賴(lài)瑞聯(lián)　鐘春水　林玉玲　賴(lài)鐘雄

摘 要 為進(jìn)一步明確龍眼生長(zhǎng)素受體基因TIR1的結(jié)構(gòu)和功能，本試驗(yàn)采用RT-PCR和RACE-PCR對(duì)龍眼胚性愈傷組織2個(gè)TIR1基因（分別命名DlTIR1-1和DlTIR1-2）進(jìn)行克隆，并進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)分析。研究結(jié)果表明：DlTIR1-1全長(zhǎng)4 343 bp，包含ORF 1 755 bp，編碼584個(gè)氨基酸（GenBank登錄號(hào)：KR558759），而DlTIR1-2全長(zhǎng)2 821 bp，包含ORF 1 926 bp，編碼641個(gè)氨基酸（GenBank登錄號(hào)：KR558760）。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，DlTIR1-1和DlTIR1-2理化性質(zhì)較為一致，均屬于不穩(wěn)定蛋白，不含信號(hào)肽，具有跨膜螺旋；亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中，分別含有31個(gè)和45個(gè)蛋白磷酸化位點(diǎn)；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，DlTIR1-1與十字花科的亞麻薺和甜菜處于同一分支，而DlTIR1-2與甜橙和胡楊等木本植物保持較近的遺傳距離。qPCR結(jié)果表明，DlTIR1-1和DlTIR1-2在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中和不同組織器官中的表達(dá)模式較為一致，且在非胚性愈傷組織、根和花中表達(dá)量最高；此外，在一定的濃度范圍內(nèi)，IAA、ETH、ABA和GA3均能適當(dāng)提高龍眼TIR1的表達(dá)量，而添加MeJA卻明顯抑制TIR1的轉(zhuǎn)錄。上述結(jié)果表明，DlTIR1-1和DlTIR1-2可能具有相似功能，且均參與龍眼非胚性愈傷組織形成、根系分化以及花器官發(fā)育，此外龍眼生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能受多種植物激素調(diào)控。

關(guān)鍵詞 龍眼；TIR1；體細(xì)胞胚胎發(fā)生；激素

中圖分類(lèi)號(hào) S667.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To investigate the characteristic and function of TIR1 in longan， RT-PCR and RACE-PCR were used to clone 2 TIR1 genes（named DlTIR1-1 and DlTIR1-2）from embryogenic callus of Dimocarpus longan Lour.， and then the expression patterns of the 2 genes were analyzed by qPCR. The results showed that， the sequence of DlTIR1-1 was 4 343 bp， containing ORF sequence 1 755 bp， encoding 584 amino acids（GenBank accession number KR558759）， and the sequence of DlTIR1-2 was 2 821 bp， containing ORF 1 926 bp， encoding 641 amino acids（GenBank accession number KR558760）. Bioinformatics analysis showed that the physical and chemical properties of DlTIR1-1 and DlTIR1-2 were similar， they were unstable proteins， had no signal peptide， but had transmembrane structure. Phylogenetic tree analysis indicated that DlTIR1-1 belonged to the same branch with Camelina sativa and Beta vulgaris subsp， when DlTIR1-2 kept close genetic distance with Populus euphratica and Citrus sinensis. qPCR results showed that DlTIR1-1 and DlTIR1-2 had the consistent expression pattern in somatic embryogenesis， different tissues and treatments by different hormones， and both genes had the highest expressions in non-embryogenic callus， roots and flowers of longan. In addition， DlTIR1-1 and DlTIR1-2 had different expression patterns under different treatments of IAA， ABA， GA3， MeJA and ETH. The results indicated that， DlTIR1-1 and DlTIR1-2 had the similar function in the process of NEC growth， root differentiation and floral organ development of longan. In addition， the auxin signal transduction of longan might be regulated by several kinds of hormones.

