文/王玉堂

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疫苗在水生動物疾病預(yù)防中的作用及應(yīng)用前景（二）

文/王玉堂

用藥指導(dǎo)

(上接2016年 第4期)

三、我國水產(chǎn)疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中的應(yīng)用前景

首先需要說明的是，魚類具有較健全的免疫器官和組織，也具有一系列的免疫細(xì)胞，這些都是對魚類實(shí)施免疫預(yù)防各種疾病的免疫基礎(chǔ)。魚類免疫器官和組織主要有胸腺、腎臟和黏膜淋巴組織等，這些是魚類最主要的免疫器官和組織；其次還有參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答有關(guān)的，統(tǒng)稱為免疫細(xì)胞。魚類的免疫細(xì)胞還可分為兩大類，即淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞。淋巴細(xì)胞主要參與特異性免疫應(yīng)答，在免疫應(yīng)答中起核心作用。一類免疫細(xì)胞主要存在于免疫器官、組織及血液、淋巴中。因?yàn)轸~類有較為健全的免疫系統(tǒng)，這也就是應(yīng)用魚用疫苗預(yù)防疾病的基礎(chǔ)。全世界已有100多種魚用疫苗的商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用，說明利用疫苗進(jìn)行魚類的疾病預(yù)防具有廣泛的市場的應(yīng)用效果。

我國養(yǎng)殖的魚類種類很多，而且一些常規(guī)養(yǎng)殖品種的年產(chǎn)量巨有感，一旦開發(fā)成功相應(yīng)的魚用疫苗，其應(yīng)用市場也是非常巨大的。魚用疫苗的開發(fā)與應(yīng)用，可有效預(yù)防細(xì)胞性疾病，減少抗生素類藥物用量，即能有效降低用藥成本，又能解決藥物殘留之水產(chǎn)品質(zhì)量安全問題，還可降低水產(chǎn)品消費(fèi)者通過食物鏈而產(chǎn)生耐藥性風(fēng)險(xiǎn)。

我國隨著加入WTO漁業(yè)新形勢的變化和人們對食品質(zhì)量的需求，農(nóng)業(yè)部先后出臺了無公害水產(chǎn)品養(yǎng)殖規(guī)范、禁用漁藥物清單等系列與水產(chǎn)品安全相關(guān)的行動計(jì)劃。疫苗可使魚類高特異抵御病原的攻擊，這對占我國水產(chǎn)養(yǎng)殖病害總損失達(dá)80%以上、并由細(xì)菌、病毒和寄生蟲等病原為主致病的海、淡水養(yǎng)殖魚類而言，疫苗開發(fā)與應(yīng)用的意義極為重大。由水產(chǎn)動物疫苗等免疫制劑替代危害性大的化學(xué)藥品已勢在必行，此類綠色、環(huán)保產(chǎn)品大有在3年～5年后成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)抗病的明星產(chǎn)品的希望。

（一）消除水產(chǎn)品藥物殘留隱患急需水產(chǎn)疫苗的開發(fā)

長期以來，我國水產(chǎn)疫病的控制主要依靠使用各種抗生素和化學(xué)藥物，但大量使用藥物的后果令人擔(dān)憂,已嚴(yán)重危及環(huán)境和人體健康。目前生產(chǎn)上使用漁藥大部分由獸藥、農(nóng)藥移植而來，缺乏對藥效學(xué)、藥物代謝動力學(xué)、毒理學(xué)及對養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的影響等基礎(chǔ)理論的研究；藥物的臨床驗(yàn)證工作未受到足夠的重視，藥物的給藥劑量、用藥程序、休藥期缺乏科學(xué)依據(jù)，導(dǎo)致濫用、錯(cuò)用漁藥的情況十分普遍。此外我國缺乏快速、簡便的實(shí)用性診斷技術(shù)，難以做到對癥下藥或?qū)σ蚴┧帲つ坑盟幀F(xiàn)象極為嚴(yán)重。長期濫用藥物違背人們所倡導(dǎo)的健康養(yǎng)殖宗旨，不僅藥物的使用效果受到了限制，延誤治病，造成大量死亡和藥物投入的雙重?fù)p失；還可誘發(fā)細(xì)菌基因突變或轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致無藥可用；更嚴(yán)重的是藥物在養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留和養(yǎng)殖環(huán)境的嚴(yán)重污染，我國水產(chǎn)品藥物殘留量超標(biāo)出口受阻的教訓(xùn)極為慘重，養(yǎng)殖業(yè)賴于持續(xù)發(fā)展的某些生態(tài)資源枯竭化。隨著人們對抗菌素等藥物使用的安全性日益重視，認(rèn)識已從以前的“靶動物安全”到“人類食品安全”和“環(huán)境安全”。鑒于此，當(dāng)前開展“消除水產(chǎn)品藥物殘留隱患的抗病技術(shù)研究”已顯得尤為重要，急需水產(chǎn)疫苗的開發(fā)應(yīng)用。

