陳利平　陳平華　陳忠偉　王恒波　許莉萍　劉迪　高三基　郭晉隆　陳如凱

摘 要 甘蔗黃葉病和甘蔗花葉病是我國甘蔗最主要的病毒病，感病品種產(chǎn)量下降和品質(zhì)變劣，傳統(tǒng)方法難以防治。RNA干擾技術(shù)使培育抗病毒甘蔗品種成為可能。本研究根據(jù)甘蔗黃葉病毒和侵染甘蔗的高粱花葉病毒結(jié)構(gòu)與功能特性，廣泛收集不同來源病毒分離物CP基因序列，經(jīng)過比對選取保守序列作為干擾序列。通過在序列兩端添加酶切位點，合成并連接成雙價甘蔗黃葉病和花葉病毒干擾序列，然后構(gòu)建到中間載體pHANNIBAL上，形成雙價RNAi干擾結(jié)構(gòu)，最后插入到pART27上形成干擾表達載體。利用基因槍轟擊甘蔗品種福農(nóng)15號愈傷組織進行轉(zhuǎn)化，經(jīng)G418篩選獲得抗性再生植株。通過提取DNA和 RNA分析，證實雙價RNAi干擾結(jié)構(gòu)不僅以不同拷貝整合到甘蔗基因組中，而且得到了轉(zhuǎn)錄表達。

關(guān)鍵詞 甘蔗黃葉病毒；甘蔗花葉病毒；CP基因；雙價RNAi表達載體構(gòu)建；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號 S566.1 文獻標識碼 A

Abstract Diseases caused by Sugarcane mosaic virus（SCMV）and Sugarcane yellow leaf virus（SCYLV）are widespread virus diseases in the growth of sugarcane in China. Sugarcane varieties infected the viruses produce less tonnage and sugar potential. Conventional methods don't work to control the diseases. The RNA interference technology makes it possible to create antiviral sugarcane varieties by genetic engineering. Based on the viral structure and functional characteristics of SrMV and SCYLV， sequences of the coat protein CP genes were collected and conserved sequences were selected as the RNA interference sequences after alignment. The two RNAi fragments were combined by designing PCR primers with restriction enzyme sites and constructed into vector pHANNIBAL to form the binary ihpRNA antiviral structure. The structure was then inserted the expression vector pART27. The expression vector was transformed into the calli of sugarcane cultivar FN15 via gene gun bombardment. Sugarcane plants were regenerated from G418 screening media. The regenerated plants were detected in DNA and RNA levels， which verifying the binary ihpRNA antiviral structure was not only integrated into the host genome in copies， but also transcribed successfully.

Key words SCYLV；SCMV；CP gene；Construction of binary ihpRNA expression vector；Genetic transformation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.018

