吳方評(píng)， 金　蘋， 姚祖福， 楊　勇， 劉良紅

（湖南醫(yī)藥學(xué)院，侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化418000）

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SPE-HPLC法測(cè)定三尖杉中的三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿

吳方評(píng)， 金蘋， 姚祖福， 楊勇， 劉良紅

（湖南醫(yī)藥學(xué)院，侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化418000）

摘要：目的 采用固相萃取-高效液相色譜（SPE-HPLC）法測(cè)定三尖杉CePhalotaxus fortunei Hook.f.中的三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿。方法 三尖杉90％乙醇提取液的分析采用迪馬Diamonil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈∶水（含0.1 g十二烷基磺酸鈉和0.1％磷酸，42∶58），等度洗脫；體積流量為0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為291 nm。結(jié)果 三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿在2.48～49.60、2.51～50.20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率（n =5）分別為95.4％、95.1％，RSD分別為1.83％、1.91％。兩種成分的含有量在莖中最高，而在葉中最低。結(jié)論該方法可用于測(cè)定該植物中的三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿，效果理想。

關(guān)鍵詞：三尖杉；三尖杉酯堿；高三尖杉酯堿；SPE-HPLC

三尖杉屬隸屬于三尖杉科裸子植物，該科僅三尖杉1屬9種，產(chǎn)于亞洲東部至南亞次大陸，在我國分布最為集中［1］。三尖杉酯堿（HT）和高三尖杉酯堿（HHT）是從三尖杉CePhalotaxus fortunei Hook.f.中分離出的具有抗腫瘤活性的生物堿，其中后者對(duì)人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性［2-5］，過去30年被廣泛用于急性、慢性粒細(xì)胞性白血病的治療，取得了較好的效果［6-8］；前者對(duì)HL-60和人白血病細(xì)胞K562也具有凋亡作用［9-10］。目前，這兩種成分主要從三尖杉屬植物中分得，而海南粗榧內(nèi)生真菌細(xì)極鏈格孢CH1307發(fā)酵后也可得到高三尖杉酯堿［11］。生物樣品中，高三尖杉酯堿的含有量主要通過HPLC法進(jìn)行測(cè)定［12-13］，而三尖杉酯堿與其結(jié)構(gòu)非常相似，但尚無同時(shí)測(cè)定這兩種成分的文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過固相萃取方法對(duì)三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿進(jìn)行富集，然后采用HPLC法同時(shí)測(cè)定其含有量。

1 材料與試劑

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 三尖杉樣品采自湖南省洪江市雪峰山自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)湖南醫(yī)藥學(xué)院中藥現(xiàn)代化研究中心汪冶教授鑒定為三尖杉屬植物。

1.1.2 主要儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，包括四元泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器及漢化版化學(xué)工作站；迪馬Diamonil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；島津AUW120D電子分析天平；LC-350A超聲波中藥處理機(jī)；Waters Sep -Pak -C18固相萃取小柱。

1.2 主要試劑 高三尖杉酯堿對(duì)照品（批號(hào)

111533-200403，中國食品藥品檢定研究院）；三尖杉酯堿對(duì)照品（批號(hào)26833-85-2，南京春秋生物工程有限公司，含有量98％以上）。乙腈為色譜純（天津賽福瑞科技有限公司）；乙醇為分析純（重慶川東化工集團(tuán)有限公司化學(xué)試劑廠）；其他試劑均為分析純；水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取三尖杉酯堿4.96 mg、高三尖杉酯堿5.02 mg，置于10 mL量瓶中，流動(dòng)相溶解并定容至刻度，即得0.496 mg/mL三尖杉酯堿和0.502 mg/mL高三尖杉酯堿對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取三尖杉適量，粉碎，過100目篩，精密稱取0.10 g，置于50 mL量瓶中，加入90％乙醇40 mL，浸潤(rùn)10 min，超聲提取45 min，水浴加熱揮去乙醇至微干，5 mL乙醇溶解，蒸餾水定容至刻度，超聲處理10 min，以5 mL/min的體積流量通過預(yù)處理的Sep-Park-C18固相萃取小柱，5 mL二次蒸餾水過柱洗滌，5 mL 20％乙醇淋洗，離心，3 mL 90％乙醇洗脫，棄去最初的3滴，流動(dòng)相定容至10 mL，即得。

