郭立佳　梁昌聰　劉磊　汪軍　楊臘英　王國芬　黃俊生

摘 要 為了研究尖孢鐮刀菌古巴專化型假定G蛋白偶聯(lián)受體基因fogpr1的功能，構(gòu)建了fogpr1基因敲除突變體。與野生型相比，fogpr1基因敲除突變體在菌絲生長、產(chǎn)孢量和菌落形態(tài)等方面沒有明顯變化，對巴西蕉的致病性也沒有降低。此外，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)ogpr1可以與G蛋白Fga1、Fga2 和Fgb1互作。這些結(jié)果表明Fogpr1可能是一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體，但不參與調(diào)控尖孢鐮刀菌的發(fā)育和致病性。

關(guān)鍵詞 尖孢鐮刀菌古巴專化型；G蛋白；致病性；生長；發(fā)育

中圖分類號 S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To investigate the functions of the G-protein coupled receptor gene fogpr1 in the pathogenic fungus Fusarium oxysporum f. sp. cubense（Foc）， the fogpr1 deletion mutants were constructed. The fogpr1-deletion mutants showed no apparent alterations in mycelium growth， conidiation and colonial morphology as compared to the wild type. The virulence against banana plants（Musa spp. cv. Brazil）was not reduced. Additionally， the protein Fogpr1 could interact with the G-protein Fga1， Fga2 and Fgb1 in yeast two-hybrid system. The results indicate that Fogpr1 might be a G-protein coupled receptor， whereas play no roles in development and pathogenicity of Foc. The results lay a foundation for studying the roles of G-protein coupled receptors in Foc.

Key words Fusarium oxysporum f. sp. cubense； G-protein coupled receptor； Pathogenicity； Growth； Development

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.021

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是一種無性真菌，廣泛存在于各種環(huán)境中，其在土壤中可以長久存活，故也是一種土壤習(xí)居菌。其中一些尖孢鐮刀菌是重要的植物病原菌，引起許多作物包括棉花、番茄、西瓜、甘藍(lán)、香蕉等根腐病或枯萎病。因此，尖孢鐮刀菌病原菌是許多農(nóng)作物生產(chǎn)的一種重要限制因子[1-2]。當(dāng)前重要作物枯萎病的防治主要依靠使用抗性品種，包括使用抗性砧木?？共∮N是該類病害防治的重要研究方向。

尖孢鐮刀菌古巴?；停‵. oxysporum f. sp. cubense）是引起香蕉枯萎病的病原菌。該病原菌引起的香蕉枯萎病十分難以防治，目前尚無十分有效的方法，使用抗病品種是今后防治該病害的主要措施之一。對其致病機(jī)理的深入理解將有助于香蕉抗枯萎病育種。近年來，在尖孢鐮刀菌古巴?；椭虏C(jī)理研究方面取得了一些進(jìn)展。筆者所在的科研團(tuán)隊(duì)破譯了尖孢鐮刀菌古巴?；?號和4號小種基因組序列[3]。國內(nèi)外一些學(xué)者鑒定了一些致病基因包括fgb1[4]、FoOCH1[5]、Focr4-1562[6]、Foatf1[7]等。然而，這些研究結(jié)果相對于復(fù)雜的病原菌致病機(jī)理來說，仍然十分有限，仍需更深入研究。尤其是尖孢鐮刀菌如何感知環(huán)境和宿主，在很大程度上仍是未知。

