牛艷君，李瑩，吳永娜，嚴(yán)祥

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000，1.老年病科；2.甘肅省生物治療與再生醫(yī)學(xué)重點實驗室）

?

骨髓間充質(zhì)干細胞對小鼠肝硬化模型的作用研究

牛艷君1，李瑩2，吳永娜2，嚴(yán)祥1

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000，1.老年病科；2.甘肅省生物治療與再生醫(yī)學(xué)重點實驗室）

［摘 要］目的 探索小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的培養(yǎng)和其肝硬化模型的制備，以及兩者之間的相互作用。方法 首先，提取小鼠骨髓，移至培養(yǎng)瓶中，根據(jù)全骨髓貼壁法的原理培養(yǎng)干細胞；然后，采用CCl4為主的方法對小鼠進行肝硬化模型的制備；最后，把培養(yǎng)成功的骨髓干細胞通過肝動脈和尾靜脈途徑移植治療造模成功的肝硬化小鼠，觀察療效。結(jié)果 根據(jù)多種單克隆抗體的表達，使用流式細胞儀進行鑒定，成功培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞；對造模小鼠肝臟組織進行病理切片，病理報告圖示典型的肝硬化，證明造模成功；通過肝動脈和尾靜脈途徑移植治療肝硬化模型小鼠，最后報告干細胞治療的病理結(jié)果，肝硬化程度減輕，說明骨髓間充質(zhì)干細胞具有一定的療效。結(jié)論 自體骨髓干細胞移植治療肝硬化是有效的，但仍需要基礎(chǔ)研究和大樣本的臨床數(shù)據(jù)。

［關(guān)鍵詞］骨髓間充質(zhì)干細胞；肝硬化模型；小鼠；移植

骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制的特點，而且來源廣泛，易于分離培養(yǎng)，自體移植不會產(chǎn)生免疫排斥［1］。肝硬化是臨床常見的慢性進行性肝病，病理組織學(xué)上有廣泛的肝細胞壞死、殘存肝細胞結(jié)節(jié)性再生，結(jié)締組織增生與纖維隔形成，導(dǎo)致肝小葉結(jié)構(gòu)破壞和假小葉形成，逐漸發(fā)展為肝硬化［2］。臨床上多采用內(nèi)科保守治療，但效果欠佳［3］。BMSCs是肝硬化時肝細胞的主要來源，可以修復(fù)、補充缺損的肝組織，達到改善肝臟功能的目的。BMSCs移植治療肝硬化是近年來研究的熱點，與肝移植相比，具有取材方便、無排斥反應(yīng)、安全性高及價格相對低廉等優(yōu)點，為肝硬化患者的治療提供了新的治療手段［4］。本實驗擬建立小鼠肝硬化模型，通過不同途徑注射小鼠BMSCs，進行基礎(chǔ)研究，為臨床應(yīng)用提供證據(jù)。

1　材料和方法

1.1實驗動物

清潔級BALB/C小鼠，骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)組為4只3日齡雄性乳鼠，肝硬化模型制備組為BALB/C雄性小鼠30只，體重為40～50 g，由甘肅省獸醫(yī)研究所動物研究中心提供。

1.2主要試劑和儀器

F12培養(yǎng)基（Hyclone公司）、血清（Gibco公司）、雙抗（青霉素及鏈霉素，Gibco公司）、0.25%的胰酶（含EDTA，Gibco公司）、PBS緩沖液、CD單克隆抗體（BD公司）、CCL4（蘭州化工廠）、苯巴比妥鈉（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院）、色拉油（金龍魚）、乙醇（北京二鍋頭）。Thermo二氧化碳培養(yǎng)箱、LICA倒置顯微鏡、流式細胞儀。