（二）水產(chǎn)疫苗的抗感染特性有廣泛的作用范圍

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展，近20年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的疫病頻繁發(fā)生，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全國每年水產(chǎn)養(yǎng)殖以疫病為主的病害發(fā)病率達(dá)50%以上，損失率20%左右，年經(jīng)濟(jì)損失數(shù)百億元之巨，并且還有上升的趨勢，顯然，疫病是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重大制約因素之一。根據(jù)疫苗的作用原理和大量的研究數(shù)據(jù)表明，水產(chǎn)疫苗適用于魚類、爬行類和兩棲類等脊椎動物，并特異性地針對病毒、細(xì)菌和寄生蟲等病原的感染。2004年中國水產(chǎn)養(yǎng)殖病害監(jiān)測報(bào)告顯示，我國水產(chǎn)病害各類養(yǎng)殖對象損失比例中，魚類占80%以上（圖2），各類型病害比例中病毒、細(xì)菌和寄生蟲分別占12.4%、41.4%、和26.9%共達(dá)80%以上（圖3），表明疫苗的作用范圍廣，在預(yù)防我國水產(chǎn)養(yǎng)殖傳染病將有良好的應(yīng)用前景。

圖2　2004年我國水產(chǎn)病害各類養(yǎng)殖對象損失比例

圖3　2004年我國水產(chǎn)養(yǎng)殖各類型病害比例

（三）水產(chǎn)動物免疫研究得到關(guān)注，產(chǎn)品研究儲備狀態(tài)良好

近年來，水產(chǎn)動物免疫研究成為熱點(diǎn)，得到了國家自然科學(xué)基金、973計(jì)劃、863計(jì)劃、攻關(guān)計(jì)劃以及省部等科技計(jì)劃的資助，加上分子技術(shù)的應(yīng)用，一些重要養(yǎng)殖對象的疫苗研究有了飛躍式的進(jìn)展。在水產(chǎn)動物免疫學(xué)基礎(chǔ)方面，開展了海水魚、鱖魚等免疫球蛋白發(fā)生發(fā)育學(xué)、鱖粘膜抗體特性及其免疫應(yīng)答規(guī)律、施氏鱘體液免疫及調(diào)控機(jī)制、水生實(shí)驗(yàn)動物劍尾魚免疫評價(jià)模型建立——免疫調(diào)節(jié)和免疫遺傳基因MHC研究等；在病原功能基因方面，獲取了大菱鲆虹彩病毒、鱖魚病毒和魚類神經(jīng)壞死病毒的主衣殼蛋白(MCP)基因、鯉春病毒血癥病毒囊膜蛋白基因、弧菌外膜蛋白基因和毒素基因等，并進(jìn)行了基因的克隆、高效表達(dá)與功能分析。部分疫苗已進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室魚體保護(hù)性試驗(yàn)和田間有效性試驗(yàn)階段（表3），并且疫苗的研究向浸泡甚至是口服等易于疫苗施予、低成本工廠化生產(chǎn)工藝的方向努力?？梢灶A(yù)見，這些階段性成果的進(jìn)一步熟化，可在未來的3年～5年將有系列疫苗產(chǎn)品逐步實(shí)現(xiàn)商品化，將在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)病害防治中發(fā)揮重大作用。

（四）嗜水氣單胞疫苗研究取得新進(jìn)展

嗜水氣單胞菌的致病范圍十分廣泛，可引起水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的赤斑病、打印病、腐皮病，對蝦敗血癥，蛙類的紅腿病，鱉類的穿孔病等。嗜好水氣單胞菌可產(chǎn)生許多致病因子，目前已確證的毒力因子有氣溶素、溶血素細(xì)胞毒性腸毒素、胞外蛋白酶、載鐵體、s層蛋白及Ⅳ型菌毛等，其中胞外酶是重要的致病因子之一。

