高圣風(fēng)　劉愛勤　桑利偉　孫世偉　茍亞峰

摘 要 通過平板對峙法從香草蘭根際微生物中篩選出對香草蘭根（莖）腐病菌（Fusarium oxysporum）、香草蘭疫病菌（Phytophthora nicotianae）和香草蘭細(xì)菌性軟腐病菌（Erwinia carotovora）均有良好抑制效果的生防菌10株。通過16S rDNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，其中7株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus. amyloliquefaciens），2株為枯草芽孢桿菌（B. subtils），1株為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）。提取脂肽類化合物進行抑菌分析，發(fā)現(xiàn)10株生防菌脂肽類提取物對香草蘭根（莖）腐病菌和香草蘭疫病菌均有良好的抑制效果，有4株的脂肽類粗提物對香草蘭細(xì)菌性軟腐病菌有強烈的抑制活性。對其中2個菌株脂肽類粗提物進行MALDI-TOF/TOF-MS檢測，發(fā)現(xiàn)菌株 VX2R11 產(chǎn)生表面活性素（Surfactin）和伊枯草素A（IturinA）2種脂肽類化合物，菌株 VX2S02 僅產(chǎn)生伊枯草素A，推測產(chǎn)生伊枯草素A是菌株VX2R11和VX2S02拮抗香草蘭根（莖）腐病菌和疫病菌重要機制；產(chǎn)生表面活性素是菌株VX2R11拮抗香草蘭細(xì)菌性軟腐病菌的重要機制。

關(guān)鍵詞 香草蘭 ；芽孢桿菌 ；16S rDNA 鑒定 ；脂肽類化合物

分類號 S435.73 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.01.009

Abstract Ten bio-control Bacillus strains were selected via dual culture method from the isolates obtained from vanilla rhizosphere of Wanning city and Qionghai city in Hainan province. The selected isolates were highly antagonistic against vanilla pathogens：Fusarium oxysporum，Phytophthora nicotianae and Erwinia carotovora. Seven B. amyloliquefaciens strains， two B. subtils strains and one B. methylotrophicus strain were identified by the assays of 16S rDNA sequence and the phylogenefic tree. Lipopeptide compound analysis via dual culture method showed that all 10 lipopeptide extractions from each bio-control strain exhibited highly antagonistic against F. oxysporum and P. nicotianae， while 4 lipopeptide extractions were highly antagonistic against E. carotovora. Lipopeptide compound analysis via MALDI-TOF/TOF -MS showed that strain VX2R11 produced Surfactin and IturinA，while strain VX2S02 produced Iturin A， suggesting that strainVX2R11and VX2S02 might via the production of IturinA to antagonize pathogens F. oxysporum and P. nicotianae， while strainVX2R11 might via the production of Surfactin to antagonize pathogen E. carotovora.

Keywords Vanilla fragrans ； Bacillus spp ； 16S rDNA sequence ； lipopeptide

香草蘭[Vanilla fragrans（salisb.）Ames（V.planifolia）]是一種經(jīng)濟附加值極高的熱帶經(jīng)濟作物，素有“食品香料之王”的稱譽。香草蘭根（莖）腐病是一種危害極大的土傳病害，其病原物是尖孢鐮刀菌（Fusarium. oxysporum）[1]。鐮刀菌土傳病害是世界性防治難題，其化學(xué)防治成本高、風(fēng)險大；而且香草蘭栽培品種極其單一，沒有抗性品種，目前對該病害嚴(yán)重缺乏簡單有效的防治手段。近年來，香草蘭根（莖）腐病已在我國香草蘭種植區(qū)爆發(fā)流行，造成很多香草蘭種植園荒廢，嚴(yán)重阻礙了香草蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。同時，香草蘭疫病和香草蘭細(xì)菌性軟腐病也是香草蘭上重要病害，其病原物分別為煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）和胡蘿卜歐文氏桿菌（Erwinia carotovora），每種病害每年給香草蘭產(chǎn)業(yè)造成約15%～30%的損失，也是香草蘭生產(chǎn)上的重要問題。