1.3方法

1.3.1骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)：采用全骨髓貼壁培養(yǎng)方法進行BMSCs的培養(yǎng)。用頸椎脫臼法處死小鼠，放入70%乙醇的燒杯中，使其體毛完全浸濕5 min，將大鼠放在超凈工作臺消毒托盤內(nèi)，用鑷子夾其腹中部皮膚，沿中間作一切口，剪開腹壁各層；將切口拉至股骨，小心分離股骨上的肌肉，從關(guān)節(jié)兩端剪斷股骨，放在盛有PBS液平皿中，再次去除肌肉并用PBS液沖洗3次；將股骨中間剪斷，用1 mL注射器吸取F12培養(yǎng)液（10%的血清、1%的雙抗）反復(fù)沖洗骨髓腔，沖出骨髓到15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入培養(yǎng)液，吹打散細胞，接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2小鼠肝硬化模型的制備：小鼠先在實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，不限食水。將小鼠進行隨機分組，正常對照組10只和肝硬化模型實驗組20只。實驗組前兩周為誘導(dǎo)期，苯巴比妥鈉0.35 g/L當(dāng)做飲用水使用，普通飼料喂養(yǎng)。之后6～8周的成模期，10% CCl4混合油溶液，劑量0.5 mL/100 g，皮下多點注射或腹腔注射，每周2次，10%乙醇為飲用水使用，普通飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)過程注意體重變化，體重降低10%，改為正常飲用水使用。對照組普通飼料加清水喂養(yǎng)。1.3.3 BMSCs的移植：每只小鼠注入BMSCs 1 mL，細胞數(shù)量為3×105個，正常對照組不進行移植，實驗組分為肝動脈和尾靜脈兩種途徑移植BMSCs，各8只小鼠。（1）肝動脈途徑：無菌手術(shù)條件下進行操作，暴露腹腔，找到肝總動脈、肝固有動脈和胃十二指腸動脈，在手術(shù)顯微鏡下，結(jié)扎胃十二指腸動脈遠端，動脈夾阻斷肝總動脈血流，胰島素注射器在胃十二指腸動脈結(jié)扎的前方快速注入BMSCs懸液，結(jié)扎胃十二指腸動脈前端，復(fù)通肝總動脈，關(guān)閉腹腔。（2）尾靜脈途徑：固定住大鼠尾巴，用酒精棉球反復(fù)擦拭距尾巴根部2 cm處皮膚，使得尾靜脈可見，1 mL注射器緩慢注入BMSCs懸液。移植后4周時間中，繼續(xù)皮下注射10% CCl4溶液。

2　結(jié)果

2.1BMSCs的觀察

培養(yǎng)箱放置48 h，進行換液，用PBS沖洗兩次，加入適量的培養(yǎng)基，當(dāng)細胞接近90%融合時，用胰蛋白酶進行消化，按1∶2的比例進行傳代，倒置顯微鏡下進行觀察細胞的形態(tài)，可見放射狀排列的細胞集落，伸出長短不一、粗細不均的突起，梭形細胞為主，胞漿豐富，胞核大、核仁清晰，細胞生長旺盛，原代培養(yǎng)第6天顯微鏡結(jié)果見圖1。

圖1　倒置顯微鏡圖（×200）

2.2BMSCs的鑒定

收獲3代以內(nèi)生長狀態(tài)良好細胞，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，用PBS（含1% BSA）清洗細胞3次，計數(shù)細胞，各管依次加入單克隆抗體CD90、CD105、CD29、CD14、CD31、CD11b、CD34、CD73、CD45。同時每管樣品設(shè)立同型陰性對照。避光冰上孵育45 min，用PBS（含1% BSA）洗滌細胞3次，以除去未結(jié)合抗體，用500 μL PBS（含1% BSA）重懸細胞，流式細胞儀進行檢測分析。流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)記結(jié)果顯示CD105、CD73、CD29、CD90的陽性表達率≥95%，CD14、CD11b、CD34、CD45、CD31的陽性表達率≤2%，符合干細胞的基本特性。見圖2。

2.3肝硬化小鼠造模結(jié)果

8～10周后，正常對照組的小鼠全部存活，毛發(fā)光澤，精神狀態(tài)好，體重增加，對外界刺激反應(yīng)敏感。肝硬化模型實驗組小鼠死亡4只，其余毛發(fā)變黃，凌亂無光澤，精神萎靡，對外界刺激反應(yīng)遲鈍。肉眼觀察小鼠肝臟表面形態(tài)、大小、顏色、質(zhì)地，病理切片，行HE染色，顯微鏡下觀察結(jié)果見圖3～4。

圖2　流式細胞圖

圖3　正常對照組小鼠肉眼和光鏡下肝臟組織圖片

圖4　肝硬化模型實驗組小鼠肉眼和光鏡下肝臟組織圖片

2.4BMSCs移植結(jié)果

實驗過程中，肝動脈組2只小鼠死亡，尾靜脈組1只小鼠死亡，其余實驗組小鼠生活狀態(tài)類似，未見明顯的異常。4周后，處死小鼠，肉眼觀察肝臟組織，進行病理組織切片和HE染色，結(jié)果顯示肝硬化得到一定程度的改善，兩種途徑對肝硬化的效果無太大的差異。見圖5～6。

