虞效益 李 威 陳光明, 3 徐美娟

(1浙江大學寧波理工學院 寧波 315100) (2浙江省制冷與低溫技術重點實驗室 杭州 310027) (3浙江大學制冷與低溫研究所 杭州 310027)

折光率法測定低溫保護劑濃度研究

虞效益1, 2李 威1陳光明1, 2, 3徐美娟1

(1浙江大學寧波理工學院 寧波 315100) (2浙江省制冷與低溫技術重點實驗室 杭州 310027) (3浙江大學制冷與低溫研究所 杭州 310027)

采用阿貝折射儀測量了不同溫度(15、25和35 ℃)和低溫保護劑濃度(0—40%wt)下，5種典型低溫保護劑溶液(二甲亞砜/氯化鈉/水、甘油/氯化鈉/水、乙二醇/氯化鈉/水、丙二醇/氯化鈉/水和海藻糖/氯化鈉/水溶液，其中氯化鈉濃度為一定值0.9%wt)的折光率，并擬合得到了折光率與低溫保護劑濃度和溫度之間的關系式。5種低溫保護劑溶液的折光率均隨低溫保護劑濃度的升高而增大，隨溫度的升高而減小，且呈線性變化關系，但低溫保護劑濃度對折光率的影響要遠大于溫度的影響。本研究表明可以通過測量溶液的折光率確定其中所含低溫保護劑的濃度。折光率法所需設備便宜、操作簡單快速，且適用于寬濃度范圍內低溫保護劑的定量分析。

折光率 低溫保護劑 二甲亞砜 甘油 乙二醇 丙二醇 海藻糖

1 引 言

低溫保存是指將活的生物樣品采用特殊的方法冷卻至低溫(一般為-196 ℃)并長期保存，待需要時，將生物樣品按特殊的方法加熱至正常溫度，仍可獲得活的生物樣品[1]。到目前為止，人們已經能夠將人體血液、精子、胚胎、胰島、角膜、皮膚等進行成功的低溫保存，為細胞和組織器官的移植帶來極大的便利；牛、羊等動物精子、胚胎的低溫保存和農作物種質的低溫儲存，為發(fā)展農業(yè)、畜牧業(yè)和挽救瀕危動植物帶來巨大的經濟和社會效益。

低溫保存生物樣品時，除了極簡單的微生物、病毒和細菌等外，一般而言添加低溫保護劑是必需的。自1948年發(fā)現(xiàn)甘油的低溫保護作用[2]之后，多種多樣的低溫保護劑被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并廣泛使用，比如二甲亞砜、丙二醇、乙二醇以及各種糖類等[1, 3-4]。低溫保護劑雖能在低溫下對生物樣品起保護作用，但同時也極易在載入和取出過程中對生物樣品造成各種損傷[1]。因此，無論是在前期加載還是后期洗脫過程中，測定加載溶液和洗脫溶液中低溫保護劑的濃度都顯得至關重要。

到目前為止，研究者已經提出和采用多種不同的低溫保護劑定量分析方法，其中以核磁共振(NMR)[5-7]和高效液相色譜(HPLC)[8-9]應用最多。理論上，NMR和HPLC適用于測定多種低溫保護劑，但目前多見于對二甲亞砜的定量，其它低溫保護劑的分析方法仍有待摸索。另外，NMR和HPLC方法所需設備昂貴、操作復雜、對分析樣品要求高。近來，有研究者提出滲透壓儀法，即采用滲透壓儀測得低溫保護劑溶液的質量滲摩爾濃度(osmolality，指在1 kg溶劑中所溶解的具有滲透作用的微粒的量，單位osm/kg或osmol/kg)，再經過換算以得到所要的濃度，該法已成功應用于二甲亞砜、甘油、乙二醇和丙二醇的定量[10-12]。滲透壓儀法雖然所需設備便宜、操作簡單，但不適用于測定高濃度的溶液[13]。筆者所在研究小組曾依據二甲亞砜含有亞砜基團(—SO—)這一硫基生色團的特性，采用紫外吸收光譜法測定溶液中二甲亞砜的含量[14]。然而，紫外吸收光譜法適用于對稀溶液的定量分析，且該法是否適用于其它低溫保護劑也有待研究。

本文采用阿貝折射儀測定了不同溫度和低溫保護劑濃度下五種典型低溫保護劑溶液的折光率，并建立了折光率與溫度和低溫保護劑濃度之間的關系式。折光率法所需設備便宜、操作簡單快速，且適用于寬濃度范圍內低溫保護劑的定量分析。

