楊軍 王海鳳 郭濤

摘要：海稻86是非常珍貴的耐鹽堿水稻種質(zhì)資源，其耐鹽堿優(yōu)良性狀為有效利用黃河三角洲鹽堿地、增加糧食產(chǎn)量提供了可能。本研究利用InDel分子指數(shù)法對海稻86的秈粳性進(jìn)行分析，結(jié)果表明海稻86為秈稻，且初步確定其不是野生稻。這就為雜交育種親本配組中有效利用海稻86耐鹽堿優(yōu)良性狀提供了參考。

關(guān)鍵詞：海稻86；InDel標(biāo)記；秈粳性

中圖分類號：S511.035.1文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）10-0024-03

海稻86是以1986年陳日勝在湛江海邊發(fā)現(xiàn)的海水稻而命名，2014年9月1日該品種正式在農(nóng)業(yè)部《農(nóng)業(yè)植物新品種保護(hù)公報(bào)》上公布。海稻86的典型特點(diǎn)是稻穗為青白色，具有較強(qiáng)的耐鹽堿、耐淹能力，是非常珍貴的水稻種質(zhì)資源。水稻是改良鹽堿地的先鋒作物[1，2]，可有效壓鹽洗堿，改良土壤，使重度鹽堿地改良為中、輕度鹽堿地。山東省黃河三角洲地區(qū)目前有近46.7萬公頃鹽堿地，不適合耐鹽堿性差的作物生長[3]。有效的解決方案之一是育種家將優(yōu)良水稻品種與海稻86雜交選育出適合黃河三角洲地區(qū)種植的耐鹽堿水稻品種。然而，目前對于海稻86的秈粳性尚未定論。如果在雜交育種親本配組之前不能正確地了解親本的秈粳性，則會導(dǎo)致選配親本失當(dāng)及育種結(jié)果不理想[4]。因此，明確海稻86的秈粳屬性、了解其秈粳分化程度是利用海稻86耐鹽堿優(yōu)良性狀需要面對的首要問題。

長期以來，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上用于鑒定水稻品種秈粳性的主要方法是程侃聲[5]提出的“程氏指數(shù)法”，但該方法需采用較多的數(shù)量性狀，需培育至成熟植株才能完成各個(gè)形態(tài)指標(biāo)的測量[6]，在實(shí)際分類操作過程中容易受到環(huán)境和人為主觀因素影響[7]。針對傳統(tǒng)鑒定方法存在的缺陷，盧寶榮等[8]通過比對粳稻品種日本晴和秈稻品種93-11基因組序列，篩選并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證出與栽培稻的秈粳遺傳分化密切相關(guān)的34個(gè)InDel特異位點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定水稻品種的秈粳性及秈粳分化程度，并將該方法稱為“InDel分子指數(shù)法”。InDel分子指數(shù)法是鑒定水稻秈粳屬性的特異方法，相對于傳統(tǒng)鑒定方法具有更高的可操作性和靈敏性，可以用于秈粳屬性鑒定及遺傳分化等方面的研究 [6， 9，10]。本研究采用InDel分子指數(shù)法對海稻86的秈粳性進(jìn)行分析鑒定，以期為合理利用海稻86進(jìn)行雜交育種提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

用于本研究的材料為粳稻品種日本晴、秈稻品種93-11以及待測品種海稻86。

1.2DNA提取

將日本晴、93～11以及海稻86種植在28℃人工氣候箱中生長至3～4葉期， 每個(gè)品種選擇新鮮葉片約1 g ，按照CTAB方法提取各水稻品種基因組DNA[11]。

1.3PCR擴(kuò)增及電泳檢測

采用賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成的34對特異性InDel引物（表1）對日本晴、93-11以及海稻86基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：2×Taq Mix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL（引物濃度10 μmol/L），1 μL 模板DNA（50 ng），ddH2O補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓100 V，電泳時(shí)間60 min左右。

1.4數(shù)據(jù)分析

InDel分子標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，以粳稻品種日本晴、秈稻品種93-11基因組DNA電泳結(jié)果為參照，讀取待測品種海稻86在34對InDel標(biāo)記上的基因型數(shù)據(jù)。分析方法參考盧寶榮等[8]提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，具體如下：在各標(biāo)記位點(diǎn)上，凡是與日本晴擴(kuò)增條帶位置一致的記為純合粳稻基因型（JJ）；凡是與秈稻 93-11擴(kuò)增條帶位置一致的，記為純合秈稻基因型（II）；既出現(xiàn)與日本晴條帶位置相同又同時(shí)出現(xiàn)與93-11條帶位置相同條帶的， 則記為秈-粳稻雜合基因型（IJ）。根據(jù)海稻86在34個(gè)InDel位點(diǎn)（N）上的基因型數(shù)據(jù)（JJ、II和IJ）來確定其秈粳類型。海稻86的秈或粳型平均基因頻率（Fi或Fj）按照盧寶榮等[8]的方法，用以下公式計(jì)算：

秈稻型基因頻率 Fi=2∑N1Xii+∑N1Xij2N；

粳稻型基因頻率 Fj=2∑N1Xjj+∑N1Xij2N

式中：Xii為樣品在某一InDel位點(diǎn)上由電泳條帶判讀的純合秈稻基因型（II）；Xjj為樣品在某一InDel位點(diǎn)上由電泳條帶判讀的純合粳稻基因型（JJ）；Xij為樣品在某一InDel位點(diǎn)上由電泳條帶判讀的秈-粳稻雜合基因型（IJ）；N等于特異InDel引物對數(shù)34。鑒定秈粳性的判別標(biāo)準(zhǔn)見表2。

