宮文萍 李光蓉 韓冉 宋健民 李豪圣 劉愛峰 曹新有 楊足君 劉成 趙振東 劉建軍

摘要：以多聚核苷酸Oligo-pTa535-l和Oligo-pSc119.2-l為探針對濟(jì)麥系列小麥進(jìn)行雙色熒光原位雜交（FISH）分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Oligo-pTa535-l的FISH信號主要分布在A和D染色體上，而Oligo-pSc119.2-l的FISH信號主要分布在B染色體上；濟(jì)麥系列小麥的FISH位點(diǎn)較小麥中國春差異位點(diǎn)主要集中在染色體4A、6B、7B和ID染色體上，且多為Oligo-pSc119.2-l信號；濟(jì)南17的IB染色體著絲粒區(qū)Oligo-pTa535-l信號、濟(jì)麥20的ID短臂末端和2A長臂末端的Oligo-pSc119.2-l信號、濟(jì)麥262的5A長臂中間的Oligo-pSc119.2-l信號可分別作為細(xì)胞學(xué)標(biāo)簽用于其身份識別。濟(jì)麥系列小麥標(biāo)準(zhǔn)FISH核型的建立為利用染色體工程對其進(jìn)行改良奠定了良好的細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)；FISH信號變異位點(diǎn)的類似性，說明濟(jì)麥系列小麥的遺傳基礎(chǔ)相對狹窄，應(yīng)在今后育種工作中注意選擇與其親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)的育種親本進(jìn)行組配。

關(guān)鍵詞：濟(jì)麥系列小麥；多聚核苷酸；熒光原位雜交；染色體結(jié)構(gòu)變異

中圖分類號：S512.1+10.351

文獻(xiàn)標(biāo)識號：A

文章編號：1001-4942（2016）01-0016-05

小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一。全世界有三分之一的人口以面食為主食，我國山東、河南、山西和陜西等多個省份也主要以面食為主食，因此，高產(chǎn)或超高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥品種的培育對滿足人們飲食結(jié)構(gòu)需求及應(yīng)對糧食安全至關(guān)重要。本課題組先后育成的包括濟(jì)南17、濟(jì)麥19、濟(jì)麥20、濟(jì)麥21和濟(jì)麥22在內(nèi)的大面積推廣濟(jì)麥系列小麥，是山東及全國小麥品種更新?lián)Q代的主導(dǎo)品種，為山東省糧食十連增、全國糧食九連增做出了重大貢獻(xiàn)。近年來又育成了濟(jì)麥23和濟(jì)麥0850262（以下簡稱濟(jì)麥262）等一批山東小麥的重要儲備品系。然而，濟(jì)麥系列小麥的抗病性仍有待改良，是育成超高產(chǎn)小麥的制約因素之一。

小麥遠(yuǎn)緣物種是小麥育種的優(yōu)異基因源，可以用于濟(jì)麥系列小麥的遺傳改良。近期，本課題組從小麥一遠(yuǎn)緣物種染色體系（附加系、代換系和易位系等）中篩選出了一批抗病性好且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的種質(zhì)資源，可以直接或經(jīng)染色體工程改造后應(yīng)用于濟(jì)麥系列小麥的改良工作。

熒光原位雜交（FISH）不僅可用于小麥染色體的識別，還可應(yīng)用于小麥背景中遠(yuǎn)緣物種染色體的鑒定，因而，可用于追蹤導(dǎo)人小麥的遠(yuǎn)緣物種染色體（質(zhì)）。唐宗祥等開發(fā)的以多聚核苷酸（Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1）為探針的雙色FISH可以有效區(qū)分小麥及其遠(yuǎn)緣物種染色體。然而，不同麥區(qū)小麥品種（系）的FISH信號可能存在多樣性，對導(dǎo)人小麥背景中的遠(yuǎn)緣物種染色體鑒定造成影響，因此，研究清楚相關(guān)小麥染色體的FISH模式對其遺傳改良至關(guān)重要。本研究對濟(jì)麥系列小麥進(jìn)行了雙色FISH分析，獲得了濟(jì)麥系列小麥的標(biāo)準(zhǔn)FISH核型，為利用小麥遠(yuǎn)緣物種改良濟(jì)麥系列小麥奠定了良好的細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)；此外，還發(fā)現(xiàn)了部分濟(jì)麥系列小麥的特異FISH位點(diǎn)，可作為細(xì)胞學(xué)標(biāo)簽用于其身份識別。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為優(yōu)質(zhì)小麥濟(jì)南17、面條小麥濟(jì)麥19、面條面包兼用小麥濟(jì)麥20、高產(chǎn)廣適小麥濟(jì)麥21、超高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)小麥濟(jì)麥22以及優(yōu)良品系濟(jì)麥23和濟(jì)麥262。前5個小麥品種及后2個小麥品系均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所小麥?zhǔn)矣伞?/p>

試驗(yàn)所用探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1序列同文獻(xiàn)，由成都瑞信生物公司合成。

