潘敏　王萌　李曉娜　楊葉　鄭服叢　張宇　朱朝華

摘 要 以橡膠樹品系CATAS7-33-97的芽接苗為材料，研究草甘膦對其葉片形態(tài)和生理活性的影響。結(jié)果表明：噴施草甘膦導(dǎo)致橡膠樹葉片脫落后，引起整蓬新生葉片變長、扭曲。該蓬新生葉片穩(wěn)定后，下一蓬新生葉片形狀會(huì)部分恢復(fù)。葉片畸形與含水量變化無關(guān)，但會(huì)導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)變化、過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性增加13%～40%、可溶性糖含量下降47%～81%和脯氨酸含量上升15%～389%。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；草甘膦；形態(tài)；生理指標(biāo)

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Glyphosate， a nonselective herbicide， can damage plants when inappropriate used. In this study， for the first time with rubber tree clone CATAS7-33-97 grafting seedlings as materials， we studied the effects of glyphosate on the leaf morphology and physiological indices of rubber tree. Results showed that the glyphosate caused rubber tree leaf fall， new-grown leaves twist and longer leaves. After these change stabilized， the new-grown leaves would be normal. The leaf doformity had nothing to do with water content， but could result in the change of chloroplast structure， increase peroxidase and superoxide dismutase enzyme activities from 13%-40%， cut down the content of soluble sugar from 47%-81% and increase proline content from 15%-389%.

Key words Hevea brasiliensis Müll. Arg.； Glyphosate； Morphology； Physiological indices

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.011

草甘膦（Glyphosate）是1971年由Monsanto公司開發(fā)的廣譜除草劑，抑制植物莽草酸合酶活性[1]。草甘膦是世界上應(yīng)用最廣、使用量最大的農(nóng)藥品種，大量用于農(nóng)田各種雜草的防除，也可用于非農(nóng)田雜草的治理，如園林、苗圃、鐵路、公路、森林、湖泊等[2]。為全面了解草甘膦在環(huán)境中的毒性以便及時(shí)對可能的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行管理，國內(nèi)外學(xué)者系統(tǒng)研究了草甘膦對大豆根瘤菌[3-4]、水生生物、微生物[5]、魚類[6]、土壤[7]、蚯蚓[8]和人類[9]的危害。研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦會(huì)引起棉花花藥中植物激素和游離氨基酸的含量變化[10]。半致死量的草甘膦會(huì)導(dǎo)致油菜花變型和雄性不育[11]，會(huì)影響大豆的種子成份[4]和根瘤菌的微生物構(gòu)成[3]。因此，研究草甘膦藥害機(jī)制和研發(fā)抗草甘膦作物品種是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的熱點(diǎn)[12]。

橡膠樹在育苗過程中，需要對苗床的雜草進(jìn)行清除。在此過程中，少量的草甘膦會(huì)沾染橡膠樹葉片，導(dǎo)致藥害的產(chǎn)生。通常，葉片扭曲會(huì)導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)、活性氧合成、代謝和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化[13-15]，并與生長素含量變化有關(guān)[16]。筆者推測，草甘膦藥害會(huì)導(dǎo)致橡膠樹葉片生理活性的變化。為了證明這一假設(shè)，筆者采用橡膠樹CATAS7-33-97芽接苗為材料，對草甘膦處理后不同長度的葉片表型和生理活性進(jìn)行測定，旨在闡明橡膠樹草甘膦藥害的生理機(jī)制，并為研究橡膠樹對草甘膦的抗藥機(jī)制和技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所培育的橡膠樹品種熱研7-33-97芽接苗為研究材料，芽接苗種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所實(shí)驗(yàn)基地草炭土與粘土比例為3 ∶ 1的育苗袋中。

1.2 方法

1.2.1 草甘膦噴施 采用浙江綠野農(nóng)化生物科技有限公司41%草甘膦水劑稀釋成1 ∶ 2 400，V ∶ V溶液噴施熱研7-33-97芽接苗第二蓬葉后，每批處理6株，每株取葉柄中間的一片葉片進(jìn)行分析。待測葉片分為正常葉（以正常葉為對照葉片）、畸形葉（按照葉片長度細(xì)分為7～10 cm、10～20 cm、20～30 cm和30 cm以上4個(gè)級別）和新生的恢復(fù)葉共6個(gè)類型。