生物防治技術(shù)日益興起，其防治譜廣和對環(huán)境友好的特點使其成為當(dāng)前的研究熱點之一。目前，國內(nèi)外已經(jīng)開始利用生防菌防治香草蘭病害的探索。Ramalingam等[3]發(fā)現(xiàn)熒光假單胞（Fluorescent pseudomonads）等生防菌株在溫室和田間均能夠顯著降低香草蘭根（莖）腐病的嚴(yán)重度。Radjacommarea等[4]發(fā)現(xiàn)17株木霉（Trichodema）對包括香草蘭根（莖）腐病菌有抑制活性，其中2株木霉菌與熒光假單胞菌和殼多糖相結(jié)合獲得了良好的大田防病效果。曾會才等[5]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）OBS-2菌株在盆栽和大田試驗上對香草蘭根（莖）腐病和香草蘭疫病具有良好的防治效果。李霞等[6]在對搜集到的9株木霉、枯草芽孢桿菌和熒光假單孢菌進行了平板抑制活性分析。

迄今為止，國內(nèi)外對香草蘭生防菌篩選和應(yīng)用的報道極少，對香草蘭疫病和香草蘭細(xì)菌性軟腐病的報道幾乎空白。已報道的生防菌株也多為分離自其他作物的外源菌株，鮮有來自香草蘭生境的天然生防菌。這些香草蘭生防菌的生防機制也尚未見報道。本研究以香草蘭上主要病害香草蘭根（莖）腐病、香草蘭疫病和香草蘭軟腐病菌為靶標(biāo)，對香草蘭根際生防細(xì)菌開展了篩選、鑒定及作用機理分析等工作，為進一步研究香草蘭重要病害的綠色高效防控提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

本研究中平板對峙培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA），細(xì)菌培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基；生防菌發(fā)酵所用培養(yǎng)基為Landy培養(yǎng)基[7]。

1.1.2 菌株

本研究所用3種病原菌香草蘭根（莖）腐病菌、香草蘭疫病菌和香草蘭細(xì)菌性軟腐病菌均來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所。

1.1.3 試劑和引物合成

本研究基因組的提取和PCR擴增均使用天根生化科技（北京）有限公司“快速DNA提取擴增套裝”試劑盒完成；PCR片段純化均采用天根生化科技（北京）有限公司“瓊脂糖凝膠回收試劑盒”完成；PCR引物的合成均在深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成；其他試劑如氯化鈉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、氯化鉀、L-苯丙氨酸、硫酸錳、五水硫酸銅、七水硫酸亞鐵等均為分析純。PCR所用引物為細(xì)菌16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGYTACCTTGTTACGACTT- 3′）[7]。

1.2 方法

1.2.1 生防菌篩選

采用平板對峙培養(yǎng)法進行生防菌篩選。將香草蘭根（莖）腐病和香草蘭疫病的病原菌在PDA平板上活化后打成直徑0.5 cm的圓形菌絲塊，然后將菌絲塊接種在新平板中央并在四周接種活化后的香草蘭根際細(xì)菌。將濃度為109 cfu/mL的香草蘭細(xì)菌性軟腐病菌以2%比例加入到冷卻至約50℃的PDA培養(yǎng)基中，搖勻后倒平板；然后將濃度為109 cfu/mL的香草蘭根際細(xì)菌液5 μL接種在含菌平板上。所有平板均放置在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5～7 d后測量抑菌圈直徑。

1.2.2 生防菌16S rDNA序列分析鑒定

生防菌提取基因組DNA后，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物進行16S序列擴增[7]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后通過紫外凝膠成像儀檢測并切膠回收，回收產(chǎn)物送到深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站的基本局部比對搜索工具（The Basic Local Alignment Search Tool， BLAST）進行序列比對分析。

將本研究獲得的生防菌16S rDNA序列上傳到GenBank，下載近源菌株的16S rDNA序列用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。用Clustal X 2.1和MEGA6.06軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建[7]。

1.2.3 脂肽類化合物分析

將待測菌株接種在LB培養(yǎng)基中200 r/min 37℃條件下培養(yǎng)12 h；然后以3%比例轉(zhuǎn)接入50 mL landy培養(yǎng)基，在200 r/min 30℃條件下發(fā)酵40 h；用酸沉淀法[8]提取脂肽類化合物，粗提物濃縮至3 mL后經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過濾后備用。采用平板對峙培養(yǎng)法檢測各菌株脂肽類粗提物的抑菌活性，方法見本研究“1.2.1生防菌篩選”，僅將“接種生防菌”更換為“滴加10 μL脂肽類粗提物”。通過AB SCIEX 5800 MALDI-TOF/TOF-MS儀器進行飛行時間質(zhì)譜檢測，根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果初步判斷物質(zhì)種類[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌篩選