2.1.3 色譜條件 迪馬Diamonil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈∶水（含0.1 g十二烷基磺酸鈉和0.1％磷酸，42∶58）；檢測(cè)波長(zhǎng)291 nm；體積流量0.5 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。進(jìn)樣前，對(duì)照品和樣品溶液用0.45 μm針頭過濾器過濾。

2.2 結(jié)果

2.2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下，三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿對(duì)照品溶液及三尖杉供試品溶液分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1。由圖可知，兩種成分的保留時(shí)間分別為13.255 min和15.185 min，理論塔板數(shù)大于6 000，分離度大于1.5，基線基本分離，峰形對(duì)稱，表明該條件可用于分析測(cè)定。

2.2.2 線性關(guān)系的考察 分別精密量取三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿對(duì)照品貯備液適量，置于5個(gè)10 mL量瓶中，流動(dòng)相定容至刻度，分別配制成2.48、4.96、9.92、24.8、49.60 μg/mL三尖杉酯堿和2.51、5.02、10.04、25.10、50.20 μg/mL高三尖杉酯堿校正液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為三尖杉酯堿Y=8.103 3X-5.850 2（r= 0.999 4）、高三尖杉酯堿Y=4.735 5X+1.312 1，（r=0.999 8），表明兩種成分分別在2.48～49.60、2.51～50.20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.三尖杉酯堿 2.高三尖杉酯堿1.harringtonine 2.homoharringtonine圖1　HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s

2.2.3 檢測(cè)限和定量限的考察 將三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿對(duì)照品溶液逐步稀釋后進(jìn)樣測(cè)定，以色譜圖中信噪比（S/N）為3時(shí)的進(jìn)樣量為最低檢測(cè)限（LOD），為10時(shí)的進(jìn)樣量為最低定量限（LOQ）。結(jié)果，兩種成分的檢測(cè)限分別為0.001 2、0.001 2 μg，定量限分別為0.012 0、0.012 0 μg。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下分別于0、1、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)得兩種成分峰面積RSD分別為3.01％和2.55％，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿對(duì)照品溶液，進(jìn)樣5次，測(cè)得兩種成分峰面積RSD分別為2.87％和2.65％，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批次三尖杉樣品0.1 g，共5份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下分析，測(cè)得兩種成分平均含有量分別為0.849 5 mg/g和1.889 7 mg/g，RSD（n =5）分別為2.95％和2.43％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取同批次含有量已知（三尖杉酯堿0.849 5 mg/g、高三尖杉酯堿1.889 7 mg/g）的三尖杉0.1 g，共6份，置于6只50 mL量瓶中，分為3組，每組分別加入三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿貯備液0.5、0.25、0.125 mL，每個(gè)質(zhì)量濃度制備5份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下分析，結(jié)果見表1和表2。

表1　三尖杉酯堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Tab.1 Results of recovory tests for harringtonine（n=5）

表2　高三尖杉酯堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Tab.2 Results of recovory tests for homoharringtonine （n=5）

2.2.8 含有量測(cè)定 精密稱取不同部位（根、莖和葉）的三尖杉樣品，每個(gè)部位5份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理、在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下分析，外標(biāo)法進(jìn)行含有量測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3　含有量測(cè)定結(jié)果（n=5）Tab.3 Determ ination results of contents（n=5）

