王秀華 李家麗 蒲艷艷 叢曉翔 林雪婷 于鴻翔 趙巖

摘要：為加速分子標記在黑麥草中的應用，利用黑麥草EST數(shù)據(jù)庫（GenBank/dbEST）開展了黑麥草EST-SSR信息分析、標記開發(fā)和EST功能分析研究。在25 752條黑麥草EST序列中，共發(fā)現(xiàn)346條SSR序列，占整個EST總數(shù)的1.344%。其中，三核苷酸基序最多（39.60%），次之為二核苷酸基序（31.79%）。三核苷酸基序以GGC/CCG出現(xiàn)頻率最高，為8.38%，其次是CGC/GCG（7.51%）、GCC/CGG（4.05%）和ATG/TAC（2.02%），二核苷酸基序以CT/GA出現(xiàn)頻率最高（14.45%），其次是GA/CT（10.98%）。根據(jù)這些含有SSR的EST序列，利用Primer Premier 5.0軟件，對346條EST-SSR序列進行引物設計，共設計引物193對，其中分值在90分以上的有113對（32.66%）。利用GenBank的BlastN和BlastX程序對相應113條EST進行功能分析，72條EST序列與51種具有生物學功能的蛋白質(zhì)同源。

關鍵詞：黑麥草；EST-SSR；信息分析；引物設計；功能分析

中圖分類號：S543+.601文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）10-0001-06

黑麥草屬禾本科（Poaceae）黑麥草屬（Lolium）植物。其中最具有商業(yè)價值的兩個種為多年生黑麥草（Lolium perenne L.）和多花黑麥草（Lolium multiflroum L.），作為草坪草和優(yōu)質(zhì)牧草在我國均有大面積栽培和利用[1，2]。

目前，黑麥草中常用的分子標記技術主要有RAPD[3]、CAPS[4]、AFLP[4，5]、SSR[6]、EST-SSR[7]等。SSR（simple sequence repeat）標記在遺傳圖譜的構建[8]、遺傳多樣性和親緣關系分析[9]、品種指紋圖譜及純度鑒定[10]、功能基因標記[11]等方面具有公認的優(yōu)越性和廣闊的應用前景。但傳統(tǒng)的基因組SSR標記開發(fā)投入多、耗時長。近年來，隨著GenBank中大量EST（expressed sequence tags）序列的公布，許多植物基于EST的SSR（EST-SSR）標記開發(fā)成為可能。與基因組SSR相比，EST-SSR具有開發(fā)成本低、物種間通用性高、可直接反映相關基因的多樣性等突出優(yōu)點。目前許多作物如小麥、大麥、高羊茅、蒺藜苜蓿等的EST-SSR已被開發(fā)并用于遺傳作圖、遺傳多樣性、基因發(fā)掘、比較作圖等研究[12-15]。

本研究利用NCBI上的黑麥草EST序列查找SSR，對其進行信息分析，設計EST-SSR引物，開發(fā)黑麥草EST-SSR分子標記，并對相應EST進行功能分析。

1材料與方法

1.1EST序列來源

從http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/下載黑麥草EST序列。

1.2EST-SSR的查找

登陸網(wǎng)站http：//archive.gramene.org/db/markers/ssrtool，利用SSRIT（simple sequence repeat identification tool）軟件在線查找二、三、四、五、六核苷酸5種類型的SSR。識別標準為：重復基序最小長度≥18 bp，即二、三、四、五、六核苷酸重復次數(shù)分別大于或等于10、7、5、4、3。

1.3EST-SSR引物設計

利用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)SSR的側翼區(qū)域設計引物。引物設計的主要參數(shù)：EST序列長度大于100 bp；SSR序列的開始和結束位置分別距5′和3′端不少于20 bp；引物長度18～22 bp；退火溫度Tm值 50～65℃，而且上游和下游引物的Tm值相差不大于5℃；PCR擴增產(chǎn)物長度100～300 bp；得分90分以上，盡量避免引物二級結構的出現(xiàn)。