通過平板對峙培養(yǎng)法從香草蘭根際細(xì)菌中篩選到對香草蘭根（莖）腐病菌、香草蘭疫病菌和香草蘭細(xì)菌性軟腐病菌3種病原菌均有良好抑菌效果的菌株10株；對香草蘭根（莖）腐病菌和香草蘭疫病菌的抑菌圈平均直徑均>15 mm，對香草蘭細(xì)菌性軟腐病菌的抑菌圈平均直徑均>10 mm（圖1、表1）。

2.2 香草蘭根際生防菌鑒定

以生防菌DNA 為模板擴增 16S rDNA 片段，獲得大小約 1.5 kb的 PCR片段，將測序結(jié)果在 NCBI 網(wǎng)站通過BLAST 軟件與 GenBank 中己知序列進行比對分析。結(jié)果表明：GenBank 中與10株生防菌16S序列同源性最高的菌株均為芽孢桿菌屬菌株；其中菌株VD18S15與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 HB26的 16S rDNA 的序列同源性為 99%，菌株VD18R19和VX1R02與枯草芽孢桿菌 168的16S rDNA 的序列同源性均為100%，菌株VD18S27與解淀粉芽孢桿菌D15的 16S rDNA 的序列同源性為100%，菌株VD21R27和VX1S06與解淀粉芽孢桿菌 D12的 16S rDNA 的序列同源性均為100%，菌株VX2R11和VX2S02與解淀粉芽孢桿菌的 16S rDNA 序列同源性均為100%，菌株VX4S09和VX4S18與解淀粉芽孢桿菌 SQR-7的 16S rDNA 序列同源性均為100%。

以1株熒光假單胞菌株WCS365（登陸號：KP253039）為外群，以枯草芽孢桿菌168（登陸號：KP318826）、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌HB26（登陸號：KM659227）和解淀粉芽孢桿菌SQR-7（登陸號：KC888017）為參照，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：10株生防菌被聚類為3個分支；其中菌株VX4S09、VX2S02、VX4S18、VD18S27、VD21R27、VX2R11、VX1S06與解淀粉芽孢桿菌SQR-7聚類在同一分支，菌株VD18S15與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 HB26被聚類在相同分枝，菌株VD18R19和VX1R02與枯草芽孢桿菌168被聚類在同一分支。

2.3 脂肽類化合物分析

10株生防菌發(fā)酵后均能成功得到脂肽類粗提物。所有的脂肽類粗提物對病原真菌F. oxysporum VFO62和病原細(xì)菌P. nicotianae VPN01的抑菌圈平均直徑均>15 mm，大部分粗提物的抑菌圈平均直徑達20 mm以上（表1、圖3）。說明脂肽類化合物在這10株生防芽孢桿菌的抑制真菌機制和抑制卵菌機制中均起重要作用。但是對病原細(xì)菌 E. carotovora VEC03的抑菌效果呈現(xiàn)兩極分化，出現(xiàn)強烈抑菌和完全不抑菌兩組（表1、圖3）：VD18R19、VD18S15、VX1S06、VX2R11等4個菌株的抑菌圈平均直徑均 >20 mm；其他6個菌株檢測不到抑菌效果。該結(jié)果表明，脂肽類化合物在菌株VD18R19、VD18S15、VX1S06和VX2R11的抑制細(xì)菌機制中起重要作用；同時推測，其他6株生防菌可能產(chǎn)生其他種類的抑細(xì)菌物質(zhì)。

從生防菌脂肽類粗提物中選取對真菌、卵菌和細(xì)菌均有良好抑制效果的VX2R11以及僅對真菌和卵菌抑制效果良好的VX2S02進行MALDI-TOF/TOF-MS檢測。檢測圖譜顯示（圖4），菌株VX2R11在m/z值為1 030.631 0，1 044.621 9，1 058.660 9處有離子峰的出現(xiàn)，這3個離子峰對應(yīng)于表面活性素的分子質(zhì)量[9]； 在m/z值為1 065.534 1，1 079.546 6，

