孫洪雁 陶吉寒 辛力 孫清榮

摘要：為了提高金花梨和鴨梨2個品種葉片不定芽再生能力，以其試管苗葉片為外植體，以NN69為基本培養(yǎng)基，研究了不同濃度TDZ和BA對2個品種梨葉片不定芽再生的影響。結(jié)果表明：BA對鴨梨葉片不定芽的再生比TDZ有效，TDZ未能誘導(dǎo)鴨梨葉片產(chǎn)生不定芽；BA對金花梨葉片不定芽再生率的影響與TDZ無顯著差異，但TDZ比BA顯著提高了金花梨葉片的平均每葉不定芽數(shù)。

關(guān)鍵詞：梨；葉片；植物生長調(diào)節(jié)劑；不定芽再生；TDZ；BA

中圖分類號：S661.204⁺.3

文獻標識號：A

文章編號：1001-4942（2016）01-0026-04

梨是我國第三大果樹，其種植面積和產(chǎn)量僅次于蘋果和柑桔。梨果也是世界范圍內(nèi)深受消費者喜愛的水果之一。但梨樹生長過程中經(jīng)常受到一些病害的威脅。傳統(tǒng)的雜交育種雖然可以進行有利性狀包括抗病性狀的轉(zhuǎn)移，但由于梨樹具有高度雜合的遺傳背景和較長的童期，采用雜交育種方法進行抗性選擇不僅難度較大，而且需時長。果樹的自然芽變，雖然可以出現(xiàn)果實大小、果皮顏色、株型等的變異，但很難出現(xiàn)抗性突變變異。基因工程的外源基因遺傳轉(zhuǎn)化操作為植物的抗病性改良提供了新的育種方法，并在多種植物上獲得了成功，但遺傳轉(zhuǎn)化操作成功應(yīng)用于果樹的前提是離體葉片高效不定芽再生體系的建立。離體葉片不定芽再生體系的建立還可用于體細胞誘變研究及無性變異選擇研究。關(guān)于梨樹葉片不定芽再生的研究已在很多品種上獲得了成功，但不同基因型不定芽再生的難易及再生頻率不同。而一個品種離體葉片不定芽再生的高效性應(yīng)該是既有高的再生頻率又有高的單位葉片不定梢數(shù)，這是應(yīng)用遺傳轉(zhuǎn)化操作技術(shù)改良品種的理想的前提條件。本試驗通過研究不同濃度TDZ和BA對金花梨和鴨梨葉片不定芽再生的影響，旨在提高2個品種梨離體葉片的不定芽再生力，為利用體細胞誘變方法及外源基因轉(zhuǎn)化操作改良品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為本實驗室繼代保存的金花梨和鴨梨的試管苗。

1.2試驗方法

試管苗繼代增殖培養(yǎng)3～4周時，取綠梢頂部2～3片剛展開的幼嫩葉片，用無菌手術(shù)刀片垂直于葉片中脈橫切，葉緣不切斷以保證葉片完整，把帶有切口的葉片接種于裝有不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)。每個處理接種3瓶，每瓶接種10片，重復(fù)3次。葉片接種后先置于黑暗條件下暗培養(yǎng)3周，然后轉(zhuǎn)移至光培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)至6周時，觀察和統(tǒng)計產(chǎn)生不定芽的葉片數(shù)，記錄每個葉片產(chǎn)生的不定芽數(shù)，計算不定芽再生率和平均每葉不定芽數(shù)。不定芽再生率（%）=產(chǎn)生不定芽的葉片數(shù)/接種總?cè)~片數(shù)×100；平均每葉不定芽數(shù)=不定芽總數(shù)/產(chǎn)生不定芽的葉片數(shù)。再生力=不定芽再生率（%）×平均每葉不定芽數(shù)×100。

不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以NN69為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的BA（3、5mg/L）或TDZ（1、2mg/L），共設(shè)4個處理，每個處理均添加0.3mg/LIBA、30g/L蔗糖、6g/L瓊脂，滅菌前pH值調(diào)節(jié)為5.8。