3　討論

關(guān)于小鼠BMSCs的基礎(chǔ)研究方面，目前，培養(yǎng)BMSCs方法包括全骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法、細胞表面分子標(biāo)記分選法、紅細胞裂解法等［5-6］，本實驗所采用的全骨髓貼壁培養(yǎng)法，具有實驗步驟少、細胞貼壁時間短、細胞數(shù)量多，可以更好的保持細胞的活性狀態(tài)，并不改變胞形態(tài)、免疫表型等優(yōu)勢。實驗過程中對BMSCs的鑒定首先通過倒置顯微鏡對其進行基本的形態(tài)學(xué)觀察，一般情況下，細胞形態(tài)多數(shù)呈梭形、纖維狀或紡錘狀，細胞密度較高時成簇狀聚集生長現(xiàn)象，會呈放射狀排列；然后用流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)記，借助BMSCs表面抗原性，選擇BMSCs較特異性標(biāo)志的細胞表面的黏附分子，得到抗體的陰性和陽性表達率，從而判斷所培養(yǎng)的細胞是否為干細胞。構(gòu)建一種穩(wěn)定、可靠、模擬性強的肝硬化小鼠模型，可以對此類疾病及其相關(guān)藥理學(xué)實驗進行研究，此類方法包括以CCl4為主誘導(dǎo)、CCl4和乙醇復(fù)合高脂肪飲食為主誘導(dǎo)、二甲基亞硝胺、硫代乙酞胺、酒精、血清免疫法等進行建立肝硬化模型［7-8］。本實驗使用CCl4、乙醇復(fù)合高脂肪飲食為主誘導(dǎo)的肝硬化模型，其為多因素導(dǎo)致動物肝硬化，可節(jié)約時間、成功率高、死亡率低，具有簡便易行、價廉及病變典型等優(yōu)點，有助于研究外在因素對肝硬化進程的干預(yù)作用。

圖5　BMSCs移植小鼠肉眼和光鏡下肝臟組織圖片

圖6　BMSCs移植小鼠肉眼和光鏡下肝臟組織圖片

通過肝動脈和尾靜脈兩種途徑對肝硬化小鼠進行BMSCs移植治療，治療效果相當(dāng)，一方面可能因為解剖學(xué)特點，某種程度上影響了移植途徑的選擇，另一方面由于干細胞自身具有趨化和旁分泌作用，促使不同途徑移植的干細胞都遷徙到損傷的肝臟，同時分泌的多種因子隨血液循環(huán)進入肝臟，進一步改善肝臟功能，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。由此可見，干細胞對肝硬化的治療作用不完全取決于移植途徑，可進一步試驗多種移植途徑對多種肝硬化動物模型的作用，從而獲得更為完整的研究數(shù)據(jù)。

在臨床上，BMSCs是肝硬化時肝細胞的主要來源，在特定環(huán)境下可分化成肝干細胞及肝細胞，為細胞移植治療終末期肝病的靶細胞。BMSCs具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為多種組織細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)，被認(rèn)為是引入臨床治療的最優(yōu)干細胞［9-11］。陳陽述等［12］臨床上針對33名肝硬化患者進行自體BMSCs移植治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝臟代謝功能提高，同時患者腹脹、黃疸等癥狀顯著改善，自體BMSCs經(jīng)過體外分離再將其植入患者肝臟內(nèi)，促進了內(nèi)源性肝細胞的增殖過程，避免排斥反應(yīng)，加快了肝組織的恢復(fù)。

BMSCs移植治療肝硬化是國內(nèi)外研究的熱點，近年來對其研究逐漸深入，經(jīng)過動物模型及臨床的研究，已經(jīng)證實其有效性，臨床上成功治療的案例，國內(nèi)外均有報道。但是依舊存在需要探討的問題，基礎(chǔ)研究方面，缺乏特異性對人體無損害又便于跟蹤的移植細胞標(biāo)記物；臨床應(yīng)用方面，干細胞多種移植途徑的效果和可行性仍需要臨床上隨機對照及雙盲研究的治療數(shù)據(jù)，以便得出更科學(xué)的結(jié)論。

參考文獻：

［1］ KARAGIANNI M， KINZEBAEH S. A comparative analsis of the adipogenie pntential in human mesenchunal stromal cellsfrom cord blood and other sources ［J］. Cytotherapy， 2013，15（1）: 76-88.