研究發(fā)現(xiàn)，在一些真核生物中，G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）是一類包含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，主要負(fù)責(zé)傳遞胞外信號到胞內(nèi)并觸發(fā)一些信號傳導(dǎo)級聯(lián)。G蛋白偶聯(lián)受體在各種信號如光、質(zhì)子、鈣離子、氣味、氨基酸、核苷酸、蛋白、多肽、激素類和脂肪酸等刺激下，會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致與其結(jié)合的G蛋白復(fù)合物解離為α亞基和βγ二聚體，繼而激活下游信號通路，引起生理和代謝的變化[8]。在一些模式真菌中，一些G蛋白偶聯(lián)受體已有研究報(bào)道。在芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，STE3和STE2參與有性結(jié)合，Gpr1參與營養(yǎng)感知，調(diào)控假菌絲的分化[8]。Gehrke A等[9]研究發(fā)現(xiàn)GprC和GprD參與調(diào)控?zé)熐梗ˋspergillus fumigatus）的菌落生長、菌絲形態(tài)發(fā)生和毒力；Xue C等[10]發(fā)現(xiàn)在新隱球菌（Cryptococcus neoformans）中 Gpr4感知氨基酸可激活依賴cAMP的蛋白激酶A途徑；Li L等[11]發(fā)現(xiàn)在粗糙鏈孢霉（Neurospora crassa）中GPR-4對碳源依賴的無性生長和發(fā)育是必需的；Miwa T等[12]發(fā)現(xiàn)Gpr1調(diào)控白色念球菌（Candida albicans）的形態(tài)發(fā)生和菌絲形成；Han K等[13]發(fā)現(xiàn)GprD負(fù)調(diào)控構(gòu)巢曲霉（A. nidulans）的有性發(fā)育。這些研究結(jié)果表明，G蛋白偶聯(lián)受體在真菌生長、形態(tài)發(fā)生和毒力等生物過程中具有重要調(diào)控作用。在尖孢鐮刀菌中，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)G蛋白基因（fga1、fga2和fgb1）參與尖孢鐮刀菌黃瓜?；停‵. oxysporum f. sp. cucumerinum）的發(fā)育和致病性，并可能參與胞外信號在胞內(nèi)的傳遞。但是，迄今與G蛋白復(fù)合物結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受體仍未有所研究報(bào)道。

筆者采用生物信息學(xué)方法從尖孢鐮刀菌古巴專化型基因組序列中鑒定了假定G蛋白偶聯(lián)受體編碼基因Fogpr1，發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白與芽殖酵母G蛋白偶聯(lián)受體Gpr1、煙曲霉GprC和GprD等在發(fā)育關(guān)系上較為接近，相似性較高。為驗(yàn)證其功能，筆者進(jìn)一步通過基因敲除實(shí)驗(yàn)獲得Fogpr1敲除突變體，并對突變體進(jìn)行了分析，以期了解其功能及在尖孢鐮刀菌古巴專化型侵染香蕉過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）培養(yǎng)基PDA、PDB和再生培養(yǎng)基的配制參照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行。

（2）0.7 mol/L氯化鈉溶液，Driselase崩潰酶溶液（20 mg/mL， Sigma）轉(zhuǎn)化使用的STC溶液和PTC溶液的配制方法參考文獻(xiàn)[4]。

（3）供試菌株和質(zhì)粒尖孢鐮刀菌古巴?；停‵. oxysporum f. sp. cubense）4號小種菌株B2和pCT74質(zhì)粒由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所微生物資源研究利用課題組保存。

（4）供試香蕉品種巴西蕉苗（Musa sp. AAA. cv. Brazil）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院組織培養(yǎng)中心提供，株高大約20 cm。

1.2 方法

（1）真菌基因組DNA提取野生型菌株B2和轉(zhuǎn)化菌株的菌絲體培養(yǎng)及基因組DNA提取參照文獻(xiàn)[14]的方法。

（2）fogpr1基因敲除載體的構(gòu)建以野生型菌株基因組DNA為模板，用引物對AF（5′-ggggtaccATG

TCAGCAACAGAAGGAAGATG-3′， 劃線堿基為KpnⅠ識(shí)別序列）和AR（5′-ccgctcgagACAGTAACGGCGGT

CAATCC-3′，劃線堿基為XhoⅠ識(shí)別序列）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得fogpr1基因開放閱讀框上游5′端745 bp同源臂DNA；用引物對BF（5′-tcccccgggTG

TTCCACTCACCAATCTCCTT-3′，劃線堿基為SmaⅠ識(shí)別序列）和BR（5′-tgctctagaCTGCTCTGCTGTTGTT

GACTAA-3′，劃線堿基為XbaⅠ識(shí)別序列）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得下游3′端826 bp同源臂DNA。PCR擴(kuò)增采用Premix TaqTM試劑（TaKaRa， Dalian），擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，即95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃保溫5 min。所擴(kuò)增的DNA片斷分別連接于pMD19T載體，形成pMD19T-5A和pMD19T-3B克隆載體。再用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ、SmaⅠ和XbaⅠ從克隆載體切下5′端和3′端同源臂DNA，分別連接于相同限制性內(nèi)切酶酶切的線性pCT74載體（包含潮霉素抗性基因hph和GFP基因表達(dá)盒）中，構(gòu)建成pCT74-fogpr1載體。最后用KpnⅠ和XbaⅠ從pCT74-fogpr1載體中切下用于轉(zhuǎn)化的DNA片斷，回收純化備用。