1.免疫機(jī)制

從非特異性細(xì)胞免疫角度看，嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌啟動了巨噬細(xì)胞的吞噬活動，它們的表面蛋白層保護(hù)菌體免于吞噬細(xì)胞破壞，從而為細(xì)菌在體內(nèi)擴(kuò)散、進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)繁殖和形成病灶提供了條件。關(guān)于嗜水氣單胞菌體液免疫機(jī)制的研究尚不全面，一些學(xué)者的研究表明，不同種類的水產(chǎn)動物對嗜水氣單胞菌的抵抗力有所差別，在對青、鰱、鳙四大家魚的抵抗力研究中得出嗜水氣單胞4種魚的半致死濃度存在著顯著差異。此外，同一種動物的不同養(yǎng)殖品種對嗜水氣單胞菌的抵抗力也存在著差異。

2.疫苗種類

嗜水氣單胞菌疫苗于1993年冬季開始在浙江、江蘇、湖北、河北等省廣泛使用。試驗(yàn)對象包括鯽、鰱、鳙等種類，到目前為止，已累積試驗(yàn)和推廣應(yīng)用疫苗5萬畝以上。疫苗的應(yīng)用有效地預(yù)防了嗜水氣單胞菌敗血癥的發(fā)生和流行，每年由此而減少的經(jīng)濟(jì)損失上千萬元。

全菌滅活疫苗：來活疫苗是指利用某種方式滅活烈性野生病原的感染性，但保留其免疫原性而制備的疫苗。制備方法是通過細(xì)胞或生物接種，大量擴(kuò)增和收集病原體，然后以物理或化學(xué)方法，在確保免疫活力的情況下，將病原滅活。

研究表明，嗜水氣單胞菌熱滅活苗直接浸浴免疫能夠引進(jìn)魚類局部的粘膜免疫應(yīng)答。陳月英等（1996）用福爾馬林滅活的嗜水氣單胞菌強(qiáng)毒株的全菌苗、胞外產(chǎn)物苗和菌體破碎苗分別免疫鯽魚后的結(jié)果可見，全菌苗注射免疫保護(hù)率為100%，破碎菌體苗的保護(hù)率為80%，以全菌苗最佳。相比之下，減毒活疫苗由于其具有回復(fù)農(nóng)歷變致病的缺點(diǎn)而幾乎不被應(yīng)用于生產(chǎn)中。丁詩華等（2007）用聚乳酸——乙醇酸共聚物包裹嗜好水氣單胞菌全菌后通過口服法誘導(dǎo)草魚的免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)魚體可以產(chǎn)生血清型抗體應(yīng)答和粘膜抗體應(yīng)答2種免疫應(yīng)答機(jī)制。

表3　我國正在研究的水產(chǎn)疫苗產(chǎn)品

亞單位疫苗：亞單位疫苗即通過提取病原的某些成分制備成的疫苗。如病毒的衣殼蛋白、包膜糖蛋白、細(xì)菌的外膜蛋白、脂多糖（LPS）、外毒素、胞外蛋白酶等。亞單位疫苗的優(yōu)點(diǎn)是除去了病原核酸，避免抗原間的競爭，提高了免疫效果；因此具有接種劑量小、免疫原性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。董傳甫等（2005）制備了嗜水氣單胞菌主要外膜蛋白免疫刺激復(fù)合物亞單位疫苗，腹腔注射免疫歐洲鰻鱺，結(jié)果表明，10倍半致死劑量的攻擊的免疫保護(hù)率為80%以上，且沒有明顯的血清型特異性。

基因工程疫苗：基因基因疫苗包括基因工程亞單位疫苗、活載體疫苗核酸疫苗和多肽疫苗等，是隨著分子生物學(xué)技術(shù)，特別是DNA重組技術(shù)的發(fā)展而出現(xiàn)的一類新型疫苗。在魚類基因工程疫苗上，陳懷青等（1997）進(jìn)行了嗜水氣單胞菌HBC毒素基因的克隆及酶譜分析，為基因工程疫苗的研制提出了目的基因片段。謝俊鋒等（2002）用嗜水氣單胞菌外膜蛋白o(hù)mpTS基因在大腸桿菌中獲得表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定，且表達(dá)量高達(dá)51%，具有原外膜蛋白的免疫原性。

3.發(fā)展前景

目前，我國在全菌疫苗、減毒疫苗和菌體成分亞單位疫苗的制備上已經(jīng)取得了一些科研成果，但因嗜水氣單胞菌血清型眾多，不同地區(qū)、不同魚種類分離的菌株差異明顯，滅活疫苗使用劑量大，機(jī)體的免疫應(yīng)答水平低，弱弱毒苗存在毒力反應(yīng)強(qiáng)等原因而導(dǎo)致免疫效果不佳。近幾年針對嗜水氣單胞菌的保護(hù)性抗原基因構(gòu)成的基因工程疫苗以及更新一代的核酸疫苗，都具有較好地免疫效果，但仍處于試驗(yàn)階段，尚無商品化的疫苗投放市場，因此，開發(fā)新型疫苗以針對多種血清型菌株仍是今后防治嗜水氣單胞菌性疾病的重要方向。