［2］ XUE H L， ZENG W Z， WU X L， et al. Clinical therapeutic effects of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cellstransplantation in the treatment of end-stage liver disease ［J］. Transplant Proc， 2015， 47（2）: 412-418.

［3］ ROURA S， GáLVEZ-MONTóN C， BAYES-GENIS A. Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells: new therapeutic weapons for idiopathic dilated cardiomyopathy ［J］. Int J Cardiol， 2014， 177（3）: 809-818.

［4］ REINDERS M E， DE FIJTER J W， ROELOFS H， et a1. Autologons bone marrowderived Mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: resμLts of a phase I study ［J］. Stem Cells Transl Med， 2013，2（2）: 107-111.

［5］ LEE D H， LEE M J， KIM Y S， et al. Sample rotation angle dependence of graphene thickness measured using atomic force microscope ［J］. Carbon， 2015， 81（3）: 210-215.

［6］ OTABE KOJI， NAKAHARA HIROYUKI， HASEGAWA AKIHIKO， et al. Transcription Factor Mohawk Controls Tenogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro and In Vivo ［J］. J Orthop Res， 2015， 33 （1）: 1-8.

［7］ ANDREWS SIMON， REZA SALEHAN， MOHAMMAD. Morse Ruth. Effects of Bone Marrow-Mesenchymal Stem Cells on genotoxic sensitivity of Myeloma cells to Melphalan in vitro ［J］. Mutagenesis， 2014， 29（7）: 527-528.

［8］ HUA PING， WANG YOU-YU， LIU LI-BAO， et al. Invivo magnetic resonance imaging tracking of transplanted superparamagnetic iron oxide labeled bone marrow mesenchymal stem cells in rats with myocardial infarction ［J］. Mol Med Rep， 2014， 11（11）: 113-120.

［9］ SVYSTONYUK D A， NGU J M， MEWHORT H E， et al. Fibroblast growth factor-2 regμLates human cardiac myofibroblast-mediated extracellμLar matrix remodeling ［J］. J Transl Med， 2015， 13（1）: 147.

［10］ SEEBER A， MARTOWCIZA A， Spizzo G， et al. Soluble Ep-CAM levels in ascites correlate with positive cytology and neutralize catumaxomab activity in vitro ［J］. BMC Cancer，2015， 15（1）: 372.

［11］ PARK J H， HONG J. Continuous release of bFGF from mμLtilayer nanofilm to maintain undifferentiated human iPS cell cμLtures ［J］. Inegrative Biology， 2014， 6（12）: 1196-1200.

［12］ 陳陽述， 歐陽石， 程濤， 等.自體骨髓干細胞移植治療失代償期乙型肝炎肝硬化臨床觀察 ［J］. 實用肝臟病雜志， 2013，16（2）： 116-118.

（本文編輯：張和，魯翠濤）

·經(jīng)驗交流·

·論著 基礎(chǔ)研究·

Research of bone marrow mesenchymal stem cells on the cirrhosis model in mice

NIU Yan-jun1，LI Ying2， WU Yong-na2， YAN Xiang1.1Department of Geriatrics；2Gansu Key Laboratory of Biotherapy and Regenerative Medicine， the First Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730000， China

AbstractObjective To explore the cultivation of mice bone marrow mesenchymal stem cells and the preparation of mice liver cirrhosis model， as well as the interaction of two methods. Methods First of all， the mice BMSCs were extracted to culture bottle， further separated and cultured in vitro； then， mice liver cirrhosis model was prepared by the approach of CCl4-based； finally， BMSCs were transplanted into mice liver cirrhosis model through the hepatic artery and tail vein. Results According to the expression of monoclonal antibodies， the mice BMSCs were identified by means of flow cytometry and cultured successfully； mice liver tissue was executed via pathological section， the pathological findings reported typical cirrhosis and modelled successfully； BMSCs transplantation therapy had a certain effect was proved by final pathology results and cirrhosis abated. Conclusion It is effective that autologous BMSCs transplantation treat liver cirrhosis， but basic research and a large sample of clinical data are still demanded.

Key wordsbone marrow mesenchymal stem cells； cirrhosis model； mice； transplant

［通訊作者簡介］嚴(yán)祥，教授，E-mail：yanxiang528@sohu.com。

［第一作者簡介］牛艷君（1989-），女，陜西延安人，碩士。

［基金項目］甘肅省科技重大專項項目（1302FKDA029）。

［收稿日期］2015-12-15

［中圖分類號］R657.3+1

［文獻標(biāo)識碼］A

DOI：10.11952/j.issn.1007-1954.2016.03.007