（3）尖孢鐮刀菌古巴?；驮|(zhì)體制備參照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行。

（4）PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行。

（5）PCR擴(kuò)增鑒定fogpr1基因敲除突變體以fogpr1轉(zhuǎn)化子和野生型菌株B2基因組DNA為模板，采用引物F1（5′-GTGTTGGAGGTGATTATGAG-3′）和F2（5′-CGTTGCAAGACCTGCCTGAA-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測轉(zhuǎn)化子是否在fogpr1 5′端發(fā)生的同源重組；用引物C1（5′-ATGAACTCGCAAGGCAACAG-3′）和C2（5′-TCATTTTCCTCTCGGTGTACG-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測轉(zhuǎn)化子是否存在fogpr1基因，預(yù)計(jì)分別擴(kuò)增約2 180 bp和1 606 bp DNA片斷。如果用F1和F2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性而用C1和C2 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果為陰性，那么這類轉(zhuǎn)化子即為fogpr1基因敲除突變體。PCR擴(kuò)增采用Premix TaqTM試劑（Takara，Dalian），擴(kuò)增條件與1.2-（2）所述相同，除延伸時(shí)間改為2 min外。

（6）酵母雙雜載體的構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化分別用引物對Fogpr1_A（5′-ggaggccagtgaattcAAGCTTACGAC

ATGGAGCTTG-3′和5′-cgagctcgatggatccTTGATTCGG

TCGTCGAGGGGC-3′，小寫字母堿基為同源重組序列，下同）和引物對Fogpr1_B（5′-ggaggccagtgaattcCG

AAACACCATCGTCTTCGCC-3′和5′-cgagctcgatggatcc

TCTATGCGCATCCATGCTCCT-3′），以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得Fogpr1胞內(nèi)肽段A（第48～109氨基酸殘基）和B（第344～479氨基酸殘基）DNA編碼序列，分別為186 bp和408 bp。采用clonase酶（Clontech， USA）通過重組反應(yīng)，分別連接于捕獲載體pGADT7 AD，形成載體pGADT7-A和-B。分別用引物對T7-fga1（5′-catggaggccgaattcAT

GGGCTGCGGAATGAGCACAGAG-3′和5′-gcaggtcga

cggatccTTAGATAAGACCACAGAGACGCAG-3′）、T7-

fga2（5′-catggaggccgaattcATGGGCGCATGCATGAGC

TCGAGT-3′和5′-gcaggtcgacggatccTCAAAGAATGCC

CGAGTCCTTAAG-3′）和T7-Fgb1（5′-catggaggccgaat

tcATGAACTCGCAAGGCAACAGT-3′和5′-gcaggtcga

cggatccTCATTTTCCTCTCGGTGTACG-3′），以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得G蛋白α和β亞基編碼基因fga1、fga2和fgb1序列，并分別連接于誘餌載體pGBKT7中，形成載體pGBKT7-fga1、-fga2和-fgb1。隨后將所構(gòu)建捕獲載體和誘餌載體送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。驗(yàn)證克隆序列正確后，將捕獲載體和誘餌載體進(jìn)行兩兩組合，共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H Gold。酵母轉(zhuǎn)化參照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System試劑盒（Clontech， USA）所示的說明書方法進(jìn)行。在QDO培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。同時(shí)，共轉(zhuǎn)化空載的捕獲載體和誘餌載體的酵母Y2H Gold菌株做對照。