1.2.2 生理指標(biāo)測定 葉片葉綠素含量和相對含水量的測定參照文獻(xiàn)[17]的方法。含水量、游離脯氨酸、可溶性糖含量、超氧化物歧化酶（SOD）酶活性和過氧化物酶（POD）含量的測定參照文獻(xiàn)[18]的方法。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)測定為3批次重復(fù)。采用IBM-SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較分析，采用OriginPro 9.2軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦對橡膠樹芽接苗葉片形態(tài)的影響

從圖1可以看出，在橡膠樹幼苗苗床中噴施草甘膦除草劑之后，7～10 d后會(huì)導(dǎo)致橡膠樹幼苗葉片脫落。葉片脫落7～10 d后，落葉的枝條會(huì)長出新的變形并扭曲的葉片，長度7 cm以上，最長可達(dá)35 cm以上，遠(yuǎn)高于正常葉片（圖1-A）。第二蓬畸形葉到穩(wěn)定期后，新生的第三蓬葉葉片形狀會(huì)有所恢復(fù)，但仍比正常葉片長（圖1-B）。這說明草甘膦會(huì)導(dǎo)致橡膠樹幼苗葉片產(chǎn)生特異表型。

2.2 草甘膦對橡膠樹芽接苗不同類型葉片生理活性的影響

2.2.1 草甘膦對橡膠樹芽接苗葉片含水量的影響

由于葉片扭曲通常與葉片失水有關(guān)，筆者測定了6種葉片含水量變化規(guī)律。從圖2可以看出，在橡膠樹幼苗苗床中噴施草甘膦除草劑之后，正常葉、7～10 cm、10～20 cm、20～30 cm和30 cm以上4個(gè)級別畸形葉和恢復(fù)葉的含水量分別為69.49%、68.54%、62.28%、63.51%、63.27%、62.18%。正常葉、7～10 cm、10～20 cm、20～30 cm和30 cm以上4個(gè)級別畸形葉和恢復(fù)葉的相對含水量分別為92.68%、89.26%、91.75%、94.36%、80.24%、80.62%。這6種類型葉片含水量影響差異并不顯著，但相對含水量存在顯著差異，30 cm以上畸形葉和恢復(fù)葉的相對含水量較低?？梢姡莞熟⒄T導(dǎo)葉片表型變化與一般性缺水引起葉片皺縮的機(jī)制不同。

2.2.2 草甘膦對橡膠樹芽接苗葉片葉綠素含量的影響

為了探求葉片扭曲對葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的影響，測定了6種葉片葉綠素含量變化規(guī)律。從圖3可以看出，正常葉、7～10 cm、10～20 cm、20～30 cm和30 cm以上畸形葉和恢復(fù)葉的葉綠素a含量分別為2.92、2.16、2.46、2.70、2.07、0.95 mg/g鮮重；葉綠素b含量分別為0.58、0.54、0.61、0.60、0.41、0.13 mg/g鮮重；β-胡蘿卜素含量分別為0.81、0.66、0.70、0.81、0.62、0.39 mg/g鮮重。由于6種類型葉片葉綠素a和b含量存在顯著差異，總?cè)~綠素含量和葉綠素a/b比值也存在顯著差異。由于Chla多位于葉片葉綠體類囊體膜PSII反應(yīng)中心蛋白復(fù)合體，而Chlb多位于葉片葉綠體類囊體膜捕光色素天線蛋白復(fù)合體，二者的比值反映兩類蛋白復(fù)合體的含量變化。因此，葉綠素a和b含量和比值的變化說明葉片葉綠體類囊體膜結(jié)構(gòu)的變化。

2.2.3 草甘膦對橡膠樹芽接苗葉片游離脯氨酸和可溶性糖含量影響 從圖4可以看出，正常葉、7～10 cm、10～20 cm、20～30 cm和30 cm以上畸形葉和恢復(fù)葉的可溶性糖含量分別為0.138、0.074、0.029、0.033、0.025、0.018 mg/g鮮重；脯氨酸含量分別為0.025、0.075、0.029、0.978、0.045、0.065 mg/g鮮重。6種類型葉片脯氨酸和可溶性糖含量均存在顯著差異，畸形葉和恢復(fù)葉可溶性糖含量顯著低于對照葉片，而脯氨酸含量高于對照葉片。說明草甘膦影響了不同類型葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中脯氨酸和可溶性糖的含量。