Key wards Dimocarpus longan Lour.； TIR1； Somatic embryogenesis； Hormones

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.023

龍眼（Dimocarpus longan Lour.），無(wú)患子科龍眼屬，又稱(chēng)桂圓、益智，其果實(shí)富含多糖、多酚、粗蛋白和維生素等多種營(yíng)養(yǎng)和藥用成分，是中國(guó)熱帶亞熱帶地區(qū)重要果樹(shù)。龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生（簡(jiǎn)稱(chēng)體胚發(fā)生）系統(tǒng)作為木本植物優(yōu)良的模式系統(tǒng)之一，是開(kāi)展植物胚胎發(fā)育研究良好的替代材料。研究表明，生長(zhǎng)素能夠調(diào)控植物體胚發(fā)生，而生長(zhǎng)素受體是生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵因子，因此開(kāi)展生長(zhǎng)素受體相關(guān)研究對(duì)于進(jìn)一步揭示植物體胚發(fā)生的機(jī)理以及生長(zhǎng)素在體胚發(fā)生中的響應(yīng)機(jī)制具有重要意義。

2005年，Dharmasiri等[1]首次成功證實(shí)生長(zhǎng)素運(yùn)輸抑制劑響應(yīng)蛋白（Transport Inhibitor Response 1，TIR1）為植物的生長(zhǎng)素受體。隨后，TIR1的作用機(jī)理及其在不同植物中的功能也越來(lái)越受關(guān)注。植物體Aux/IAA蛋白質(zhì)中包含4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域Ⅱ?yàn)門(mén)IR1結(jié)合域以及Aux/IAA蛋白的去穩(wěn)定性區(qū)域，而結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅳ是生長(zhǎng)素應(yīng)答因子ARF的結(jié)合部位。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)未檢測(cè)生長(zhǎng)素信號(hào)時(shí)，Aux/IAA與ARF結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄；而生長(zhǎng)素信號(hào)出現(xiàn)后，生長(zhǎng)素作為“分子膠黏劑”活化TIR1使其與Aux/IAA蛋白的結(jié)構(gòu)域Ⅱ結(jié)合，Aux/IAA從染色體上脫落，形成SCFTIR1-Aux/IAA復(fù)合體被泛素化，并迅速被26S蛋白酶體降解，ARF被釋放并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄[2-5]。

TIR1作為生長(zhǎng)素受體對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要調(diào)控功能。研究發(fā)現(xiàn)，TIR1能夠改變李果實(shí)成熟進(jìn)程[6]，促進(jìn)擬南芥根系形成[7-8]，參與茶樹(shù)冬芽休眠[9]等。此外，TIR1與其調(diào)控miRNA互作可提高水稻分蘗[10]和玉米抗病[11]。而在龍眼中，TIR1同樣參與了體胚發(fā)生過(guò)程，但目前相關(guān)研究較少[12]。鑒于此，本試驗(yàn)以龍眼胚性愈傷組織為材料，采用RT-PCR和RACE-PCR對(duì)TIR1基因進(jìn)行分離和克隆，同時(shí)通過(guò)qPCR技術(shù)對(duì)龍眼不同組織器官、不同體胚發(fā)育階段以及不同激素作用下TIR1的表達(dá)模式進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步揭示龍眼TIR1的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

龍眼‘紅核子品種胚性愈傷組織由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供[13]。龍眼體胚不同發(fā)育階段培養(yǎng)物參照賴(lài)鐘雄[13]建立的方法培養(yǎng)獲得，包括非胚性愈傷組織（NEC）、胚性愈傷組織（EC）、體胚發(fā)生早期的不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)（IcpEC）、球形胚（GE）以及后期的子葉胚（CE）5種。不同激素處理材料為MS液體培養(yǎng)基中分別添加不同濃度生長(zhǎng)素（IAA）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、茉莉酸甲酯（MeJA）和乙烯（ETH）進(jìn)行24 h處理的龍眼EC。此外，試驗(yàn)所用的‘四季蜜龍眼根、葉、花、果和種子等不同組織器官于2014年11月采自福建省莆田農(nóng)科所果樹(shù)良種繁育場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA逆轉(zhuǎn)錄 龍眼體胚不同發(fā)育階段培養(yǎng)物以及不同激素處理的EC采用Tripue試劑盒進(jìn)行RNA提取，而龍眼根、葉、花、果實(shí)和種子采用天根多糖多酚試劑盒進(jìn)行RNA抽提，RNA質(zhì)量和濃度檢測(cè)合格后采用GeneRacerTM Kit逆轉(zhuǎn)錄cDNA用于RT-PCR，采用PrimerscriptTM RT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄cDNA用于qPCR。具體操作步驟參考使用說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 TIR1基因克隆 根據(jù)基因功能注釋從本研究所龍眼胚性愈傷組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank登錄號(hào)：SRA059205）篩選表達(dá)量較高的TIR1部分序列信息，通過(guò)Blast從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索并下載與之同源性較高的其他物種TIR1完整序列，再采用同源克隆進(jìn)行保守區(qū)序列擴(kuò)增。隨后，參照陳裕坤等[14]的方法進(jìn)行3′末端和5′末端序列擴(kuò)增、TIR1序列拼接以及TIR1全長(zhǎng)驗(yàn)證。試驗(yàn)所用引物均購(gòu)自北京六合華大基因科技股份有限公司，具體信息如表1所示。