1.4EST功能分析

利用NCBI網(wǎng)站對篩選出的黑麥草EST序列進行Blast比對，包括BlastN和BlastX兩種比對，得到與其他植物已知基因或蛋白相似的功能，獲得該EST在草坪草中的預測功能。利用BlastN程序在核苷酸水平上進行同源性分析，認為序列比分值大于200，e-value ≤1×10-20的序列具有同源核苷酸片段，而比對的片段長度小于50 bp結果不予采納；對符合上述要求的EST序列利用BlastX程序在翻譯水平上對其進行分析，序列比分值大于80的結果認為有相似性顯著的同源蛋白質(zhì)。

2結果與分析

2.1源于黑麥草EST的SSR查找

從NCBI上共下載到黑麥草的25 752條EST序列（其中多年生黑麥草19 784條，多花黑麥草5 968條）。經(jīng)SSR查找，共發(fā)現(xiàn)346條SSR序列，占整個EST數(shù)據(jù)庫的1.344%；這些EST序列全長17 720 kb，平均每1 000 kb 出現(xiàn)19.53個SSR，即每51.21 kb出現(xiàn)1個SSR。含有二、三、四和五核苷酸重復基序分別占SSR總數(shù)的31.79%、39.60%、11.27%和17.34%，無六核苷酸重復基序，三核苷酸基序出現(xiàn)頻率最高，次之為二核苷酸基序（表1）。

2.2黑麥草EST-SSR的特征分析

346個SSR中，二核苷酸基序以CT/GA出現(xiàn)頻率最高，占SSR總數(shù)的14.45%，其次是GA/CT（10.98%）和AT/TA（1.73%）。三核苷酸基序以GGC/CCG出現(xiàn)的頻率最高，為8.38%，其次是CGC/GCG（7.51%）、GCC/CGG（4.05%）和ATG/TAC（2.02%），其他類型出現(xiàn)頻率較低。四核苷酸基序以GTTG/CAAC出現(xiàn)頻率最高，為0.87%。五核苷酸以TGTCG/ACAGC（2.31%）和CTCAT/GAGTA（2.02%）出現(xiàn)頻率較高，其余出現(xiàn)頻率均較低（表2）。

2.3黑麥草EST-SSR引物的開發(fā)

利用Primer Premier 5.0軟件，對346個EST-SSR序列進行引物設計，共設計引物193對（55.78%），分值在90分以上的有113對（32.66%），見表3。

2.4功能分析

利用NCBI的BlastN和BlastX程序，對113條EST-SSR引物相應的EST序列進行比對分析。有78條EST序列與具有生物功能的核酸有同源性（未列出），有72條EST序列與具有生物功能的蛋白質(zhì)有同源性（表4）。這72條蛋白序列分屬于51種蛋白，大部分的同源產(chǎn)物來源于二穗短柄草（31.94%）或烏拉爾圖小麥（15.28%）。

3討論

目前，水稻[16]、小麥[17-19]、玉米[20]等主要糧食作物的EST-SSR標記已得到大量開發(fā)和應用。草類植物EST-SSR標記的開發(fā)和應用還較少。隨著草坪草、牧草等草類植物EST和cDNA大規(guī)模測序的開展，相應EST數(shù)目也在急劇增加，其EST-SSR引物的開發(fā)與利用展現(xiàn)了廣闊的前景[14，21-24]。截至2015年11月14日，在GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi. nlm.nih. gov/dbEST）中找到的黑麥草的EST序列已達到25 752條。我們利用這25 752條EST序列，對346個EST-SSR序列進行引物設計，設計了113個分值90以上的引物對，為黑麥草增加了新的分子標記。

前人對EST-SSR的出現(xiàn)頻率及重復基元出現(xiàn)頻率進行了大量研究。關于EST中SSR出現(xiàn)頻率，Chen等[17]對小麥EST-SSR進行開發(fā)時，每57.44 kb出現(xiàn)一個SSR；而李杰勤等[21]在高粱中研究結果為平均3.93 kb。這可能是由所研究的EST數(shù)據(jù)庫不同及不同的EST-SSR搜索標準和統(tǒng)計標準所致。本研究在25 752條黑麥草EST序列中，共找到346條SSR序列，占整個EST數(shù)據(jù)庫的1.344%，平均分布距離為51.21 kb。本研究結果和Chen等[17]研究結論相近。關于EST中不同核苷酸數(shù)目的重復基元出現(xiàn)頻率，本研究中三核苷酸基序出現(xiàn)頻率最高（39.60%），次之為二核苷酸基序（31.79%）。三核苷酸基序以GGC/CCG出現(xiàn)的頻率最高，為8.38%，其次是CGC/GCG（7.51%），二核苷酸基序以CT/GA出現(xiàn)頻率最高，占SSR總數(shù)的14.45%，其次是GA/CT（10.98%）。前人多數(shù)研究結果也為三核苷酸重復基元出現(xiàn)頻率最高[25，26]。在水稻、玉米、大豆、高粱中二核苷酸重復基序出現(xiàn)頻率最多的都是GA/CT[19]，在水稻、玉米、大麥中，三核苷酸的CCG/GGC和AGG/TCC出現(xiàn)頻率高[19，26，27]。本研究結果與在大多數(shù)植物基因組中三核苷酸重復出現(xiàn)頻率較高的結果是一致的，二、三核苷酸不同基序出現(xiàn)頻率也與多數(shù)結果一致。