1.2 染色體制片和原位雜交

將種子置于鋪有濾紙且濕潤的培養(yǎng)皿中，放人220C的恒溫光照培養(yǎng)箱中。待種子萌動后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)到4cC冰箱中放置24h，之后，放人22℃恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待種子根尖長至1～2cm時，剪下根尖，用冰水處理22～24h。倒出冰水，用固定液（無水乙醇：冰醋酸=3：1，體積比）固定根尖7d以上，壓片備用。壓片方法參見文獻(xiàn)，原位雜交參見文獻(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 濟(jì)南17的FISH分析

以O(shè)ligo-pTa535-l和Oligo-pSc119.2-1為探針對濟(jì)南17進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濟(jì)南17的FISH信號與Tang等報(bào)道的中國春的信號類似，略有區(qū)別。濟(jì)南17在1B染色體著絲粒處有明顯的Oligo-pTa535-1信號，中國春在該處沒有該信號；濟(jì)南17的6B隨體末端、7B長臂末端均具有Oligo-pSc119.2-l信號，而中國春在該處沒有雜交信號；中國春2D長臂端部具有Oligo-pTa535-1信號，而濟(jì)南17的2D長臂端部未發(fā)現(xiàn)該信號（圖la）。

2.2 濟(jì)麥19的FISH分析

中國春在4A和6B長臂末端均具有Oligo-pSc119.2-1雜交信號，而濟(jì)麥19這兩處未發(fā)現(xiàn)FISH信號（圖lb）；中國春在6A短臂末端具有Oligo-pTa535-1信號，而濟(jì)麥19在該處沒有信號；濟(jì)麥19的6B隨體末端、7B長臂末端和ID長臂近末端具有Oligo-pSc119.2-1信號，而中國春的這三個位點(diǎn)沒有FISH信號。

2.3 濟(jì)麥20的FISH分析

濟(jì)麥20的2A染色體長臂中間、IB隨體末端、6B短臂末端和1D短臂末端均具有Oligo-pSc119.2-1信號，并且前兩者信號相對較弱，后兩者信號較強(qiáng)（圖lc），而中國春在這四處沒有FISH信號。

2.4 濟(jì)麥21的FISH分析

中國春1A染色體著絲粒區(qū)、短臂近末端和末端均具有Oligo-pTa535-l信號，而濟(jì)麥21的1A染色體在短臂近末端具有Oligo-pTa535-1信號，短臂末端信號丟失且著絲粒區(qū)信號非常微弱（圖ld）。此外，濟(jì)麥21的1B和6B染色體隨體末端具有Oligo-pSc119.2-1信號，而中國春在這兩處沒有FISH信號。在探針用量相同的情況下，濟(jì)麥21的1B隨體末端Oligo-pSc119.2-l信號較中國春和其他6份供試濟(jì)麥材料在該處的雜交信號強(qiáng)，說明探針序列在濟(jì)麥21的IB隨體末端可能發(fā)生過擴(kuò)增。

2.5 濟(jì)麥22和濟(jì)麥23的FISH分析

濟(jì)麥23由濟(jì)麥22和豫麥34雜交并回交2次獲得，含有87.5%的濟(jì)麥22血緣，因而把這兩份材料并在一起分析。相比中國春的FISH信號，兩份材料FISH信號及信號變化位點(diǎn)具有一致性，即4A染色體長臂末端未發(fā)現(xiàn)Oligo-pSc119.2-1信號，而7B長臂末端具有Oligo-pSc119.2-1信號（圖le、g）。此外，對濟(jì)麥23的不同單株進(jìn)行FISH分析時發(fā)現(xiàn)，存在染色體斷裂和重接現(xiàn)象，主要涉及染色體SB和6B（圖th、i），可能與所選樣品為育種早代材料有關(guān)。

2.6 濟(jì)麥262的FISH分析

中國春的SA長臂中間位置具有Oligo-pTa535-1信號，而濟(jì)麥262在該處的Oligo-pTa535-1信號非常微弱或丟失，但在該處具有較強(qiáng)的Oligo-pSc119.2-1 FISH信號（圖lf），說明Oligo-pTa535-1序列在該處發(fā)生刪除的同時還發(fā)生了Oligo-pSc119.2-l序列擴(kuò)增。此外，濟(jì)麥262的6B染色體隨體末端和1D長臂末端都具有Oligo-pSc119.2-1信號，而中國春在此處沒有該信號。中國春在6B長臂末端具有Oligo-pSc119.2-1信號，而濟(jì)麥262的6B長臂末端沒有該信號。

2.7 濟(jì)麥系列小麥FISH變異位點(diǎn)綜合分析

以O(shè)ligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1為探針對7份濟(jì)麥系列小麥材料進(jìn)行FISH分析，獲得其標(biāo)準(zhǔn)FISH核型（圖1），發(fā)現(xiàn)Oligo-pTa535-1探針主要雜交小麥A和D染色體，Ol-igo-pSc119.2-1探針主要雜交B染色體，與Tang等結(jié)果具有一致性，但在少數(shù)染色體上的信號又有所差異，差異位點(diǎn)主要集中在IA、2A、4A、6A、1B、6B、7B、1D和2D等染色體（表1），4A、6B、7B和1D染色體上的FISH信號變異頻率相對較高。相比中國春，濟(jì)麥系列小麥FISH位點(diǎn)變異有26處，其中，1處發(fā)生在染色體著絲粒區(qū)，11處（含隨體信號變異6處）發(fā)生在染色體短臂上，14處發(fā)生在染色體長臂上。