培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)的光周期為16h光/8h暗，光強為40μmol·m-2^-2·S^-1，培養(yǎng)溫度為（25±+2）℃。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用DPS 7.5軟件進行統(tǒng)計分析，不同處理平均值用LSD法進行差異比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TDZ和BA對金花梨葉片不定芽再生的影響

由表l可知，添加不同濃度TDZ和BA的培養(yǎng)基均能成功誘導(dǎo)金花梨葉片產(chǎn)生不定芽（圖1A、B），各處理對不定芽再生率的影響無顯著差異，均可達80%以上。其中，1mg/L TDZ處理顯著提高了金花梨的平均每葉不定芽數(shù)，與其他處理間差異顯著，且再生力最高，為539.88。由此可見，TDZ對誘導(dǎo)金花梨葉片不定芽再生比BA更有效。

2.2 TDZ和BA對鴨梨葉片不定芽再生的影響

由表1可知，添加不同濃度BA的培養(yǎng)基均可成功誘導(dǎo)鴨梨葉片產(chǎn)生不定芽（圖1C），其中，3mg/L BA處理的不定芽再生率顯著高于5mg/LBA的處理，且再生力明顯較高；5mg/L BA處理的平均每葉不定芽數(shù)略高于3mg/L BA處理，但差異不顯著。添加TDZ的培養(yǎng)基未能誘導(dǎo)鴨梨葉片產(chǎn)生不定芽，只能誘導(dǎo)葉片傷口處產(chǎn)生愈傷（圖ID）。表明BA對誘導(dǎo)鴨梨葉片不定芽再生比TDZ有效，且較低濃度的BA更有利于誘導(dǎo)鴨梨葉片不定芽再生。

2.3 TDZ和BA對不定芽伸長生長的影響

BA誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽，在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上可直接伸長生長形成不定芽綠苗（圖1B、C），2個品種結(jié)果表現(xiàn)一致；TDZ誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽，在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上不能直接伸長生長形成不定芽（圖1A），轉(zhuǎn)移至添加1mg/L BA的MS培養(yǎng)基上可獲得正常伸長生長的不定芽綠苗。

2.4 不定芽的增殖和生根培養(yǎng)

獲得的不定芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基MS+1mg/LBA+0.2mg/LIBA上進行繼代增殖培養(yǎng)，2個品種均獲得了良好的增殖生長和伸長生長。

繼代伸長生長的綠苗在生根培養(yǎng)基1/4MS（MS大量元素的1/4）+0.5mg/L IBA上，2個品種均獲得了85%以上的生根率。

3 結(jié)論與討論

TDZ和BA對不同基因型梨葉片不定芽再生的影響不同。Caboni等研究表明BA對野生梨葉片不定芽再生的影響比TDZ更有效。Liu等研究表明TDZ對‘中梨1號葉片不定芽再生的誘導(dǎo)比BA更有效。本研究結(jié)果表明，TDZ對金花梨葉片不定芽再生的誘導(dǎo)比BA更有效，且明顯提高了不定芽再生力；而BA對鴨梨葉片不定芽再生的影響比TDZ更有效，且BA誘導(dǎo)葉片不定芽再生率可達55%，而TDZ未能誘導(dǎo)鴨梨葉片產(chǎn)生不定芽。

在木本植物的組織培養(yǎng)中，TDZ是一種活性很強的類細胞分裂素物質(zhì)，雖能有效誘導(dǎo)不定芽再生，但又常存在著抑制不定芽伸長生長的作用。本研究中，對金花梨葉片不定芽再生的試驗也表現(xiàn)為TDZ抑制不定芽的伸長，這與前人研究結(jié)果一致。鴨梨在BA培養(yǎng)基上可直接獲得伸長的不定芽，但鴨梨的不定芽再生力較低，提高鴨梨葉片不定芽再生率的研究正在進一步試驗中。