劉福平　陳淳　林志楷

摘 要 為了解抗氧化劑減緩長(zhǎng)期繼代蝴蝶蘭類原球莖衰老的機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)基添加抗氧化劑100 mg/L半胱氨酸和8 g/L甘露醇繼代類原球莖24個(gè)月，分析其相關(guān)氧化指標(biāo)及DNA穩(wěn)定性。結(jié)果表明，類原球莖培養(yǎng)期間處理組總活性氧水平變化趨勢(shì)與對(duì)照組不同，處理組比對(duì)照組低，對(duì)照組總活性氧水平消長(zhǎng)趨勢(shì)與超氧陰離子（O2·- ）生成速率較為一致，處理組則與羥自由基（·OH）相對(duì)含量的消長(zhǎng)趨勢(shì)較一致。繼代期間丙二醛含量變化趨勢(shì)與總活性氧水平變化趨勢(shì)相似，處理組比對(duì)照組低。類原球莖DNA的SRAP分析結(jié)果表明，繼代培養(yǎng)期間處理組與對(duì)照組間均未發(fā)生明顯的DNA差異。類原球莖DNA甲基化程度變化趨勢(shì)與總活性氧水平變化大體相同，中后期處理組比對(duì)照組低。

關(guān)鍵詞 蝴蝶蘭；類原球莖；長(zhǎng)期繼代；抗氧化劑；氧化指標(biāo)；DNA穩(wěn)定性

中圖分類號(hào) S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To understand the mechanism that antioxidants slowed down the aging of Phalaenopsis PLB through long-term subculture， PLB were subcultured for 24 months in the culture supplemented with antioxidants（100 mg/L cysteine and 8 g/L mannitol）， and the related oxidant indexes and DNA stability of PLB were analyzed in the experiment. The results showed that during subculturing of PLB the variation tendency of levels of total reactive oxygen species（T-ROS）was not consistent between the control and the treatment. The T-ROS levels of the treatment were lower than that of the control. During PLB subculturing， the variation tendency of the levels of T-ROS in the control was consistent with that of the growth rate of superoxide anion（O2·- ）， but it accorded with the relative quantity of hydroxyl radical（·OH）in the treatment. The changes of malondialdehyde content were generally consistent with the levels of T-ROS during subculturing， the contents were lower in the treatment than that in the control. The result of SRAP analysis on genome DNA indicated the polymorphic difference did not show clearly in the PLB throughout subculturing， as well as between the control and the treatment. The variation tendencies of levels of DNA methylation of PLB and the levels of T-ROS were about the same. However， the levels in the treatment were lower than that in the control at middle-late stage.

Key words Phalaenopsis spp.； PLB； Long-term subculture； Antioxidants；Oxidant index；DNA stability

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.015

植物組培的中間繁殖體（愈傷組織等）隨著繼代培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，其增殖、分化能力逐漸降低已有許多報(bào)道[1]。類原球莖（PLB）是蘭科植物組培的主要中間繁殖體，其長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)的研究已有少量報(bào)道，如采用無激素培養(yǎng)基有利于蝴蝶蘭（Phalaenopsis spp.）某些品種類原球莖長(zhǎng)期繼代，其分化的植株表觀性狀穩(wěn)定[2-3]，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基激素及糖濃度有利于長(zhǎng)期繼代的春石斛類原球莖增殖和生根[4]，長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)物的變異近年來主要采用分子標(biāo)記檢測(cè)，如春蘭克隆繁殖苗[5]，鐵皮石斛叢芽擴(kuò)繁的分生苗[6]、霍山石斛愈傷組織[7]、霍山石斛類原球莖[8]等。

筆者以常規(guī)方法繼代培養(yǎng)蝴蝶蘭類原球莖24個(gè)月，增殖和分化能力有所降低，在培養(yǎng)基添加100 mg/L半胱氨酸與8 g/L甘露醇組合的抗氧化劑處理，雖然繼代培養(yǎng)后增殖和分化能力也有所降低，但比對(duì)照（常規(guī)培養(yǎng)基）類原球莖增殖能力顯著提高，萌發(fā)率極顯著提高。關(guān)于植物組培中長(zhǎng)期繼代中間繁殖體的衰老或退化現(xiàn)象，普遍認(rèn)為是活性氧自由基致酶失活，影響生理代謝，啟動(dòng)膜脂過氧化連鎖反應(yīng)、破壞核酸結(jié)構(gòu)等所致[9-10]，即自由基在植物生理衰老和遺傳變異上均有重要的效應(yīng)。筆者研究在培養(yǎng)基添加抗氧化劑長(zhǎng)期繼代蝴蝶蘭類原球莖的相關(guān)氧化指標(biāo)和DNA穩(wěn)定性變化，以初步了解抗氧化劑減輕類原球莖衰老的生理及分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