四、魚類免疫佐劑的研究及其前景

近幾十年來，隨著魚用疫苗的研發(fā)和應(yīng)用，與魚用疫苗密切相關(guān)的魚用免疫佐劑的研究也越來越受到重視。隨著疫苗的研發(fā)不斷深入，特別是分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，研制出的新型工程疫苗純度高、特異性強(qiáng)，免疫原性相對較差，難以產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，需要佐劑來增強(qiáng)其免疫原性或宿主對抗原的保護(hù)性應(yīng)答。其中常用的佐劑有：

1.鋁鹽佐劑 鋁鹽佐劑能含油吸附抗原緩慢釋放、較長時(shí)間刺激免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫反應(yīng)。

2.油性乳劑 弗氏佐劑是含油的一種，其最大特點(diǎn)是具有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)效應(yīng)，是應(yīng)用最為廣泛的實(shí)驗(yàn)用佐劑。

3.微生物佐劑 微生物佐劑主要有脂多糖、分枝桿菌等。

4.天然來源及中草藥佐劑 人們發(fā)現(xiàn)許多中藥的活性成分，如苷類多糖等有很好的免疫調(diào)節(jié)作用。

免疫佐劑是生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑中的免疫調(diào)節(jié)劑，非特異性免疫刺激作用是使機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答所必需的基本條件，如果這種作用過度或過強(qiáng)，必然會出現(xiàn)毒副作用。以上所述的佐劑種類很多，效果也是確定的，但也有一些不可避免的缺點(diǎn)，如油性佐劑存在粘滯性、穩(wěn)定性及注射局部反應(yīng)等問題，氫氧化鋁不足以誘導(dǎo)弱抗原的免疫反應(yīng)，且不能誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。

理想的佐劑是以最小的免疫刺激可引起適當(dāng)?shù)拿庖叽龠M(jìn)作用，且無不良反應(yīng)。中藥與合成藥物相比較，具有不良反應(yīng)少、毒副作用小、多效性、雙向調(diào)節(jié)性和無依賴性的特點(diǎn)。因此，具有免疫調(diào)節(jié)活性，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力的中藥正在成為理想的新型疫苗佐劑。中藥對免疫系統(tǒng)發(fā)揮多方面的重要調(diào)節(jié)作用，它不僅能激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞（M5）、自然殺傷細(xì)胞（NK）、細(xì)胞毒細(xì)胞（CTL）、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK）等免疫細(xì)胞，還能活化補(bǔ)體，促進(jìn)細(xì)胞因子生成。其中，中藥有效單體免疫佐劑有許多優(yōu)點(diǎn)：一是成份單一，容易闡明作用機(jī)制；二是相互干擾少；三是分子結(jié)構(gòu)明確（可以進(jìn)一步研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，通過結(jié)構(gòu)改造、化學(xué)修飾等方法有望開發(fā)出更好的佐劑）；四是量效關(guān)系、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制十分容易。中藥提取分離技術(shù)的進(jìn)步，為中藥單體佐劑的開發(fā)創(chuàng)造了條件。

中藥免疫佐劑雖然在安全性質(zhì)方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性，但是在作用機(jī)理方面的研究去顯得十分薄弱。目前，中藥免疫佐劑作用機(jī)理主要從中藥免疫佐劑對免疫系統(tǒng)的免疫器官、免疫細(xì)胞及免疫因子的作用來闡述其免疫佐劑的作用機(jī)理。但是，中藥免疫佐劑是通過什么方式影響免疫系統(tǒng)的，還有待于進(jìn)一步研究。只有在了解作用機(jī)理的基礎(chǔ)上，才能更加合理地開發(fā)使用中藥免疫佐劑。隨著對免疫系統(tǒng)的深入認(rèn)識的分子受體機(jī)制的了解，在分子受體層面上闡述中藥佐劑作用機(jī)制是必要的中藥醫(yī)理論、免疫調(diào)節(jié)、中藥免疫佐劑作用機(jī)理等方面的理論研究成果，將使得中藥佐劑的開發(fā)更加高效，進(jìn)而研制成具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的高效、低毒、經(jīng)濟(jì)的新型中藥免疫佐劑。

（未完待續(xù)）

作者單位：全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站