甘蔗是全世界最重要的糖料和能源作物[1]。甘蔗花葉病和黃葉病是甘蔗生產(chǎn)上最為普遍的兩種病毒病害[2-3]。我國的甘蔗花葉病多數(shù)情況下是由高粱花葉病毒（Sorghum moaic virus， SrMV）侵染引起[4]，主要破壞甘蔗葉綠體，對甘蔗產(chǎn)量和含糖量造成嚴重損失[5]，黃葉病不僅可造成甘蔗產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣，而且會引起種性退化，嚴重可導致減產(chǎn)40%～60%[6]?；瘜W防治對病毒病無效，防治方法主要是通過組織培養(yǎng)脫去甘蔗已經(jīng)感染的病毒，但缺點是還會重新感染[7]。由于甘蔗是高度雜合的異源多倍體植物，其遺傳背景非常復雜，加之抗病毒病甘蔗種質(zhì)匱乏[1]，通過雜交培育抗病品種異常困難。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，針對病毒病的RNA干擾技術(shù)為培育甘蔗抗病毒新品種指明了方向。如選取兩種病毒關(guān)鍵致病基因的保守序列，構(gòu)建成RNA干擾結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化甘蔗創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因品種，干擾病毒RNA轉(zhuǎn)錄，則可培育抗病毒病甘蔗新品種。高梁花葉病毒是甘蔗花葉病的病原病毒之一[4]，屬于馬鈴薯Y病毒屬[8]，其基因組為正單鏈RNA，約有10 000個核苷酸。甘蔗花葉病毒CP基因致病機理的研究較多，其表達產(chǎn)物不僅可以包被病毒核酸，還可以促進蚜傳、系統(tǒng)侵染等[9]。目前已經(jīng)有利用病毒CP基因保守序列構(gòu)建RNAi表達載體轉(zhuǎn)化作物研究[10]。甘蔗黃葉病毒屬于馬鈴薯卷葉病毒[11]，由蛋白質(zhì)外殼及其包裹著的一條約5 890 bp單鏈正義RNA（ssRNA）構(gòu)成[12]，有6個明確的ORF框，5′端非翻譯區(qū)（UTR）以ACAAAA保守序列開始，3′端無Poly（A）尾巴，其中ORF3編碼病毒外殼蛋白（CP），對病毒RNA轉(zhuǎn)錄和病毒外殼組裝起作用。已有利用甘蔗黃葉病毒CP基因保守序列構(gòu)建RNAi表達載體轉(zhuǎn)化煙草研究[13]。目前尚未有利用RNAi技術(shù)創(chuàng)制兼抗甘蔗花葉病和黃葉病甘蔗的研究報道。本研究擬在分析甘蔗花葉病毒和黃葉病毒分離物序列的基礎(chǔ)上，選取對病毒病致病起關(guān)鍵作用的CP基因，通過序列比對獲得保守序列，利用RNA干擾技術(shù)創(chuàng)制雙價抗花葉病和黃葉病聚合轉(zhuǎn)基因甘蔗新種質(zhì)，為甘蔗產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展提供核心技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物受體材料 用作轉(zhuǎn)基因的受體甘蔗品種福農(nóng)15號由福建農(nóng)林大學國家甘蔗工程技術(shù)中心選育、保存。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒 RNAi中間載體pHANNIBAL和表達載體pART27、大腸桿菌感受態(tài)DH5α、福州地區(qū)甘蔗分離物高粱花葉病毒CP蛋白基因序列SrMV-FZ由福建農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室提供。克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司。

1.1.3 試劑 甘蔗黃葉病毒CP基因保守序列由上海生物工程公司合成；限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit（D2500-02）、E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit（D6942-02）購自O(shè)MEGA公司；T4 DNA Ligase 和DNA分子量標準D15 000+2 000 DNA Marker（MD116）、100 bp DNA Ladder（MD109）購自天根生化科技（北京）有限公司；Biospin Plant Genomic DNA Extraction Kit（BSC13S1）購自杭州博日科技有限公司；SYBRR Select Master Mix購自ABI公司；TrizolR試劑購自invitrogen公司；Premix TaqTM（RR902A）和RNA kit ver.3.0試劑盒購自TaKaRa公司。

1.1.4 儀器 德國Eppendorf公司5331型PCR儀，美國ABI公司ABI7500型實時熒光定量PCR儀，美國伯樂公司Bio-Rad PDS-1000/He基因槍及其耗材。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗花葉病毒和黃葉病毒分離物序列比對與干擾序列獲得 通過登錄GenBank數(shù)據(jù)庫和查閱文獻，檢索甘蔗花葉病不同來源分離物SCMV的CP基因序列（以福州分離物高粱花葉病毒SrMV-FZ為參照）和甘蔗黃葉病毒不同來源分離物SCYLV的CP基因序列，利用BLAST方法對分離物進行同源比對，根據(jù)各病毒分離物CP基因共有的保守區(qū)域，選取適宜長度作為干擾序列，甘蔗花葉病毒CP基因干擾序列記為MCP，甘蔗黃葉病毒CP基因干擾序列記為YCP。根據(jù)質(zhì)粒載體pHANNIBAL插入位置兩側(cè)內(nèi)切酶位點和選取的保守序列設(shè)計引物，在MCP引物正義鏈的5′端分別引入ClaⅠ和EcoRⅠ酶切位點，反義鏈5′端引入XbaⅠ酶切位點；在YCP引物正義鏈5′端引入XbaⅠ位點，反義鏈5′端分別引入XhoⅠ和HindⅢ位點。MCP保守序列從本實驗室保存質(zhì)粒中克隆，YCP保守序列以及PCR引物由上海生物工程公司合成。