1 093.562 1，1 109.535 8處有離子峰的出現(xiàn)，這4個離子峰對應(yīng)于伊枯草素A的分子質(zhì)量[10]。菌株VX2S02在m/z值為1 065.504 0，1 079.515 4，

1 093.533 1，1 109.505 4處有離子峰的出現(xiàn)，這4個離子峰對應(yīng)于伊枯草素A的分子質(zhì)量[10]。MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜分析結(jié)果表明，菌株 VX2R11 產(chǎn)生脂肽類化合物表面活性素和伊枯草素A，菌株 VX2S02 僅產(chǎn)伊枯草素A。

3 討論與結(jié)論

香草蘭通常種植于溫暖、潮濕、蔭蔽的環(huán)境中，該環(huán)境適于病原菌孳生，極易產(chǎn)生病害。本研究從香草蘭根際篩選生防菌，希望利用香草蘭生境中天然的生防菌來抑制病原菌數(shù)量達到防病的目的。本研究以香草蘭上3種重要的病害為靶標(biāo)進行抑菌篩選，得到了廣譜生防菌10株。經(jīng)過16S rDNA序列鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)10株生防菌均為芽孢桿菌屬菌株，包含解淀粉芽孢桿菌7株、枯草芽孢桿菌2株和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌1株。芽孢桿菌類生防菌廣泛分布于各種自然環(huán)境中，容易進行人工培養(yǎng)，可以產(chǎn)生芽孢抵抗紫外線、干旱、高溫、低溫等逆境，耐貯藏和運輸，使芽孢桿菌類生防菌在開發(fā)和應(yīng)用上更具優(yōu)勢。

當(dāng)前國內(nèi)外對香草蘭生防菌的研究多在應(yīng)用層面，對其生防機制知之甚少。脂肽類化合物是芽孢桿菌產(chǎn)生的最主要的抑菌物質(zhì)[11-14]，其分子量一般在900～2 000[15]。本研究通過生防菌脂肽類化合物分析來探討其生防機制。采用酸沉淀法提取生防菌脂肽類化合物進行抑菌分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10株生防菌脂肽類粗提物對病原真菌和卵菌有良好的抑菌效果，4個菌株的脂肽類粗提物對病原細(xì)菌抑制效果良好。該結(jié)果說明，脂肽類化合物在生防菌抑制香草蘭病原真菌、卵菌和細(xì)菌過程中起重要作用。

為了進一步分析香草蘭生防菌的生防機制，本研究選出2個菌株，脂肽類粗提物對3種病原菌均有良好抑制活性的VX2R11菌株以及僅抑制2種病原菌的VX2S02菌株進行MALDI-TOF/TOF-MS檢測，發(fā)現(xiàn)菌株 VX2R11產(chǎn)生表面活性素和伊枯草素A兩種脂肽類化合物，菌株 VX2S02 僅產(chǎn)生伊枯草素A。前人研究表明，芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類化合物中，表面活性素對細(xì)菌和病毒有良好的抑制活性[12，16]，伊枯草素A對真菌和卵菌具有強烈的抑制活性[14-15]，與本研究結(jié)果相符。由此推斷，菌株VX2R11及VX2S02對香草蘭根（莖）腐病菌和香草蘭疫病菌的拮抗效果可能通過產(chǎn)生伊枯草素A實現(xiàn)；菌株VX2R11對香草蘭細(xì)菌性軟腐病菌的拮抗效果可能通過產(chǎn)生表面活性素實現(xiàn)；菌株VX2S02對病原細(xì)菌的拮抗效果可能來自于菌株產(chǎn)生的非脂肽類物質(zhì)，其物質(zhì)種類還有待于進一步研究。

本研究從拮抗物質(zhì)的角度初步探討了香草蘭根際生防菌的生防機制。此外，還可能存在競爭、誘導(dǎo)寄主植物抗性等生防機制，需要更多的深入研究。雖然生防菌的應(yīng)用目前尚不成熟，但是生防芽孢桿菌自身的天然、環(huán)境友好、易培養(yǎng)、耐貯藏、廣譜等特性賦予其廣闊的應(yīng)用前景。

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