（7）致病性測定及病情統(tǒng)計(jì)將fogpr1敲除突變體和野生型菌株B2菌株分別接種于300 mL的PDB培養(yǎng)基中，置于25 ℃、180 r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)7 d。離心收集分生孢子，用蒸餾水重懸，將分生孢子懸浮液濃度調(diào)至106個(gè)/mL。野生型菌株與fogpr1敲除突變體均處理30株幼苗，每株苗澆50 mL孢子懸浮液，以無菌水作為對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。處理后，按照常規(guī)方法栽培管理，并觀察植株的發(fā)病情況。接種處理30 d后，從中間縱向切開球莖，觀察球莖褐變程度以及葉片黃化情況，記錄每株幼苗發(fā)病級數(shù)，病害分級詳見文獻(xiàn)[14]： 0級健康無發(fā)?。?級20%以內(nèi)球莖組織褐變；2級40%以內(nèi)球莖褐變；3級為60%以內(nèi)球莖褐變；4級為80%以內(nèi)球莖褐變，葉片黃化；5級為80%以上球莖褐變，植株死亡。

1.3 數(shù)據(jù)處理

接種fogpr1突變體和野生型菌株B2的香蕉幼苗發(fā)病情況用病情指數(shù)表示，病情指數(shù)計(jì)算采用公式：病情指數(shù)=100×[∑（植株發(fā)病級數(shù)×對應(yīng)株數(shù)）/（植株發(fā)病最高級數(shù)×總株數(shù)）]。數(shù)據(jù)采用SigmaPlot 12.5軟件統(tǒng)計(jì)分析模塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 fogpr1基因敲除載體的構(gòu)建與突變體鑒定

用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ酶切fogpr1基因敲除載體pCT74-fogpr1，結(jié)果可切下預(yù)計(jì)的約750 bp DNA條帶，用SmaⅠ和XbaⅠ酶切，可切下約840 bp DNA條帶（圖1-A）。測序結(jié)果表明所克隆的DNA序列正確。這些結(jié)果表明fogpr1基因敲除載體已構(gòu)建成功。以其中4個(gè)轉(zhuǎn)化子和野生型菌株基因組DNA為模板，用F1/F2引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，以轉(zhuǎn)化子A1～A4基因組DNA為模板，可擴(kuò)增到大約2.1 kb的DNA擴(kuò)增條帶，野生型及清水對照均無PCR擴(kuò)增條帶（圖1-B）；用C1/C2引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，以轉(zhuǎn)化子A1～A4的DNA和清水為模板，PCR擴(kuò)增檢測均無條帶，而以野生型菌株B2的DNA為模板，可檢測到1.4 kb左右的DNA擴(kuò)增條帶（圖1-C）。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)化子A1～A4均為fogpr1敲除突變體。

2.2 fogpr1基因敲除突變體表型分析

在PDA平板上培養(yǎng)36 h，fogpr1敲除突變體菌株（A1～A3）與野生型菌株B2形成的菌落形態(tài)相似（圖2-A）；菌絲均呈輻射狀向四周生長，沒有明顯差異（圖2-B）。在PDA平板上培養(yǎng)4 d，野生型菌落平均直徑（4.62 cm）與突變體菌株A1和A2菌落平均直徑相當(dāng)（4.61 cm和4.48 cm，圖2-C）。在PDA平板上培養(yǎng)7 d，A1和A2突變體菌株產(chǎn)孢量（20.1×106個(gè)和19.5×106個(gè)，圖2-D）與野生型菌株B2產(chǎn)孢量（20.0×106個(gè)）相當(dāng)。結(jié)果表明，敲除fogpr1基因沒有導(dǎo)致尖孢鐮刀菌的表型發(fā)生明顯變化。

2.3 fogpr1基因敲除突變體對巴西蕉的致病性

致病性測定結(jié)果顯示，接種fogpr1敲除突變體菌株A1和A2的巴西蕉植株平均病情指數(shù)（43.3和41.9，圖3）與野生型菌株B2的平均病情指數(shù)（45.2，圖3）相當(dāng)，而對照沒有發(fā)病。該結(jié)果表明敲除fogpr1基因不影響其對巴西蕉的致病性。