1.2.2 雙價正反序列ihpRNA的中間載體構(gòu)建

MCP和YCP用XbaⅠ酶切并回收，用T4 DNA Ligase連接形成雙價目的片段，經(jīng)PCR擴增合成雙價連接片段 MYCP，測序確認。然后克隆到pMD18-T，重組質(zhì)粒記為pT-MYCP，轉(zhuǎn)化DH5α。提取pT-MYCP和pHANNIBAL質(zhì)粒，用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收目的片段、連接，重組質(zhì)粒記為pHB-MYCP，轉(zhuǎn)化DH5α。提取質(zhì)粒，用ClaⅠ和Hind Ⅲ分別雙酶切pT-MYCP和pHB-MYCP，回收目的片段，連接形成含內(nèi)含子發(fā)夾結(jié)構(gòu)的中間載體pRNAi YCP-MCP-intron-MCP-MCP，記為pHB-MYCP-YMCP，轉(zhuǎn)化DH5α，酶切驗證。

1.2.3 RNAi表達載體構(gòu)建 對質(zhì)粒pHB-MYCP-YMCP和pART27分別用NotⅠ酶切，回收pHB-MYCP-YMCP的4 290 bp片段和pART27的11 667 bp片段，連接形成含內(nèi)含子發(fā)夾結(jié)構(gòu)ihpRNA表達載體，命名為pART27-MYCP，轉(zhuǎn)化DH5α，酶切鑒定。

1.2.4 遺傳轉(zhuǎn)化和抗性苗篩選 以甘蔗品種福農(nóng)15號愈傷組織為材料，按照陳平華等基因槍轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷組織的方法[14]，用構(gòu)建的雙價RNAi表達載體pART27-MYCP包被鎢粉，利用基因槍轟擊轉(zhuǎn)導愈傷組織。轟擊后的愈傷組織用含40 mg/L G418的MS分化培養(yǎng)基篩選，對抗性再生植株提取DNA并進行分子鑒定。其中，分化篩選培養(yǎng)基成分：MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.2 mg/L NAA +8.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+40 mg/L G418（pH 5.8）；生根培養(yǎng)基：MS+3 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+8.5 g/L 瓊脂+30 g/L 蔗糖（pH 5.8）。

1.2.5 抗性再生植株DNA的制備與目的序列PCR檢測 按照Biospin 植物基因組DNA提取試劑盒說明書提取福農(nóng)15號轉(zhuǎn)化抗性再生植株葉片DNA，測定DNA質(zhì)量并將其濃度調(diào)整到50 ng/μL。為防止假陽性結(jié)果，按照張卓等的方法[15]對福農(nóng)15號轉(zhuǎn)化抗性再生植株的DNA進行甘蔗內(nèi)源ALS基因的PCR檢測，如果出現(xiàn)目的條帶則說明DNA樣品質(zhì)量達到PCR反應(yīng)要求，可以作為模板進行目的序列的PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗花葉病毒和黃葉病毒分離物CP基因序列比對與干擾序列獲得

通過檢索Genbank數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻，對國內(nèi)外甘蔗花葉病毒已發(fā)布分離物的CP基因序列進行比對，所選序列Genbank登錄號分別為AY042184、AY149118、AF494510、AJ278405、AJ297628、NC004035、NC003398、AJ310198、smu57358，以本實驗室分離的福州地區(qū)分離物（本實驗室分離保存，未提交）的CP基因序列SrMV-FZ為參照。比對結(jié)果顯示，各分離物CP基因序列在8 900～9 500 bp同源性較高，達到85.3%，但中間穿插若干1～3 bp同源性低的小微片段，因序列保守性不是特別強，為提高對各病毒株系的干擾效果，選取了CP基因序列中8 960至9 382 bp之間、含多個同源性100%的區(qū)段、長度為423 bp的保守序列為甘蔗花葉病毒干擾序列MCP。