3 討論

3.1 流動(dòng)相及體積流量的選擇 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相為乙腈∶水（含0.1 g十二烷基磺酸鈉和0.1％磷酸，42∶58）、體積流量為0.5 mL/min時(shí)峰形對(duì)稱，出峰時(shí)間適宜，三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿分離度較大，雜質(zhì)峰對(duì)被檢測(cè)峰干擾小。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 紫外掃描發(fā)現(xiàn)，三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿在291 nm處均有最大吸收。因此，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為291 nm。

3.3 提取方法和提取溶劑的優(yōu)選 本實(shí)驗(yàn)考察了無水乙醇、90％乙醇、50％乙醇、100％甲醇和50％甲醇，發(fā)現(xiàn)以90％乙醇為提取溶劑，超聲提取45 min后，待測(cè)物能提取完全。

3.4 固相萃取條件的優(yōu)選

3.4.1 吸附材料 由于三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的極性較小，故吸附富集材料選用C18反相鍵合硅膠（30 mg），使用前甲醇活化。該材料在水相中對(duì)兩種成分的保留較好，而在有機(jī)相（如乙醇）中保留較差，故本實(shí)驗(yàn)用90％乙醇超聲提取后濃縮至微干，少量乙醇溶解后再用水定容，以保證其能在吸附材料上充分保留。

3.4.2 淋洗溶劑 考察了10％、20％、30％、50％、70％和90％乙醇對(duì)富集物的淋洗效果，發(fā)現(xiàn)10％和20％乙醇不能洗脫三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿，而70％和90％乙醇可以。因此，先用5 mL二次蒸餾水淋洗萃取小柱，再用5 mL 10％乙醇淋洗以除去雜質(zhì)，離心，3 mL 90％乙醇可把兩種成分完全洗脫，再用流動(dòng)相定容。

3.4.3 過柱及洗脫體積流量 體積流量在5 mL/min時(shí)，既能保證三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的富集，又顯示了較高的效率。另外，3 mL 90％乙醇在3 mL/min條件下即能把兩種成分完全洗脫。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇5 mL/min作為樣品富集過柱體積流量，3 mL/min作為樣品洗脫體積流量。

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Determ ination of harringtonine and homoharringtonine in CePhalotaχus fortunei by SPE-HPLC

WU Fang-ping， JIN Ping， YAO Zu-fu， YANG Yong， LIU Liang-hong
（Hunan University of Medicine，Hunan p rovincial Key Laboratory of Dong pharmaceutical Research，Huaihua 418000，China）

ABSTRACT：AIM To determine harringtonine and homoharringtonine in CePhalotaxus fortunei Hook.F.by solid phase extraction-high performance liquid chromatography（SPE-HPLC）.METHODS The analysis of 90％ ethanol extract of C.fortunei was performed on Diamonil C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm），mobile phase was acetonitrile-water（containing 0.1 g sodium dodecylsulphate and 0.1％phosphate，42∶58）with isocratic elution，flow ratewas0.5 mL/min and detection wavelength was setat291 nm.RESULTS Harringtonine and homoharringtonine showed good linear relationships within the ranges of 2.48 -49.60 μg/mL and 2.51 -50.20 μg/mL，whose average recoveries（n =5）were 95.4％and 95.1％with the RSDs of1.83％and 1.91％，book=1071,ebook=117respectively.The contents of these two constituents were the highest in stems and the lowest in leaves.CONCLUSION Thismethod can be used for the determination of harringtonine and homoharringtonine in this plantwith great effect.

KEY WORDS：CePhalotaxus fortunei Hook.F.；harringtonine；homoharringtonine；SPE-HPLC

作者簡(jiǎn)介：吳方評(píng)（1972—），男（侗族），碩士，副教授，從事藥物制劑質(zhì)量控制研究。Tel：15576513046，E-mail：wfp1013 @ 163.com

基金項(xiàng)目：湖南省懷化市科技局科研項(xiàng)目（2014-19）

收稿日期：2015-07-28

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.022

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1070-04