasergene軟件分析HN-XY株與國內(nèi)外已發(fā)表毒株的ORF5序列核苷酸同源性，結(jié)果顯示分離株與高致病性代表株JXA1和HUN4的核苷酸同源性最高為99.2%和99.3%（圖4）。系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹表明分離株與JXA1同屬一分支，而與中國第一分離株CH-1a親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，處于不同的分支（圖5）。表明分離株為高致病性PRRSV。

圖3 PRRSV陽性毒株ORF5基因PCR擴(kuò)增

圖4 分離毒株與參考毒株ORF5基因核苷酸同源性比對(duì)結(jié)果

圖5 基于ORF5核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹

4 討論

通過流行病學(xué)調(diào)查、病理解剖、偽狂犬病毒PCR檢測、PRRSV的PCR檢測、PRRSV分離株ORF5基因的PCR擴(kuò)增及序列分析等方法對(duì)信陽市某豬場發(fā)生疫情的病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，綜合分析可以確診該場豬發(fā)生的疫病為高致病PRRSV和偽狂犬混合感染。

目前，對(duì)于PRRS并沒有特異性的治療方法，做好PRRS的防控工作尤為重要，PRRS疫苗的應(yīng)用為預(yù)防和控制PRRS的發(fā)生發(fā)揮了巨大的作用[5-6]。但是PRRS的不斷變異和新毒株的層出不窮[7-8]，為依賴疫苗進(jìn)行防控帶來了挑戰(zhàn)。疫苗免疫效果根據(jù)疫苗株與野毒株之間同源性的高低而不同，對(duì)變異較大的病毒株交叉免疫保護(hù)性較低，免疫效果不理想。由于該場使用的疫苗為傳統(tǒng)的PRRSV弱毒疫苗，這對(duì)普通PRRS保護(hù)是有效的，但對(duì)高致病性的PRRS的交叉保護(hù)比較差，遠(yuǎn)達(dá)不到預(yù)防與控制豬群疾病的目的。本次疫情的發(fā)生，就可能是豬繁殖與呼吸綜合征免疫的失敗而造成的。

豬繁殖與呼吸綜合征是一種免疫抑制性傳染病，機(jī)體感染后可導(dǎo)致免疫力嚴(yán)重下降；另外12月底外界氣溫低，為保暖起見豬場減少了豬舍與外界空氣對(duì)流的措施，豬舍內(nèi)空氣不流通再加上衛(wèi)生防疫管理差和飼養(yǎng)密度過大，保育豬抵抗力低；再者經(jīng)過了解該豬場育肥豬35日齡免疫一次豬偽狂病疫苗，母豬產(chǎn)前25 d免疫一次豬偽狂犬病疫苗，由于該豬場未能進(jìn)行合理次數(shù)的免疫，導(dǎo)致豬體抗體低下，導(dǎo)致本次偽狂犬病的發(fā)生。

本次對(duì)發(fā)病豬群進(jìn)行了診斷，診斷為HP-PRRSV和PRV混合感染，并成功分離到一株高致病性PRRSV毒株，為PRRSV的研究提供了試驗(yàn)材料。

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2016-05-17）

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（162102110034）。

連慧香（1978-），女，講師，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物健康生產(chǎn)與疫病防治。