利用生物信息學對EST序列進行功能分析，可推測該EST序列的功能，使隨機測序而獲得的EST序列與特定的生物功能相聯(lián)系，有助于EST-SSR的進一步利用。而那些通過比對不能發(fā)現(xiàn)同源核苷酸或蛋白質(zhì)的EST序列，可能是新的功能基因，EST-SSR引物就可作為這些新基因的分子標記，為基因克隆與功能驗證奠定標記基礎。高瑞娟等[28]在比對結球白菜EST時，94.8%（1102/1162）的EST可在蛋白質(zhì)或核苷酸水平上找到同源類似物，大約77%的功能已知蛋白質(zhì)來自擬南芥。本文利用NCBI的BlastN和BlastX程序對113條EST-SSR引物對應的EST序列進行了比對分析。結果表明，72條EST序列有生物學意義上的同源序列（63.72%），與高瑞娟等研究結果類似。我們比對的大部分的同源產(chǎn)物來源于二穗短柄草（31.94%）或烏拉爾圖小麥（15.28%），得益于這兩個物種特別是草類模式植物二穗短柄草近年來基因組研究的飛速發(fā)展。

4結論

在GenBank/dbEST中檢索到黑麥草的EST序列25 752條，其中346個EST序列含有SSR（1.344%），共設計了分值90以上的EST-SSR引物113對。EST-SSR信息分析表明，三核苷酸基序最多，并以GGC/CCG出現(xiàn)的頻率最高；次之為二核苷酸基序，并以CT/GA出現(xiàn)頻率最高。對113條EST-SSR引物相應的EST序列進行Blast比對分析表明，有72條EST序列與具有生物功能的蛋白質(zhì)有同源性，且分為51種蛋白質(zhì)，大部分的同源產(chǎn)物來源于二穗短柄草（31.94%）或烏拉爾圖小麥（15.28%）。

參考文獻：

[1]

李杰勤， 王麗華， 詹秋文， 等. 20個黑麥草品系的SRAP遺傳多樣性分析[J]. 草業(yè)學報， 2013， 22（2）： 158-164.

[2]劉春英， 孫學映， 朱體超， 等. 不同黑麥草品種生產(chǎn)性能比較與優(yōu)勢品種篩選[J]. 草業(yè)學報， 2014， 23（4）： 39-48.

[3]董曉寧， 張曉佩， 李文楊. 18個黑麥草品種（系）的RAPD分析[J]. 福建農(nóng)業(yè)學報， 2009， 24（3）： 266-269.

[4]Miura Y， Ding C， Ozaki R， et al. Development of EST-derived CAPS and AFLP markers linked to a gene for resistance to ryegrass blast （Pyricularia sp.） in Italian ryegrass （Lolium multiflorum Lam.） [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2005， 115（5）： 811-818.

[5]Bert P F， Charmet G， Sourdille P， et al. A high-density molecular map for ryegrass （Lolium perenne） using AFLP markers [J]. Theoretical and Applied Genetics， 1999， 99（3）： 445-452.

[6]Studer F， Klliker R， Muylle H， et al. EST-derived SSR markers used as anchor loci for the construction of a consensus linkage map in ryegrass （Lolium spp.） [J]. BMC Plant Biology， 2010， 10：177.

[7]Hirata M， Cai H， Inoue M， et al. Development of simple sequence repeat （SSR） markers and construction of an SSR-based linkage map in Italian ryegrass （Lolium multiflorum Lam.） [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2006， 113（2）：270-279.