2.4 Fogpr1與G蛋白的互作分析

利用酵母雙雜系統(tǒng)分析Fogpr1蛋白與G蛋白的互作，結(jié)果顯示，所有共轉(zhuǎn)化誘餌載體和捕獲載體的酵母菌株在DDO+X-α-Gal的平板上可正常生長；而在QDO+AbA抗性平板上，共轉(zhuǎn)化pGADT7-53和pGADT7-T的正對照菌株菌落生長正常，可水解X-α-Gal產(chǎn)生藍(lán)色底物，但共轉(zhuǎn)化pGADT7-lam和pGADT7-T的負(fù)對照菌落不能生長，呈暗灰色，無藍(lán)色底物產(chǎn)生（圖4-A）；同時(shí)，共轉(zhuǎn)化pGADT7-Fogpr1-A與pGBKT7-Fga1、-Fga2和-Fgb1的酵母菌株可以正常生長，菌落呈白色，可產(chǎn)生藍(lán)色底物（圖4-B）；再者，共轉(zhuǎn)化pGADT7-Fogpr1-B與pGBKT7-Fga1、-Fga2和- Fgb1的酵母菌株可以正常生長，菌落呈白色，可產(chǎn)生藍(lán)色底物（圖4-C）。這些表明，F(xiàn)ogpr1蛋白胞內(nèi)肽段A和B與Fga1和Fgb1在酵母雙雜系統(tǒng)中存在互作，且與Fga2的互作最為明顯。

3 討論與結(jié)論

筆者用TMHMM軟件預(yù)測Fogpr1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明尖孢鐮刀菌Fogpr1蛋白具有典型G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)特征，包括7個(gè)跨膜區(qū)、4個(gè)胞外區(qū)和4個(gè)胞內(nèi)區(qū)，暗示fogpr1可能是一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體基因。基于蛋白氨基酸序列的聚類分析表明Fogpr1與已知功能的煙曲霉G蛋白偶聯(lián)受體GprC和GprD[9]在進(jìn)化關(guān)系上較為接近。為了分析fogpr1基因的功能，筆者構(gòu)建了fogpr1基因敲除突變體，并分析該突變體的表型，發(fā)現(xiàn)其在菌落形態(tài)、菌絲生長、產(chǎn)孢能力和致病力等方面均沒有發(fā)生明顯的變化，表明fogpr1基因可能不參與調(diào)控尖孢鐮刀菌生長、發(fā)育和致病力。該結(jié)果與Gehrke A等[9]報(bào)道的煙曲霉（A. fumigatus）假定G蛋白偶聯(lián)受體GprC和GprD的功能明顯不同。Gehrke A等研究發(fā)現(xiàn)敲除GprC和GprD導(dǎo)致突變體生長嚴(yán)重減緩，萌發(fā)率降低，在小鼠侵染模型中其致病力顯著下降，而且基因互補(bǔ)可以恢復(fù)為初始野生型表型[9]。這表明雖然Fogpr1與GprC和GprD在進(jìn)化關(guān)系上較為接近，但其在功能上并沒有相似性。再者，由于Fogpr1不具有Fga1[15]、Fga2[16]和Fgb1[17-18]蛋白的功能如調(diào)控尖孢鐮刀菌的菌絲分枝、細(xì)胞極性生長和致病力等，因此，推測Fogpr1可能與G蛋白不在一個(gè)信號傳導(dǎo)途徑上。

通過酵母雙雜系統(tǒng)分析其與G蛋白Fga1、Fga2和Fgb1的互作，筆者發(fā)現(xiàn)其胞內(nèi)區(qū)A和B均可以與G蛋白Fga1、Fga2和Fgb1的互作，表明Fogpr1可能是一個(gè)G蛋白互作的蛋白。由于煙曲霉GprC和GprD是否與G蛋白互作并無研究報(bào)道，因此無法得知。在新型隱球菌（C. neoformans）中，Xue C等[10]研究發(fā)現(xiàn)Gpr4可以與G蛋白α亞基Gpa1互作。Miwa A等[12]研究發(fā)現(xiàn)白色念球菌（C. albicans）的Gpr1的羧基端肽段可與G蛋白α亞基 Gpa2互作。這表明Fogpr1與新型隱球菌Gpr4和白色念球菌Gpr1相似，可以和G蛋白互作。因此Fogpr1可能是一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體。

綜上所述，根據(jù)fogpr1突變體的表型分析和酵母雙雜實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者推測Fogpr1可能是一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體，但其并不參與調(diào)控尖孢鐮刀菌的發(fā)育和致病性。至于該蛋白在尖孢鐮刀菌古巴?；椭惺欠窬哂衅渌δ苡写M(jìn)一步研究。該研究為進(jìn)一步鑒定G蛋白偶聯(lián)受體奠定了基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)