蝴蝶蘭瓶苗（YZ45）由福建省亞熱帶植物研究所組培室提供。以嫩葉切塊為外植體，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 8 mg/L+CW（椰子汁）20%（V/V）+ 蔗糖2%（W/V），誘導(dǎo)出的PLB轉(zhuǎn)接到1/2MS+6-BA 3 mg/L+CW 20%（V/V）+蔗糖2%（W/V）培養(yǎng)基擴(kuò)繁，獲得大量PLB作為實(shí)驗(yàn)材料。培養(yǎng)條件均為光照1 500 lx，12 h/d，溫度24～26 ℃。

1.2 方法

1.2.1 類原球莖長(zhǎng)期繼代方法 將PLB接種于繼代培養(yǎng)基1/2MS+CW 20%（V/V）+蔗糖2%（W/V），每瓶鮮重3.00 g，培養(yǎng)2個(gè)月，隨機(jī)取9瓶稱量每瓶PLB鮮重，作為增殖能力指標(biāo)。將PLB團(tuán)剝離出中等大小單粒PLB，接種到分化培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 3 mg/L+CW 20%（V/V）+NAA 0.5 mg/L+蔗糖2%（W/V），每瓶接種10粒，培養(yǎng)2個(gè)月（以上培養(yǎng)條件均同1.1），隨機(jī)取9瓶觀測(cè)顏色變化，PLB存活率為仍呈綠色的PLB數(shù)/總PLB數(shù)×100%，分化率為出芽長(zhǎng)根PLB數(shù)/總PLB數(shù)×100%。

PLB長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)方法，對(duì)照組為上述繼代培養(yǎng)基配方，處理組為對(duì)照組培養(yǎng)基添加抗氧化劑半胱氨酸100 mg/L培養(yǎng)基和甘露醇8 g/L培養(yǎng)基。每瓶接種PLB起始鮮重3.00 g，每 2 個(gè)月繼代分瓶1次。在培養(yǎng)的第8、16、24個(gè)月，檢驗(yàn)PLB增殖能力，方法為每處理取PLB鮮重3.00 g接種于繼代基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)2個(gè)月（以上培養(yǎng)條件均同1.1）每處理隨機(jī)取9瓶觀測(cè)每瓶PLB鮮重，PLB成活率和分化率觀測(cè)計(jì)算方法同上。

取培養(yǎng)的第0、8、16、24個(gè)月PLB進(jìn)行生理生化指標(biāo)、DNA穩(wěn)定性分析。

1.2.2 生理指標(biāo)分析

（1）總活性氧（T-ROS）水平。ELISA檢測(cè)試劑盒由上海博舜生物科技有限公司提供，取0.5 g鮮PLB于500 μL生理鹽水研磨，其他按說明書操作，450 nm處測(cè)吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線y=771.3x-41.21（R2=0.991），活性氧水平以U/mL表示。

（2）羥自由基（·OH）相對(duì)含量。按劉福平等[11]介紹的方法。以單位時(shí)間每克鮮重在420 nm處的吸光度變化為單位， 即ΔA420/（min·g FW）。

（3）超氧陰離子（O2·- ）生成速率。參照湯章成[12]的方法，同時(shí)做NO2-標(biāo)準(zhǔn)曲線，得y= 48.539 1x+1.170 3（R2=0.998 2），結(jié)果以μmol/（min·g FW）表示。

（4）過氧化氫（H2O2）含量。按宋松泉等[13]及沈文飚等[14]介紹的方法， 同時(shí)做H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線，得y=1 426.5x+0.357 2（R2=0.996），結(jié)果以μmol/g FW 表示。

（5）丙二醛（MDA）含量。按湯章成的方法[12]，結(jié)果以μmol/g FW表示。

1.2.3 DNA變異分析

（1）SRAP（相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）檢測(cè)。取蝴蝶蘭瓶苗嫩葉及繼代培養(yǎng)第0、8、16、24個(gè)月的PLB進(jìn)行SRAP檢測(cè)。DNA提取采用CTAB法，純度、濃度檢測(cè)以A260和A280檢測(cè)吸光度法和瓊脂糖凝膠電泳法。按照Li和Quiros[15]的SRAP引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物。SRAP-PCR體系（25 μL）包括模板DNA 40 ng、Mg2+ 2.0 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq酶1 U。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 1 min，50 ℃1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳及成像。