2結(jié)果與分析

2.1三個(gè)品種PCR擴(kuò)增結(jié)果

用34對InDel引物對日本晴、93-11以及海稻86基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)在各InDel標(biāo)記上產(chǎn)生了明顯的多態(tài)性條帶。其中海稻86在標(biāo)記R3M53、R4M13、R4M17、R10M17上的擴(kuò)增條帶與粳稻品種日本晴擴(kuò)增條帶位置一致，在其它30個(gè)標(biāo)記上的擴(kuò)增條帶與秈稻品種93-11擴(kuò)增條帶位置一致。在這34個(gè)InDel標(biāo)記擴(kuò)增中都未見到稻雜合基因型條帶。部分標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果如圖1。

2.2海稻86秈粳性分析

根據(jù)海稻86在34個(gè)InDel位點(diǎn)PCR擴(kuò)增結(jié)果，計(jì)算其粳型（Fj）或秈型（Fi）基因頻率。結(jié)果表明待測品種海稻86的粳型（Fj）基因頻率為0.1176，對應(yīng)的秈型（Fi）基因頻率為0.8824。根據(jù)表2的秈粳性分類標(biāo)準(zhǔn)可以確定海稻86為秈稻。盧寶榮等[8]研究結(jié)果表明野生稻在R1M47等某些InDel位點(diǎn)擴(kuò)增中會出現(xiàn)更高的多態(tài)性且其檢測的所有野生稻均為秈、粳中性，據(jù)此可以初步確定海稻86不是野生稻。

注：三個(gè)品種上樣順序依次為日本晴、93-11、海稻86。M為DL2000 DNA分子標(biāo)記；1、2、3依次是上述三個(gè)品種標(biāo)記R1M7的擴(kuò)增結(jié)

果，4、5、6為標(biāo)記R1M30的擴(kuò)增結(jié)果，7、8、9是標(biāo)記R1M37的擴(kuò)增結(jié)果，10、11、12是標(biāo)記R1M47的擴(kuò)增結(jié)果，13、14、15是標(biāo)記R2M10

的擴(kuò)增結(jié)果，16、17、18是標(biāo)記R2M24的擴(kuò)增結(jié)果，19、20、21是標(biāo)記R2M26的擴(kuò)增結(jié)果，22、23、24是標(biāo)記R3M53的擴(kuò)增結(jié)果。

3討論與結(jié)論

鹽堿地是我國重要的后備土地資源，有效改良利用鹽堿地是保障糧食安全、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一[12]。目前公開報(bào)道的耐鹽堿水稻資源較少[13]，海稻86作為非常珍貴的耐鹽堿水稻種質(zhì)資源，其含有的耐鹽堿優(yōu)良性狀為有效利用鹽堿地、增加糧食產(chǎn)量提供了可能。本研究利用InDel分子指數(shù)法對海稻86的秈粳性進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明其為秈稻，且推測其不是野生稻。海稻86耐鹽堿能力強(qiáng)，但是本身也存在一些問題，例如產(chǎn)量低、株型偏高等。今后對海稻86進(jìn)行改良，取其精華將是研究的重點(diǎn)方向之一。

致謝：海稻86由陳日勝研究員提供，謹(jǐn)致謝意。

參考文獻(xiàn)：

[1]王維國，劉東. 蘇打鹽堿地改良種稻技術(shù)研究[J]. 黑龍江水利科技，2012，40（4）：30-33.

[2]嚴(yán)海霞，何文壽. 寧夏銀北地區(qū)鹽堿地改良與水稻種植技術(shù)探討[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010，49（11）：2693-2695.

[3]張凌云. 黃河三角洲地區(qū)鹽堿地主要改良措施分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007， 35（17）：5266.

[4]孫淑紅. 從龍粳20的選育探討常規(guī)育種親本選配問題[J]. 中國稻米， 2010，16（3）：12-13.

[5]程侃聲. 亞洲稻秈粳亞種的鑒別[M]. 昆明：云南科學(xué)技術(shù)出版社，1993.

[6]王明軍，王云月，陸春明，等. 利用秈粳稻特異InDel標(biāo)記分析云南糯稻品種的秈粳特性[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，25（3）：333-337.

[7]陳雨，潘大建，曲延英，等. 水稻秈粳分化研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（12）：3-7.

[8]盧寶榮，蔡星星，金鑫. 秈稻和粳稻的高效分子鑒定方法及其在水稻育種和進(jìn)化研究中的意義[J]. 自然科學(xué)進(jìn)展，2009，19（5）：26-36.

[9]王林友，張禮霞，勾曉霞，等. 利用InDel標(biāo)記鑒定水稻育種材料的秈粳屬性[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，27（7）：913-921.

[10]王林友，張禮霞，勾曉霞，等. 利用InDel標(biāo)記鑒定浙優(yōu)系列雜交稻秈粳屬性和預(yù)測雜種優(yōu)勢[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（7）：1243-1255.

[11] Murray M G，Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic Acids Research，1980，8（19）：4321-4325.

[12]呂曉，徐慧，李麗，等. 鹽堿地農(nóng)業(yè)可持續(xù)利用及其評價(jià)[J]. 土壤，2012，44（2）：203-207.

[13]Hiroki T，Muluneh T，Akira A，et al. MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar[J]. Nature Biotechnology，2015，33（5）：445-449.