RT-PCR擴(kuò)增程序和反應(yīng)體系參考李惠華等[12]建立的方法，并根據(jù)所用引物TM值和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的不同適當(dāng)調(diào)整。獲得的目的片段進(jìn)行割膠回收，TA克隆并挑選陽(yáng)性克隆子進(jìn)行菌液PCR，再將具有相應(yīng)目的條帶的菌液送上海博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 采用ExPASy ProtParam進(jìn)行翻譯蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)；采用TMHMM 2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析；采用SignaIP 3.0 Server進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；采用PSORT進(jìn)行亞細(xì)胞定位；采用Jpred進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；采用SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；采用NetPhos 2.0進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)與分析；采用MEGA 5.2.2鄰位歸并法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 qPCR分析 參考Lin等[15-16]建立的方法，以龍眼EIF4a、EF-1a和FSD作為內(nèi)參基因。采用LightCyclers480和SYBRRPrumix EX TaqTMⅡ 進(jìn)行龍眼不同體胚發(fā)育階段、不同組織器官以及不同激素處理下TIR1表達(dá)模式的qPCR試驗(yàn)，并通過(guò)Excel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表制作，同時(shí)采用SPSS19.0進(jìn)行不同表達(dá)水平之間的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DlTIR1-1和DlTIR1-2 cDNA全長(zhǎng)序列獲得

從龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到2條表達(dá)量較高的龍眼TIR1序列，分別命名DlTIR1-1和DlTIR1-2。DlTIR1-1序列長(zhǎng)度為4 182 bp，包含完整的ORF序列，但中間存在部分堿基缺失。以龍眼胚性愈傷組織cDNA為模板，兩端設(shè)計(jì)上下游引物PCR擴(kuò)增完整ORF序列；隨后分別設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE引物，采用RACE-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得3′UTR和5′UTR分別為128、162 bp。拼接比對(duì)獲得DlTIR1-1 cDNA序列4 335 bp，兩端設(shè)計(jì)特異引物全長(zhǎng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)DlTIR1-1 cDNA全長(zhǎng)為4 343 bp，其中包含ORF 1 755 bp，編碼584個(gè)氨基酸，5′UTR為356 bp，起始密碼子為ATG，3′UTR為2 232 bp，終止密碼子為T(mén)AA，PolyA尾長(zhǎng)度為26 bp。將該序列通過(guò)NCBI進(jìn)行Blast，其與柑橘的相似性達(dá)到81%，而與麻風(fēng)樹(shù)和胡楊的相似性均為80%，說(shuō)明該基因?yàn)辇堁跿IR1家族成員。而DlTIR1-2在龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列長(zhǎng)度為1 633 bp，利用NCBI進(jìn)行Blast發(fā)現(xiàn)，DlTIR1-2與柑橘、蓖麻和葡萄具有很高的同源性，而5′端區(qū)域仍有較多的缺失，通過(guò)同源克隆擴(kuò)增5′端序列981 bp，隨后RACE-PCR得到3′RACE和5′RACE片段分別246、104 bp，拼接發(fā)現(xiàn)DlTIR1-2基因cDNA全長(zhǎng)為2 821 bp，全長(zhǎng)驗(yàn)證結(jié)果與該拼接結(jié)果一致，DlTIR1-2包含1 926 bp ORF序列，共編碼641個(gè)氨基酸，5′UTR為364 bp，起始密碼子為ATG，3′UTR為531 bp，終止密碼子為T(mén)GA，PolyA尾長(zhǎng)度為43 bp。通過(guò)NCBI進(jìn)行Blast發(fā)現(xiàn)，DlTIR1-2與葡萄、楊樹(shù)和麻風(fēng)樹(shù)的相似性均達(dá)到79%，也是龍眼TIR1基因的一員。