2.2.4 草甘膦對橡膠樹芽接苗葉片過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的影響 從圖5可以看出，正常葉、7～10 cm、10～20 cm、20～30 cm和30 cm以上畸形葉和恢復(fù)葉的超氧化物歧化酶活性分別為4 359.66、5 366.80、4 582.99、5 684.86、5 108.53、4 928.34 U/mg蛋白；過氧化物酶活性分別為6 355.87、2 512.13、9 104.63、9 036.31、8 711.99、4 924.05 U/（mg·min）。6種類型葉片超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性均存在顯著差異，畸形葉和恢復(fù)葉超氧化物歧化酶活性高于正常葉片，10～20 cm、20～30 cm和30 cm以上畸形葉片過氧化物酶活性高于正常葉片。說明葉片扭曲導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生和活性氧淬滅酶活性的提高。

3 討論與結(jié)論

鑒于草甘膦的廣泛應(yīng)用，其潛在的危害一直受到關(guān)注[2，19-21]。另一方面，通過研究草甘膦的作用機(jī)制，采用分子技術(shù)研發(fā)抗草甘膦除草劑的作物新品種是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的熱點(diǎn)[22-23]。隨著我國橡膠樹種植規(guī)模的擴(kuò)大、膠園更新和新品種的推廣，橡膠樹育苗工作大規(guī)模開展。但是，草甘膦除草劑對橡膠樹幼苗的影響仍不清楚。筆者發(fā)現(xiàn)草甘膦誘導(dǎo)橡膠樹幼苗葉片新生葉畸形的特點(diǎn)有助于闡明橡膠樹葉片的草甘膦抗性機(jī)制，并培育抗草甘膦除草劑的橡膠樹品種打下基礎(chǔ)。

葉片扭曲通常認(rèn)為與葉片含水量、活性氧代謝和光合作用變化有關(guān)。水稻卷葉突變體卷曲葉片會(huì)導(dǎo)致丙二醛含量上升和葉綠素含量降低[24]。半卷葉水稻突變體ATP合酶活性增加[25]。草甘膦藥害會(huì)導(dǎo)致水稻穗部畸形和不育[26]。可見，植物葉片卷曲會(huì)導(dǎo)致生理功能發(fā)生巨大變化，這與本研究結(jié)果一致（圖1）然而，筆者發(fā)現(xiàn)草甘膦噴施后橡膠樹畸形葉片與正常葉的葉片含水量差異不顯著（圖2），說明葉片扭曲不是由于葉片脫水引起的，而是內(nèi)部生理結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。首先，葉片扭曲導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。筆者發(fā)現(xiàn)，畸形葉葉綠素a含量下降顯著，表明光系統(tǒng)II反應(yīng)中心的蛋白含量降低，葉綠素b含量降低較慢，表明捕光天線系統(tǒng)受到的影響較?。▓D3）。說明橡膠樹畸形葉葉綠體類囊體膜捕光天線上葉綠素b吸收的過多的激發(fā)能不能通過光系統(tǒng)II反應(yīng)中心的葉綠素a傳遞用于光化學(xué)淬滅，多余的激發(fā)能導(dǎo)致活性氧含量的上升。因此，筆者發(fā)現(xiàn)活性氧淬滅的關(guān)鍵酶過氧化物酶和超氧化物歧化酶歧化酶活性均顯著高于正常葉（圖5）。

由于草甘膦的靶標(biāo)是莽草酸合酶，施用草甘膦會(huì)引起植物細(xì)胞內(nèi)部的蛋白含量變化。例如，草甘膦會(huì)引起胡蘿卜細(xì)胞中游離氨基酸含量上升，蛋白種類、功能變化[27-28]，蛋白含量下降[29]。筆者亦發(fā)現(xiàn)草甘膦處理葉片中游離脯氨酸含量上升（圖4）?；稳~可溶性糖含量的下降與光合活性的減少有關(guān)。說明葉片扭曲影響光合作用和羧化作用。這可能是由生長素合成和運(yùn)輸紊亂引起的[30]，也可能與乙烯生成有關(guān)[31]。筆者擬進(jìn)一步采用高效液相色譜法測定畸形葉葉片激素含量，采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選差異基因，結(jié)合本研究的結(jié)果，共同揭示草甘膦對橡膠樹葉片的作用機(jī)制。

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