（2）DNA胞嘧啶甲基化水平。以培養(yǎng)第0、8、16、24個(gè)月的PLB為材料。DNA提取、水解、高效液相色譜參照劉福平等[16]介紹的方法。樣品在25 ℃下注入HPLC（Waters2695）的Hypersil BDS C18柱（200 mm×4.0 mm，5μm）（大連伊利特分析儀器有限公司提供）分離， 柱溫25 ℃。流動(dòng)相由甲醇、戊烷磺酸鈉（10 mmol/L）、三乙胺按體積比3 ∶ 90 ∶ 0.2配成，pH4.0，流速1.0 mL/min。胞嘧啶（C）及5-甲基胞嘧啶（5 mC）購(gòu)自SIGMA公司，檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm，分別取胞嘧啶和甲基胞嘧啶系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（S）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣量（摩爾數(shù)，M）作回歸方程，胞嘧啶回歸方程為MC=3.054×10-10×SC-1.598×10-5，R2=0.999 6，甲基胞嘧啶回歸方程M5 mC=5.684×10-10×S5 mC+2.973×10-5，R2=0.999 7。根據(jù)PLB樣品DNA水解產(chǎn)物中C和5 mC的洗脫峰面積，計(jì)算樣品中C和5 mC的摩爾數(shù)，DNA甲基化水平=5 mC/（C+5 mC）×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)照組、處理組分別在不同培養(yǎng)時(shí)間觀測(cè)數(shù)據(jù)的組間差異顯著性比較按Dunnett最小顯著差數(shù)（DLSD）測(cè)驗(yàn)法。同一培養(yǎng)時(shí)間的對(duì)照組與處理組間差異顯著性比較采用t檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化劑對(duì)長(zhǎng)期繼代類原球莖氧化指標(biāo)的效應(yīng)

培養(yǎng)基添加抗氧化劑繼代培養(yǎng)蝴蝶蘭PLB 24個(gè)月，總活性氧、羥自由基（·OH）相對(duì)含量、超氧陰離子（O2·- ）生成速率、過氧化氫（H2O2）含量和丙二醛（MDA）含量變化見表1。

2.1.1 總活性氧（T-ROS）水平變化 培養(yǎng)起始（0個(gè)月）PLB的總活性氧水平67.62 U/mL，培養(yǎng)第8個(gè)月，對(duì)照組顯著提高，處理組極顯著降低，隨后兩組都隨繼代培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)升高，都達(dá)極顯著水平。培養(yǎng)期間3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，處理組總活性氧水平均較對(duì)照組極顯著降低。

2.1.2 羥自由基（·OH）相對(duì)含量變化 培養(yǎng)起始（0個(gè)月）PLB的·OH相對(duì)含量0.503 ΔA420/（min·g FW），培養(yǎng)第8個(gè)月，對(duì)照組變化不明顯，處理組顯著降低，隨后兩組都隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而升高，第16個(gè)月，都顯著升高，第24個(gè)月都極顯著升高。處理組和對(duì)照組比較，培養(yǎng)第8個(gè)月，處理組較對(duì)照顯著降低，第16個(gè)月差異不顯著，第24個(gè)月較對(duì)照組極顯著降低。

2.1.3 超氧陰離子（O2·- ）生成速率變化 培養(yǎng)起始（0個(gè)月）PLB的O2·- 生成速率1.593 μmol/（min·g FW），培養(yǎng)第8個(gè)月，對(duì)照組顯著提高、處理組沒顯著變化，隨后都隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)升高，第16、24個(gè)月，兩組都較初代極顯著升高。培養(yǎng)第8個(gè)月處理組較對(duì)照顯著降低，第16個(gè)月極顯著降低，第24個(gè)月差異不顯著。

2.1.4 過氧化氫（H2O2）含量變化 培養(yǎng)起始（0個(gè)月）PLB的H2O2含量為134.7 μmol/g FW，培養(yǎng)第8個(gè)月，對(duì)照組H2O2含量沒顯著差異，處理組顯著降低，第16個(gè)月兩組都極顯著升高，第24個(gè)月對(duì)照組仍極顯著升高，處理組有所回落，但仍較初代顯著升高。培養(yǎng)第8個(gè)月，處理組較對(duì)照極顯著降低，第16個(gè)月顯著升高，第24個(gè)月顯著降低。