濟(jì)南17在1B染色體著絲粒處有明顯的Oli-go-pTa535-1信號（圖la），中國春和其他6份濟(jì)麥材料在此處均未發(fā)現(xiàn)該信號，因此，該信號可以作為濟(jì)南17的細(xì)胞學(xué)標(biāo)簽，有效區(qū)分于中國春和其他供試濟(jì)麥材料。同理，濟(jì)麥20的1D短臂末端和2A長臂末端的Oligo-pSc119.2-1信號均可以作為濟(jì)麥20的細(xì)胞學(xué)標(biāo)簽；濟(jì)麥262的SA長臂中間的Oligo-pSc119.2-1信號可以作為其細(xì)胞學(xué)標(biāo)簽。

3 結(jié)論與討論

供試7份濟(jì)麥系列小麥中，濟(jì)麥19、濟(jì)麥22和濟(jì)麥23的4A染色體長臂末端沒有Oligo-pSc119.2-1信號，其長臂的Oligo-pTa535-1信號相比中國春的4A染色體的信號更靠近末端，說明4A染色體長臂末端可能發(fā)生斷裂。同時，這三份材料的7B染色體長臂末端都具有Oli-go-pSc119.2-1信號，而在中國春7B長臂末端沒有Oligo-pSc119.2-l信號，因此，我們推測4A染色體長臂片段可能易位到7B長臂末端。類似的染色體4/7同源群重組現(xiàn)象已經(jīng)在小麥、黑麥和山羊草等物種中發(fā)現(xiàn)，因而，這種非同源重組并不是獨(dú)立現(xiàn)象，可能在進(jìn)化過程中這種染色體斷裂重接更有利于其適應(yīng)環(huán)境。

唐宗祥等對黑麥/綿陽11雜交后代材料、黑麥/綿陽11/川農(nóng)27雜交后代進(jìn)行了FISH分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小麥染色體發(fā)生了變異，變異主要集中在SA、6A、1B、2B、6B、7B、ID、3D和7D染色體上，認(rèn)為這些染色體結(jié)構(gòu)變異可能是由于黑麥染色體導(dǎo)入誘發(fā)的。葛群等研究發(fā)現(xiàn)黑麥染色體1R和SR單體附加系同樣可以誘導(dǎo)小麥染色體變異和異位。上述研究均是由于外源染色體導(dǎo)入導(dǎo)致了小麥染色體配對不正常而造成結(jié)構(gòu)變異。本研究發(fā)現(xiàn)了濟(jì)麥23（濟(jì)麥22和豫麥34雜交后代）不同單株的細(xì)胞學(xué)不穩(wěn)定性，即在沒有外源染色體導(dǎo)人的情況下，小麥染色體自身結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂，并形成染色體平衡易位。染色體平衡易位在人類染色體醫(yī)學(xué)中研究較多，但是在小麥中尚未被系統(tǒng)研究過，其易位機(jī)制也尚不清楚，值得今后進(jìn)一步研究。

趙檀等研究河北省169份小麥品種的遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，B染色體組具有最高的遺傳多樣性，4A、2D也有較高的多樣性水平。本研究發(fā)現(xiàn)小麥4A、6B、7B和2D染色體FISH變異位點(diǎn)較多，存在較高的多樣性，與上述研究結(jié)論具有一致性。蒲艷艷等利用SSR標(biāo)記對山東省小麥品種遺傳多樣性進(jìn)行了研究，認(rèn)為山東省小麥品種遺傳多樣性較低。王江春綜合利用分子、生物化學(xué)和農(nóng)藝性狀調(diào)查等多種手段對建國以來山東省育成的小麥品種進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)山東省小麥品種的遺傳多樣性有逐漸下降的趨勢。本研究利用FISH對濟(jì)麥系列小麥進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ISH變異位點(diǎn)主要集中在少數(shù)幾條染色體上且具有類似性，說明濟(jì)麥系列小麥的遺傳基礎(chǔ)相對狹窄。通過對濟(jì)麥系列小麥的系譜進(jìn)行追蹤，我們發(fā)現(xiàn)濟(jì)南17、濟(jì)麥19、濟(jì)麥20、濟(jì)麥22和濟(jì)麥23均含有魯麥13或魯麥14血緣，因此，濟(jì)麥系列小麥的類似FISH變異位點(diǎn)可能來源于魯麥13或魯麥14，需要進(jìn)一步證實(shí)，相同血緣造成的遺傳基礎(chǔ)狹窄與本研究的FISH結(jié)果相互印證。因?yàn)闈?jì)麥系列小麥推廣面積大，且在常規(guī)育種中經(jīng)常被用作育種親本，因此，在今后的育種工作中應(yīng)注意重點(diǎn)選擇與其親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)的親本進(jìn)行組配。