2.2 生物信息學(xué)分析

DlTIR1-1和DlTIR1-2理化性質(zhì)分析結(jié)果如表2所示，2個(gè)蛋白之間理化性質(zhì)指標(biāo)差異較小，且均為不穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)；亞細(xì)胞定位分析顯示DlTIR1-1和DlTIR1-2可能定位于細(xì)胞質(zhì)中；而ExPASy TMpred預(yù)測(cè)表明二者均含有跨膜螺旋；NetPhos分析表明DlTIR1-1含有31個(gè)蛋白磷酸化位點(diǎn)（Ser：22，Thr：6，Tyr：3），而DlTIR1-2有45個(gè)（Ser：34，Thr：7，Tyr：4）。

采用Jpred進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，DlTIR1-1編碼的氨基酸序列主要包含α-螺旋和β-折疊，分別占35.05%和6.23%，可能存在的功能位點(diǎn)包括5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、2個(gè)依賴(lài)cAMP和cGMP蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、8個(gè)蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)以及3個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)；而DlTIR1-2中α-螺旋和β-折疊比例分別為35.56%和8.03%，包含的功能位點(diǎn)有6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、1個(gè)依賴(lài)cAMP和cGMP蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、8個(gè)蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)以及4個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)。進(jìn)一步通過(guò)Swiss-Model進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，這2種氨基酸序列與擬南芥TIR1（PDB：3c6o.1.B）相似度分別為58.56%和50.36%，以該TIR1為模型構(gòu)建DlTIR1-1和DlTIR1-2三維結(jié)構(gòu)如圖1所示。

DlTIR1-1、DlTIR1-2與其他物種TIR1進(jìn)行比對(duì)結(jié)果如圖2所示，2條氨基酸序列含有F-box結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步進(jìn)行TIR1系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)不同物種的TIR1氨基酸序列大體可以分為3個(gè)大類(lèi)，其中甜橙、胡楊、蘋(píng)果等大部分木本植物進(jìn)化距離較近，其他類(lèi)草本植物歸為另一類(lèi)，此外，十字花科的甜菜和亞麻薺又單獨(dú)歸類(lèi)。龍眼DlTIR1-2與木本植物保持了較近的進(jìn)化距離，例如甜橙和胡楊等，而龍眼DlTIR1-1與十字花科的亞麻薺和甜菜保持較近的親緣關(guān)系（圖3）。

2.3 DlTIR1-1和DlTIR1-2轉(zhuǎn)錄水平的qPCR分析

2.3.1 DlTIR1-1和DlTIR1-2在龍眼體胚不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平的qPCR分析 DlTIR1-1和DlTIR1-2在龍眼體胚不同發(fā)育階段的表達(dá)模式如圖4所示，在龍眼體胚不同發(fā)育階段，DlTIR1-1和DlTIR1-2的表達(dá)趨勢(shì)較為一致，均先降后升再降，近似“W”模型。DlTIR1-1和DlTIR1-2在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程不同階段的表達(dá)差異較大，且非胚性愈傷組織中的表達(dá)量（NEC）明顯高于體胚發(fā)生其他階段。而在同一個(gè)階段的培養(yǎng)物中，除不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)外，DlTIR1-1在其他階段的表達(dá)量均高于DlTIR1-2?？梢?jiàn)DlTIR1-1和DlTIR1-2可能在龍眼體胚發(fā)揮過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，且DlTIR1-1的調(diào)控作用更為顯著。

2.3.2 DlTIR1-1和DlTIR1-2在‘四季密龍眼不同組織器官中轉(zhuǎn)錄水平的qPCR分析 龍眼根、葉、花、果實(shí)和種子等組織器官中DlTIR1-1和DlTIR1-2的表達(dá)模式如圖5所示。DlTIR1-1和DlTIR1-2在不同組織器官中的表達(dá)趨勢(shì)一致，在根中的表達(dá)量最高，其次是花，而在葉片和果實(shí)中的表達(dá)量最低。此外，同一個(gè)基因在不同組織器官中的表達(dá)具有顯著差異，DlTIR1-1在根中的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到9.032，而最低時(shí)在葉片中的表達(dá)量?jī)H為0.603，僅為前者的1/15；DlTIR1-2在根中的相對(duì)表達(dá)量為10.020，而最低時(shí)在果實(shí)中的表達(dá)量0.343，相差29倍。可見(jiàn)，DlTIR1-1和DlTIR1-2在龍眼不同組織器官中存在較大的功能差異，可能參與了根系的分化和花器官發(fā)育。