2.1.5 丙二醛含量變化 培養(yǎng)起始（0個(gè)月）PLB的丙二醛含量為1.203 μmol/g FW，培養(yǎng)第8個(gè)月，對(duì)照組、處理組均沒明顯變化，第16個(gè)月對(duì)照組極顯著升高，處理組顯著升高，第24個(gè)月都極顯著升高。處理組和對(duì)照組比較，培養(yǎng)第8、16個(gè)月，處理組均較對(duì)照顯著降低，第24個(gè)月則極顯著降低。

從上所述可以看出，在整個(gè)培養(yǎng)期間，對(duì)照組總活性氧水平消長(zhǎng)趨勢(shì)與O2·- 生成速率都隨培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)而升高，趨勢(shì)相對(duì)較為一致，處理組總活性氧水平先抑后揚(yáng)，與·OH相對(duì)含量消長(zhǎng)趨勢(shì)較為一致。對(duì)照組丙二醛含量隨培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)而升高，與總活性氧水平變化趨勢(shì)較一致，處理組丙二醛含量與總活性氧水平都是先抑后揚(yáng)（但丙二醛含量在第8個(gè)月的降低沒有達(dá)到顯著水平），大體上較為協(xié)同。

2.2 抗氧化劑對(duì)長(zhǎng)期繼代類原球莖的DNA變異的效應(yīng)

2.2.1 DNA的SRAP分析 SRAP-PCR 擴(kuò)增結(jié)果見圖1。1號(hào)為用于誘導(dǎo)PLB的瓶苗葉片，2號(hào)為培養(yǎng)初始的PLB，3～5號(hào)為對(duì)照組分別在8、16、24個(gè)月PLB，6～8號(hào)為處理組分別在8、16、24個(gè)月PLB。所有樣品擴(kuò)增條帶大小在50～1 000 bp之間，擴(kuò)增條數(shù)在2～6條之間，各樣品間呈現(xiàn)一定的多態(tài)性。1號(hào)葉子PCR結(jié)果明顯與2～8號(hào)PLB不同，其中有4條帶都與其他樣品不同，多態(tài)性差異明顯，說明從葉子誘導(dǎo)出PLB就有DNA水平變異。2～8號(hào)條帶相近，說明繼代培養(yǎng)期間PLB并未發(fā)生明顯的DNA差異，培養(yǎng)基添加抗氧化劑與對(duì)照PLB也并未發(fā)生明顯的DNA差異。

2.2.2 DNA甲基化水平分析 培養(yǎng)基添加抗氧化劑長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)PLB期間DNA胞嘧啶甲基化程度變化見表2。從表2可以看出， 培養(yǎng)起始PLB的DNA甲基化程度為17.7%，對(duì)照組和處理組在第8個(gè)月都沒顯著變化，隨著繼代培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，DNA甲基化程度逐漸提高，都達(dá)極顯著水平。處理組、對(duì)照組甲基化程度在第8個(gè)月差異不顯著，在第16個(gè)月處理組極顯著降低，第24個(gè)月顯著降低。

3 討論與結(jié)論

自由基在生理衰老和遺傳變異上均有重要的效應(yīng)[9-10]，本實(shí)驗(yàn)繼代培養(yǎng)蝴蝶蘭PLB，添加抗氧化劑處理組、對(duì)照組總活性氧水平都有所提高，處理組與同時(shí)點(diǎn)的對(duì)照相比都較低，即半胱氨酸與甘露醇復(fù)合抗氧化劑能降低PLB總活性氧水平。整個(gè)培養(yǎng)期間總活性氧水平變化趨勢(shì)與主要活性氧指標(biāo)之間的關(guān)系，對(duì)照組總活性氧與O2·- 消長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)較為一致，推測(cè)O2·- 是總活性氧水平變化的主要影響因素，處理組·OH消長(zhǎng)趨勢(shì)與總活性氧相對(duì)較為一致，·OH可能是主要影響因素，主要影響因素不同，可能因處理組在培養(yǎng)基添加抗氧化劑所致。膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛干擾細(xì)胞代謝活動(dòng)，破壞生物膜結(jié)構(gòu)，李仲芳等[17]在連續(xù)繼代培養(yǎng)鵝掌楸叢生芽中，O2·- 和丙二醛含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)PLB繼代培養(yǎng)期間，對(duì)照組、處理組丙二醛含量變化趨勢(shì)都與總活性氧變化相似，處理組丙二醛含量較同時(shí)期的對(duì)照組低，說明抗氧化劑對(duì)降低PLB丙二醛含量有一定的效果。