[8]盧杰， 呂媛媛， 李杰勤， 等. 高丹草SSR引物設計及分子遺傳框架圖譜構建[J]. 中國草地學報， 2009， 31（2）：28-33.

[9]Ipek A， Barut E， Gulen H， et al. SSR analysis demonstrates that olive production in the southern Marmara region in Turkey uses a single genotype [J]. Genetics and Molecular Research， 2009， 8（4）： 1264-1272.

[10]Aitken K S， Jackson P A， McIntyre C L. A combination of AFLP and SSR markers provides extensive map coverage and identification of homo（eo）logous linkage groups in a sugarcane cultivar [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2005， 110（5）： 789-801.

[11]Li Y， Niu Y C， Chen X M. Mapping a stripe rust resistance gene YrC591 in wheat variety C591 with SSR and AFLP markers [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2009， 118（2）： 339-346.

[12]Holton T A， Christopher J T， McClure L， et al. Identification and mapping of polymorphic SSR markers from expressed gene sequences of barley and wheat[J]. Molecular Breeding， 2002， 9（2）： 63-71.

[13]Saha M C， Rouf M A， Eujayl I， et al. Tall fescue EST-SSR markers with transferability across several grass species [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2004， 109（4）： 783-791.

[14]Barrett B， Griffiths A， Schreiber M， et al. A microsatellite map of white clover [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2004， 109 （3）： 596-608.

[15]Gupta S， Prasad M. Development and characterization of genic SSR markers in Medicago truncatula and their transferability in leguminous and non-leguminous species [J]. Genome， 2009， 52（9）： 761-771.

[16]Yu J K， Rota M L， Kantety R V， et al. EST derived SSR markers for comparative mapping in wheat and rice[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2004， 271（6）： 742-751.

[17]Chen H M， Li L Z， Wei X Y， et al. Development， chromosome location and genetic mapping of EST-SSR markers in wheat [J]. Chin. Sci. Bull.， 2005， 50： 2328-2336.

[18]Song W， Xie H， Liu Q， et al. Molecular identification of Pm12-carrying introgression lines in wheat using genomic and EST-SSR markers[J]. Euphytica， 2007， 158 （1）： 95-102.

[19]Li L Z， Wang J J， Guo Y， et al. Development of SSR markers from ESTs of gramineous species and their chromosome location on wheat [J]. Proceedings of the Academy of Natural Science， 2008， 18： 1485-1490.

[20]Galvao K S， Ramos H C， Santos P H， et al. Functional molecular markers （EST-SSR） in the full-sib reciprocal recurrent selection program of maize （Zea mays L.） [J]. Genetics and Molecular Research， 2015， 14（3）： 7344-7355.

[21]李杰勤， 王麗華， 詹秋文， 等. 高粱EST-SSR標記的建立及其在蘇丹草中的應用初探[J]. 草業(yè)科學， 2010， 27（3）： 112-117.

[22]陳永霞， 張新全， 謝文剛， 等. 利用EST-SSR標記分析西南扁穗牛鞭草種質(zhì)的遺傳多樣性[J]. 草業(yè)學報， 2011， 20（6）： 245-253.

[23]溫瑩， 逯曉萍， 任銳， 等. 高丹草EST-SSR標記的開發(fā)及其遺傳多樣性[J]. 遺傳， 2013， 35（2）： 225-232.

[24]Zeid M， Yu J K， Goldowitz I， et al. Cross-amplification of EST-derived markers among 16 grass species [J]. Field Crops Research， 2010， 118（1）： 28-35.

[25]Gao L F， Tang J F， Li H W. Analysis of microsatellites in major crops assessed by computational and experimental approaches [J]. Molecular Breeding， 2003， 12： 245-261.

[26]Thiel T， Michalek W， Varshney R K， et al. Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley （Hordeum vulgare L.） [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2003， 106： 411-422.

[27]Cho Y G， Ishii T， Temnykh S， et al. Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and GenBank sequences in rice （Oryza sativa L.） [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2000， 100： 713-722.

[28]高瑞娟， 戴大鵬， 馬榮才， 等. 結球白菜結球前期基因表達序列標簽（EST）分析 [J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報， 2004， 12（1）： 24-29.