2.3.3 DlTIR1-1和DlTIR1-2在不同激素處理下表達(dá)模式的qPCR分析 不同濃度ABA、GA3、IAA、MeJA和ETH處理下DlTIR1-1和DlTIR1-2的表達(dá)模式如圖6所示，2個(gè)基因?qū)Σ煌N類(lèi)和不同濃度激素均有響應(yīng)，且在同一激素處理下，二者表達(dá)趨勢(shì)較為相似。采用ABA不同濃度處理時(shí)，DlTIR1-1的表達(dá)隨著ABA濃度的升高先升后降，而DlTIR1-2表達(dá)量則逐步下調(diào)；在GA3和IAA不同濃度處理下，DlTIR1-1均為先上升后下降，而DlTIR1-2表達(dá)趨勢(shì)與DlTIR1-1略有差異。試驗(yàn)中，DlTIR1-1和DlTIR1-2對(duì)ABA、GA3和IAA的響應(yīng)較弱，而受MeJA和ETH影響較為顯著。采用50 mg/L的MeJA處理時(shí)，DlTIR1-1和DlTIR1-2的表達(dá)迅速下降，隨著濃度繼續(xù)升高，二者的表達(dá)量有所上升，但上升幅度較小，遠(yuǎn)比處理前的表達(dá)水平低；ETH處理中，DlTIR1-1和DlTIR1-2的轉(zhuǎn)錄水平迅速上調(diào)，隨后下降，并在10 mg/L時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大?？梢?jiàn)，ABA、GA3、IAA、MeJA和ETH可能參與了DlTIR1-1和DlTIR1-2介導(dǎo)的龍眼生長(zhǎng)素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而不同TIR1成員對(duì)這些激素的敏感性和親和力也有一定差異。

3 討論與結(jié)論

3.1 DlTIR1-1和DlTIR1-2基因功能相似

長(zhǎng)期以來(lái)，激素受體作為植物激素代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子一直是研究熱點(diǎn)，而一種激素的不同受體也往往具有特異的作用方式[17-19]。2005年，Dharmasiri等[1]證實(shí)TIR1為植物生長(zhǎng)素受體以后，TIR1基因及其調(diào)控功能在煙草[20]、黃瓜[21]、番茄[22]等多種植物中均有廣泛研究。在龍眼中，李惠華等[12]也進(jìn)行了TIR1的初步研究，然而，作為一個(gè)多基因家族，龍眼TIR1仍缺乏較為系統(tǒng)全面的研究，對(duì)其功能調(diào)控方式的系統(tǒng)闡釋形成了較大的局限。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)龍眼TIR1基因進(jìn)一步挖掘和分析發(fā)現(xiàn)，DlTIR1-1和DlTIR1-2翻譯的氨基酸序列具有相似的理化性質(zhì)且二者在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程、組織器官分化以及不同激素響應(yīng)過(guò)程中的表達(dá)模式具有較高的一致性。由此可見(jiàn)，龍眼DlTIR1-1和DlTIR1-2在進(jìn)化上具有一定的保守性和功能相似性。

3.2 TIR1可能調(diào)控龍眼體胚發(fā)生

植物的生長(zhǎng)發(fā)育是由復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同作用的結(jié)果。在龍眼體胚發(fā)生相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)龍眼TIR1[12]會(huì)響應(yīng)內(nèi)外源生長(zhǎng)素的綜合作用，而生長(zhǎng)素受體下游基因DlARF1[23]和DlARF5a[24]作為抑制型的生長(zhǎng)素應(yīng)答因子在體胚發(fā)生過(guò)程中與前者表達(dá)趨勢(shì)相反，進(jìn)一步驗(yàn)證生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了龍眼體胚發(fā)生。然而，早期研究中，龍眼非胚性愈傷組織作為一個(gè)重要的材料卻很少見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)分別對(duì)龍眼非胚性愈傷組織和體胚發(fā)生過(guò)程進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)DlTIR1-1和DlTIR1-2在體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)與李惠華等[12]研究結(jié)果較為一致，而在龍眼非胚性愈傷組織中的表達(dá)卻遠(yuǎn)高于其他階段，二者在龍眼體胚發(fā)生整個(gè)過(guò)程中的表達(dá)呈現(xiàn)較大的時(shí)間差異性，由此可見(jiàn)龍眼TIR1基因不同時(shí)間的差異表達(dá)參與了龍眼體胚發(fā)生，其在龍眼非胚性愈傷組織的形成和生長(zhǎng)過(guò)程中可能也發(fā)揮更重要的調(diào)控作用。