PLB的SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果，葉子PCR結(jié)果與所有PLB多態(tài)性明顯， 說明從葉子誘導(dǎo)出PLB就有DNA水平變異。所有PLB擴(kuò)增條帶相近，說明繼代培養(yǎng)期間PLB并未發(fā)生明顯的DNA差異，培養(yǎng)基抗氧化劑也并未導(dǎo)致明顯的DNA差異。長(zhǎng)期繼代的組培無性系在分子水平無明顯變異已有一些報(bào)道，葉藝春蘭克隆繁殖的第9代到第20代組培苗DNA分析未見明顯差異[5]，鐵皮石斛的7代無性繁殖苗，第4代之后代間僅有部分引物RAPD帶型發(fā)生甚微變化[6]，從繼代18次霍山石斛PLB分化的幼苗RAPD分析，不同代PLB的幼苗之間、長(zhǎng)期繼代與供體母株之間均沒有顯著遺傳變異[8]，其他如長(zhǎng)期繼代再生能力喪失的紐荷爾臍橙愈傷組織[18]，長(zhǎng)期繼代蛇麻草愈傷組織再生苗[19]，繼代5次的滇黃芩組培苗[20]都沒檢出明顯帶型差異。

在植物離體培養(yǎng)過程中，遺傳和表觀遺傳變異都可能是引起長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)材料喪失分化能力的一個(gè)重要原因[1，21]，有報(bào)道DNA甲基化水平隨著繼代代數(shù)和時(shí)間的增加而增加[18，22，23]，本實(shí)驗(yàn)的PLB在培養(yǎng)的第16、24個(gè)月，處理組、對(duì)照組的DNA甲基化水平都較初代提高，但對(duì)照組或處理組的SRAP檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)明顯變異，上述的紐荷爾臍橙、蛇麻草事例中，采用分子標(biāo)記均未檢測(cè)出多態(tài)性條帶，紐荷爾臍橙愈傷組織胚狀體再生能力喪失，作者認(rèn)為可能是相關(guān)基因發(fā)生甲基化修飾造成的[18]，蛇麻草也檢測(cè)出了甲基化變化，認(rèn)為這種變化是逐漸形成[19]。

氧化脅迫（活性氧）誘發(fā)DNA甲基化程度提高或降低各有報(bào)道[24]，本實(shí)驗(yàn)不管是對(duì)照組還是處理組，在繼代培養(yǎng)中后期，PLB的DNA甲基化程度提高，與總活性氧水平逐漸提高大體對(duì)應(yīng)，至于添加抗氧化劑（含半胱氨酸和甘露醇）處理組DNA甲基化程度較對(duì)照組低，杜亞瓊等[25]報(bào)道50 mmol/L甘露醇對(duì)擬南芥種子萌發(fā)率、幼苗生長(zhǎng)幾乎沒影響，基因組DNA甲基化水平均低于對(duì)照，有報(bào)道葫蘆巴堿、甜菜堿和膽堿[26]、茶多酚類[27]具有去甲基化效應(yīng)，而它們都具較強(qiáng)抗氧化性，所以，本實(shí)驗(yàn)中抗氧化劑可能與PLB的DNA甲基化程度降低有關(guān)。

活性氧自由基在植物生理衰老和遺傳變異上均有重要的效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)的生理指標(biāo)方面，抗氧化劑使繼代培養(yǎng)類原球莖總活性氧水平降低，從而丙二醛含量也降低，減輕了丙二醛對(duì)細(xì)胞生理毒害，有利于減輕繼代蝴蝶蘭類原球莖增殖、分化能力下降。類原球莖DNA穩(wěn)定性分析未發(fā)現(xiàn)明顯多態(tài)性，即核苷酸序列并沒有檢出變異，處理組DNA甲基化程度較對(duì)照組低，可能也是抗氧化劑減輕長(zhǎng)期繼代蝴蝶蘭類原球莖增殖、分化能力下降的原因之一。本研究結(jié)果為克服長(zhǎng)期繼代蝴蝶蘭類原球莖應(yīng)用上存在障礙的研究提供借鑒，也為利用化學(xué)調(diào)控解決或緩解植物培養(yǎng)物長(zhǎng)期繼代的衰老研究提供基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)