2 材料與方法

2.1 樣品溶液配制

二甲亞砜、甘油、乙二醇、丙二醇、海藻糖和氯化鈉具有分析純等級。

采用稱重法配制一系列低溫保護劑濃度分別為0、5 %wt、10 %wt、15 %wt、20 %wt、30 %wt和40 %wt的樣品溶液，共35份，每種樣品溶液的氯化鈉濃度保持一定值(即0.9 %wt)。比如要配制濃度為10 %wt的二甲亞砜/氯化鈉/水溶液，可將10 g二甲亞砜和0.9 g氯化鈉溶于89.1 g蒸餾水中，攪拌均勻。藥品和試劑的稱重采用賽多利斯BSA124S電子天平，精度為±0.1 mg。

2.2 折光率測量

折光率測量裝置如圖1所示，阿貝折射儀(型號2WA-J，含溫度計)，恒溫槽(型號WG-DCX，控溫精度±0.1 ℃)。

圖1 折光率測量裝置Fig.1 Set up for measurement of refractive index

設置恒溫槽溫度分別為15、25和35 ℃，待溫度穩(wěn)定十分鐘后開始測量。在測量樣品溶液折光率之前，先用儀器自帶標準試樣對阿貝折射儀進行校正。每測量一次樣品溶液之后將進光棱鏡的毛面和折射棱鏡的拋光面用無水酒精與乙醚(1∶4)的混合液和脫脂棉花輕擦干凈，以免影響下次測量。

2.3 數(shù)據擬合

實驗所得折光率數(shù)據采用如下公式進行擬合:

(1)

式中：n為折光率;t為溫度，℃；x為低溫保護劑的質量分數(shù)，C1、C2、C3和C4為待擬合系數(shù)。擬合采用Origin 9.0軟件的自定義曲面函數(shù)擬合功能，擬合優(yōu)度評價指標為決定系數(shù)R2。由式(1)可推出低溫保護劑的質量分數(shù)計算式為：

(2)

3 結果與討論

不同溫度和低溫保護劑濃度下，測量得到的5種典型低溫保護劑溶液的折光率數(shù)據如表1—5所示。采用式(1)分別對每種低溫保護劑溶液的折光率數(shù)據進行擬合，所得公式系數(shù)值列于表6中，較高的R2值表明擬合效果優(yōu)異。從表1—5可以看出，5種低溫保護劑溶液的折光率均隨低溫保護劑濃度的升高而增大，隨溫度的升高而減小。而公式(1)對實驗所得折光率數(shù)據優(yōu)異的擬合效果表明，折光率隨低溫保護劑濃度和溫度的變化均呈線性關系。

表1 二甲亞砜/氯化鈉/水溶液的折光率

表2 甘油/氯化鈉/水溶液的折光率

表3 乙二醇/氯化鈉/水溶液的折光率

表4 丙二醇/氯化鈉/水溶液的折光率

表5 海藻糖/氯化鈉/水溶液的折光率

表6 擬合得到的公式系數(shù)值及擬合優(yōu)度

將式(1)分別對t和x求偏導，可得折光率隨溫度和低溫保護劑濃度的變化率關系式為：

(3)

(4)

代入表6所列系數(shù)值，可知在當前的溫度以及低溫保護劑濃度范圍內：

(1)?n/?t<0，表明折光率隨溫度的升高而減小。絕對值|?n/?t|隨低溫保護劑濃度的升高而增大，表明低溫保護劑濃度越高，溫度對折光率的影響越大；

(2)?n/?x>0，表明折光率隨低溫保護劑濃度的升高而增大。?n/?x隨溫度的升高而減小，表明溫度越高，低溫保護劑濃度對折光率的影響越小；

(3)表7給出了|?n/?t|和?n/?x的取值范圍以及兩者之間的關系，表明低溫保護劑濃度對折光率的影響要遠大于溫度的影響。以25 ℃ 、15 %wt的二甲亞砜/氯化鈉/水溶液為例，溫度變化±5 ℃引起折光率變化±0.000 78，換算成二甲亞砜濃度的變化則僅為±0.5 %wt。因此，在測量低溫保護劑溶液的折光率時，溫度并不是一個重要的控制參數(shù)，當要求不高時，甚至可以不考慮溫度的影響。

表7 |?n/?t|和?n/?x的取值范圍以及兩者之間的關系

注：下標max表示最大值，下標min表示最小值。

4 結 論

采用阿貝折射儀測定了不同溫度和低溫保護劑濃度下5種典型低溫保護劑溶液的折光率，并建立了折光率與溫度和低溫保護劑濃度之間的關系式。主要結論如下：

(1)低溫保護劑溶液的折光率隨低溫保護劑濃度的升高而增大，隨溫度的升高而減小，且呈良好的線性變化關系，但低溫保護劑濃度對折光率的影響要遠大于溫度的影響。

(2)當溶液中只含單種低溫保護劑時，可以通過測量溶液的折光率確定其中所含低溫保護劑的濃度。折光率法所需設備便宜、操作簡單快速，且適用于寬濃度范圍內低溫保護劑的定量分析。

1 華澤釗, 任禾盛. 低溫生物醫(yī)學技術[M]. 北京: 科學出版社, 1994.