通過檢索Genbank數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻，收集了國內(nèi)外甘蔗黃葉病毒分離物22個，即bra-yl1、chn-yl1、per-yl1a、per-yl1b、reu-yl1a、reu-yl1b、reu-yl2、scylv-a、scylv-c3、scylv -chn1、scylv-cub2、scylv-f、scylv-fj1、scylv-fj2、scylv-fj3、scylv-gd1、scylv-gd2、scylv-gx1、scylv-gx2、scylv-in、scylv-yn1、scylv-yn2，序列比對結(jié)果顯示，不同來源甘蔗黃葉病毒分離物CP基因序列同源性極高，在180～400 bp同源性高達94.8%，同源小微片段很少且長度不超過2 bp。根據(jù)比對結(jié)果，以本地分離物ScYLV-fj1序列為參照，選取CP基因序列中180至409 bp之間高度保守的230 bp為甘蔗黃葉病毒干擾序列YCP。

根據(jù)選取的保守序列和質(zhì)粒載體插入?yún)^(qū)域兩側(cè)內(nèi)切酶位點，利用軟件Primer 5.0設(shè)計兩種病毒CP基因干擾序列MCP和YCP克隆引物如下：

連接產(chǎn)物克隆到pMD18-T，經(jīng)轉(zhuǎn)化DH5α，提取質(zhì)粒，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定，獲得3 377 bp的pT-MYCP。

2.3 雙價目的片段RNAi表達載體構(gòu)建過程

pT-MYCP和pHANNIBAL質(zhì)粒經(jīng)過XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收pT-MYCP小片段與質(zhì)粒pHANNIBAL大片段，連接形成中間載體pHB-MYCP。再對pHB-MYCP和pT-MYCP分別同時進行ClaⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，回收pT-MYCP小片段和pHB-MYCP大片段，連接形成含有雙價目的片段正反方向序列的中間載體pHB-MYCP-YMCP。最后對pHB-MYCP-YMCP和pART27用NotⅠ酶切，回收大片段，連接形成RNAi表達載體pART27-MYCP，總長度15 957 bp，用可以同時鑒別目的序列和供體質(zhì)粒pART27的NotⅠ和SalⅠ酶切消化，預期可以產(chǎn)生4個條帶，SalⅠ（Ⅰ）至Lac Z 多克隆位點上NotⅠ（978）之間長度為978 bp，兩個NotⅠ中間插入的目的 RNAi 序列長度4 290 bp，第2個NotⅠ（5 268）與SalⅠ（7 954）位點間片段長度為2 686 bp，剩余片段長8 003 bp。質(zhì)粒圖譜和酶切電泳結(jié)果見圖2，與預期一致，載體構(gòu)建成功。

2.4 基因槍轟擊轉(zhuǎn)化及抗性苗再生與PCR檢測

通過基因槍轟擊和抗性篩選，獲得了161株再生苗，見圖3。

對提取的抗性植株DNA進行內(nèi)參基因ALS檢測。取能夠擴增出171 bp特異性片段（對照正常）的抗性植株DNA，用正、反向檢測引物MYf和MYr進行干擾序列PCR檢測。隨機抽取其中20株檢測結(jié)果見圖4（相同編號為同一植株），可以看出，20株抗性植株檢測到正、反向干擾序列的植株各有3株（圖4-A中泳道6，11，15，圖4-B中泳道6，15，16），同時轉(zhuǎn)入正反向雙價抗病干擾序列的植株有2株（圖4-A和圖4-B中泳道6和15），說明已經(jīng)將雙價抗病干擾序列轉(zhuǎn)入部分甘蔗植株中。

2.5 PCR陽性植株拷貝數(shù)測定

取5株具有完整正、反向干擾序列的轉(zhuǎn)基因植株（命名為MYCP1、MYCP2、MYCP3、MYCP4、MYCP5），依據(jù)用質(zhì)粒建立的標準曲線方程，將各樣品的Ct值代入計算出相應(yīng)的拷貝數(shù)。由于甘蔗基因組比較復雜，80%的甘蔗高貴種的基因組大小在7 500×106～8 500×106 bp之間[17]，因此取甘蔗基因組平均值7 740×106 bp，則由拷貝數(shù)/2×{[6.02×1023×10-9×100/（7 740×106×660）]}得出各個樣品中MYCP干擾序列在甘蔗單個細胞基因組的拷貝數(shù)見表1。