3.3 TIR1的組織特異表達(dá)可能參與龍眼組織器官分化

在不同植物組織器官TIR1基因的表達(dá)研究中，CsTIR1[9]在茶樹(shù)葉片中的表達(dá)量最高，根和花中的表達(dá)量最低，MaTIR1[25]在桑樹(shù)葉片和根中的表達(dá)量最高。由此可見(jiàn)，TIR1的組織特異性表達(dá)可能與不同物種組織的形成方式和所行使的生物學(xué)功能有關(guān)。在本試驗(yàn)中，龍眼DlTIR1-1和DlTIR1-2在龍眼根系中的表達(dá)量最高，其次是花，推測(cè)該TIR1可能參與龍眼根系分化和開(kāi)花過(guò)程。而在擬南芥的研究中，王金祥等[26]和Chen等[27]等發(fā)現(xiàn)擬南芥TIR1突變體或抑制TIR1表達(dá)會(huì)減少不定根和側(cè)根的形成，而TIR1過(guò)表達(dá)則增加側(cè)根的數(shù)目，即TIR1調(diào)控?cái)M南芥根系形成過(guò)程，與本研究結(jié)果一致。而在TIR1調(diào)控植物開(kāi)花的研究中，董秀春[28]通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化也驗(yàn)證了毛白楊PtTIR1基因具有調(diào)控花發(fā)育功能。由此可見(jiàn)，龍眼TIR1的組織特異表達(dá)可能參與組織器官的形成，尤其可能與根系分化和花器官發(fā)育密切相關(guān)。

3.4 植物激素可能調(diào)控龍眼生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

植物體中激素的調(diào)控作用具有偶聯(lián)效應(yīng)，一種植物激素往往能夠通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)體系影響其他激素的作用[29]。已有研究表明，茶樹(shù)[9]和南瓜[21]等TIR1受IAA、ABA、MeJA、GA3等多種植物激素的影響，但不同物種TIR1對(duì)這些激素的親和力和敏感性差異較大。試驗(yàn)中，DlTIR1-1和DlTIR1-2對(duì)IAA、ABA、MeJA、GA3和ETH均有響應(yīng)，但不同激素對(duì)基因的影響效果差異較大，且同一種激素處理下2個(gè)基因間同樣存在表達(dá)差異。在一定的濃度范圍內(nèi)，IAA、ETH、ABA和GA3均能適當(dāng)提高龍眼TIR1的表達(dá)量，而添加MeJA卻明顯抑制TIR1的轉(zhuǎn)錄。TIR1作為生長(zhǎng)素受體會(huì)響應(yīng)IAA的誘導(dǎo)作用，但Badescu等[30]研究表明不同基因?qū)ζ溆H和作用不同，故在0～2 mg/L范圍內(nèi)，DlTIR1-1的響應(yīng)效果均較明顯，而在0～1.5 mg/L范圍內(nèi)DlTIR1-2的幾乎不發(fā)生改變；Sunker等[31]認(rèn)為ABA能夠上調(diào)miR393的表達(dá)，而miR393會(huì)裂解TIR1，故本試驗(yàn)中2個(gè)基因隨ABA濃度的升高逐步下調(diào)表達(dá)；Ouaked等[32]研究表明，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一部分是生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使，二者之間可能存在一個(gè)連接點(diǎn)，故乙烯濃度的變化會(huì)影響TIR1的轉(zhuǎn)錄水平；在GA3和生長(zhǎng)素的互作關(guān)系研究中，吳建明等[33]發(fā)現(xiàn)外源GA3會(huì)適當(dāng)提高生長(zhǎng)素的含量但差異并不顯著，因此在本試驗(yàn)中，提高赤霉素的濃度時(shí)TIR1基因會(huì)適當(dāng)上調(diào)表達(dá)，而濃度繼續(xù)升高時(shí)，表達(dá)量下降，隨后開(kāi)始上升，但之間的調(diào)控幅度較?。籆ai等[34]研究發(fā)現(xiàn)，MeJA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑會(huì)與生長(zhǎng)素生物合成和極性運(yùn)輸串?dāng)_，這也是本試驗(yàn)中DlTIR1-1和DlTIR1-2劇烈響應(yīng)MeJA變化的可能原因。綜合分析，不同植物激素在一定程度上都會(huì)調(diào)控龍眼TIR1基因的表達(dá)，即不同植物激素可能調(diào)控龍眼生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而這種調(diào)控機(jī)制仍有待后期進(jìn)一步驗(yàn)證。

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