Hua Zezhao, Ren Hesheng. Cryo-Biomedicine Technology [M]. Beijing: Science Press, 1994.

2 Polge C, Smith A U, Parkes A S. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures [J]. Nature, 1949, 164：666.

3 Lovelock J E, Bishop M W H. Prevention of freezing damage to living cells by dimethyl sulphoxide [J]. Nature, 1959, 183: 1394-1395.

4 Eroglu A, Russo MJ, Bieganski R, et al. Intracellular trehalose improves the survival of cryopreserved mammalian cells [J]. Nature Biotechnology, 2000, 18(2): 163-167.

5 Bateson E A J, Busza A L, Pegg D E, et al. Permeation of rabbit common carotid arteries with dimethyl sulfoxide [J]. Cryobiology, 1994, 31(4): 393-397.

6 Muldrew K, Sykes B, Schachar N, et al. Permeation kinetics of dimethyl sulfoxide in articular cartilage [J]. CryoLetters, 1996, 17(6): 331-340.

7 Mukherjee I N, Li Y, Song Y C, et al. Cryoprotectant transport through articular cartilage for long-term storage: experimental and modeling studies [J]. Osteoarthritis and Cartilage, 2008, 16(11): 1379-1386.

8 Hu Jianfei, Wolfinbarger L. Dimethyl solfoxide concentration in fresh and cryopreserved porcine valved conduit tissues [J]. Cryobiology, 1994, 31(5): 461-467.

9 Pegg D E, Wang LH, Vaughan D, et al. Cryopreservation of articular cartilage. Part 2: mechanisms of cryoinjury [J]. Cryobiology, 2006, 52(3): 347-359.

10 Sharma R, Law G K, Rehieh K, et al. A novel method to measure cryoprotectant permeation into intact articular cartilage [J]. Cryobiology, 2007, 54(2): 196-203.

11 Jomha N M, Law G K, Abazari A, et al. Permeation of several cryoprotectant agents into porcine articular cartilage [J]. Cryobiology, 2009, 58(1): 110-114.

12 虞效益, 張紹志, 徐夢潔, 等. 二甲亞砜對關節(jié)軟骨滲透性研究[J]. 工程熱物理學報, 2010, 31(8): 1363-1366.

Yu Xiaoyi, Zhang Shaozhi, Xu Mengjie, et al. Study on the permeation of dimethyl sulfoxide into articular cartilage [J]. Journal of Engineering Thermophysics, 2010, 31(8): 1363-1366.

13 Sweeney T E, Beuchat C A. Limitations of methods of osmometry: measuring the osmolality of biological-fluids. American Journal of Physiology, 1993, 264(3): R469-R480.

14 Zhang Shaozhi, Yu Xiaoyi, Chen Guangming. Permeation of dimethyl sulfoxide into articular cartilage at subzero temperatures [J]. Journal of Zhejiang University-Science B, 2012, 13(3): 213-220.

Quantitation of cryoprotective agent by measurement of refractive index

Yu Xiaoyi1,2Li Wei1Chen Guangming1,2,3Xu Meijuan1

(1Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo 315100, China) (2Key Laboratory of Refrigeration and Cryogenic Technology of Zhejiang Province, Hangzhou 310027, China) (3Institute of Refrigeration and Cryogenics, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

In present study, the refractive index of several ternary solutions of cryobiological interests, namely dimethyl sulfoxide/sodium choloride (NaCl)/water, glycerol/NaCl/water, ethylene glycol/NaCl/water, propylene glycol/NaCl/water and trehalose/NaCl/water, were measured at various temperatures (15, 25 and 35 ℃) and concentrations of CPA (0 to 40 %wt), respectively. The concentration of NaCl in solution is fixed at 0.9 %wt. An equation to fit the experimental measurements was devised to characterize the relation among refractive index, CPA concentration and temperature. The concentration of CPA has a positive linear influence on the refractive index of solution, while the temperature has of a negative linear effect. The refractive index of solution is more susceptible to the change of CPA concentration than the temperature change. The existence of CPA can be quantitatively determined by measurement of the refractive index of solution, which is cost-effective, fast, and applicable to solutions with high concentration of CPA.

refractive index；cryoprotective agent； dimethyl sulfoxide；glycerol；ethylene glycol；propylene glycol； trehalose

2017-07-13；

2016-10-08

國家自然科學基金(5140618),寧波市自然科學基金(2016A610214)；浙江省制冷與低溫技術重點實驗室開放基金(2016007AA)。

虞效益，男，32歲，博士，講師。

徐美娟，女，副教授。

R318.52，TB664

A

1000-6516(2016)05-0011-04