通過標準差分析數(shù)據(jù)（保留小數(shù)點后2位），獲得各個轉(zhuǎn)基因樣品 MYCP干擾序列的拷貝數(shù)依次為 MYCP1 3.77±1.04，MYCP2 3.15±1.29，MYCP3 5.93±1.27，MYCP4 4.29±0.78，MYCP5 3.64±1.03?？梢?，5個轉(zhuǎn)基因植株MYCP的拷貝數(shù)范圍在2～7之間。

2.6 轉(zhuǎn)基因陽性植株干擾序列的表達分析

利用實時熒光定量RT-PCR對上述5株轉(zhuǎn)基因植株的MYCP干擾序列的表達量進行分析，以25SrRNA為內(nèi)參基因，非轉(zhuǎn)基因福農(nóng)15號為陰性對照，結(jié)果如圖5。

從圖5中的表達量中可以看出，所選的5株轉(zhuǎn)基因植株的MYCP干擾序列都進行了轉(zhuǎn)錄表達，但不同植株表達量存在差異，其中MYCP5的表達量比其它植株都高，而其干擾序列的拷貝數(shù)并不是最高，可見，MYCP干擾序列表達量與拷貝數(shù)沒有直接關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

入選病毒分離物的代表性。本研究隨機選取不同來源的甘蔗花葉病與黃葉病分離物，既有國外，也有國內(nèi)不同地域，比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同來源的病毒分離物CP基因序列均存在不同程度的同源性，只是不同區(qū)段的同源性程度有差異。說明病毒在進化過程中盡管在不同地域發(fā)生了變異，形成了不同株系，但病毒的基本結(jié)構(gòu)相似，這也解釋了為什么同類病毒盡管有多種不同株系，但其病征和癥狀大體相同的原因。因不同來源的病毒分離物CP基因序列均有同源性，通過選取同源性較高的區(qū)段就有可能獲得廣譜的干擾效果。

植物干擾片段大小選擇。經(jīng)典的RNAi理論中，起干擾作用的RNAi片段較短，一般只有幾十個bp[18]，但在植物上RNAi靶基因片段長度一般可以達到幾百個bp，相對容易操作成功[19]。較長的保守序列含有較多同源位點，通過轉(zhuǎn)化，有可能使受體作物同時獲得沉默一族病毒基因表達的優(yōu)良轉(zhuǎn)基因甘蔗材料。保守序列是病毒長期進化或變異中保留下來的相對穩(wěn)定的遺傳組成，可以經(jīng)受時間的考驗，有可能較長期地保持對同族多種病毒的抗病性。

轉(zhuǎn)基因植株分子檢測。一般情況，轉(zhuǎn)基因植物的分子鑒定應(yīng)該有Southern blot檢測和蛋白表達方面的內(nèi)容?？赡苡捎诟蓴_片段較短、拷貝數(shù)較低以及甘蔗基因組較大等原因，Southern blot檢測結(jié)果不理想，因此選用定量分析的方法檢測出各轉(zhuǎn)基因植株目的序列的拷貝數(shù)，RNA檢測結(jié)果進一步表明干擾序列在轉(zhuǎn)錄水平進行了表達，證明干擾序列已成功整合入甘蔗基因組中。蛋白表達方面，RNAi抗病原理是在轉(zhuǎn)錄水平起作用，在病毒侵染轉(zhuǎn)基因作物后，干擾序列產(chǎn)生與病毒RNA同源的雙鏈RNA片段，使病毒mRNA發(fā)生降解而導致相應(yīng)基因表達沉默，其干擾功能在RNA水平發(fā)揮，而不是依靠產(chǎn)生的蛋白起作用；加之，干擾序列只是DNA片段，不是基因，因此，沒有進行蛋白表達分析。

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責任編輯：凌青根