肖文芳 李佐 陳和明 呂復(fù)兵

摘 要 以8份蝴蝶蘭種質(zhì)資源為材料，使用SSR標(biāo)記進(jìn)行蝴蝶蘭種質(zhì)資源和突變體的鑒定。從25對SSR熒光標(biāo)記引物中篩選出10對擴(kuò)增效果理想的SSR熒光標(biāo)記引物，鑒定4個(gè)不同品種的蝴蝶蘭及其相應(yīng)的突變體。10對SSR引物中有9對引物在這8個(gè)種質(zhì)中能擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，共擴(kuò)增出38個(gè)等位基因，利用其中3對引物SSR3+SSR8+SSR9的組合即可將4個(gè)品種及其突變體全部區(qū)分開，說明SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法檢測蝴蝶蘭突變體高效可行。

關(guān)鍵詞 蝴蝶蘭；組培突變體；SSR

中圖分類號 S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract In this research， four Phalaenopsis germplasms and their somaclonal mutants were used to identity mutants by fluorescent labeled simple sequence repeat（SSR）markers. Ten of 25 SSR primer pairs with good repeatability were selected，and then were labeled with fluorescent for amplification and capillary electrophoresis. Nine of 10 SSR primer pairs with high polymorphisms totally amplified 38 polymorphic alleles. SSR3， SSR8 and SSR9 could distinguish all of the samples. The present results provide valuable tools for the cultivar classification and somaclonal variation detection of Phalaenopsis.

Key Words Phalaenopsis； Somaclonal variation； SSR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.015

微衛(wèi)星（Microsatellite），也稱為短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats， STRs）或簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats， SSRs），是指以幾個(gè)核苷酸（2～5個(gè)）為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的重復(fù)序列。微衛(wèi)星廣泛分布于真核生物整個(gè)基因組的不同位置上，由于重復(fù)次數(shù)的不同及重復(fù)程度的不完全造成了每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性。SSR具有信息含量高、呈共顯性遺傳，檢測時(shí)DNA用量少、操作簡便、多態(tài)性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，是分析種質(zhì)資源遺傳多樣性，進(jìn)行基因組作圖的重要手段。傳統(tǒng)的SSR檢測方法采用聚丙烯酰胺凝膠電泳加放射顯影或銀染的方法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力低效。目前廣泛采用的毛細(xì)管電泳技術(shù)，其原理是利用ABI遺傳分析儀對熒光標(biāo)記的DNA片段進(jìn)行檢測，結(jié)合分子量內(nèi)標(biāo)進(jìn)行DNA片段長度計(jì)算，使SSR分型變得高效快捷，重復(fù)性好，結(jié)果也更加精確。

SSR在蘭科植物上的應(yīng)用不多，主要集中在種質(zhì)遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析上[1-5]。

目前，國際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）的BMT分子測試指南中將SSR和SNP確定為構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記方法，由于SSR標(biāo)記技術(shù)比較成熟，成為當(dāng)前各個(gè)作物建庫的首選標(biāo)記（UPOV，2007），已成功用于構(gòu)建水稻、油菜、棉花、甘蔗、花生、棗、梨、百合等經(jīng)濟(jì)作物的指紋圖譜，其中大部分均采用毛細(xì)管電泳檢測法[6-14]。而在突變體檢測方面，目前主要使用的分子鑒定方法為RAPD[15-16]、AFLP[17]和SSR，其中利用SSR對水稻空間誘變系[18-19]、棉花的組培突變體[20]和大豆的突變體庫[21]進(jìn)行檢測，都得到了較好的檢測結(jié)果，但仍局限于傳統(tǒng)的凝膠電泳檢測法，未見結(jié)合更高效精確的毛細(xì)管電泳檢測手段。蝴蝶蘭作為重要的觀賞作物，經(jīng)濟(jì)價(jià)值非常高，但相對其生產(chǎn)成本也高，生長周期較長，從組培苗到開花售賣約18個(gè)月。由于激素使用等原因，蝴蝶蘭種苗在組培生產(chǎn)過程中存在一定的變異幾率，而突變體并不符合商品生產(chǎn)的要求，會(huì)加大生產(chǎn)成本，不利于大規(guī)模商品化生產(chǎn)。所以高效的蝴蝶蘭突變體檢測技術(shù)非常必要。

本實(shí)驗(yàn)利用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法對已在形態(tài)學(xué)上觀測到突變的蝴蝶蘭突變體進(jìn)行檢測，探索SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法在蝴蝶蘭突變體檢測上的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蝴蝶蘭植株 實(shí)驗(yàn)采用4組相對變異的蝴蝶蘭突變體及其野生型，第1組為市場流行品種‘滿天紅及其具白色流彩狀鑲邊的花色突變體；第2組為市場流行品種‘光芒四射及其無白色流彩狀鑲邊的花色突變體；第3組為市場流行品種‘V31及其具白色流彩狀鑲邊的花色突變體；第4組為本單位自主選育和審定的蝴蝶蘭紅花品種‘紅珍珠（粵審花2007004）及其晚花突變體（見圖1）。突變體均為本單位在組培及栽培過程中發(fā)現(xiàn)的自有突變體，經(jīng)多年觀察及繁殖發(fā)現(xiàn)突變體的性狀均能穩(wěn)定遺傳。所有實(shí)驗(yàn)材料均種植于廣東省農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化科技示范區(qū)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所溫室大棚內(nèi)，棚內(nèi)有專職人員種植養(yǎng)護(hù)。

1.1.2 試劑 化學(xué)試劑均購自廣州化學(xué)試劑廠；基因組DNA提取試劑盒為天根生物科技（北京）有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒；擴(kuò)增試劑：2.5×Multiplex Buffer及Fast Taq DNA Polymerase來自北京閱微基因公司；ROX-500和ROX-800分子量內(nèi)標(biāo)來自北京閱微基因公司。

1.1.3 儀器 （1）Nanodrop 2000C核酸蛋白檢測系統(tǒng)（Thermo）；（2）BC-subMIDI電泳儀（北京六一儀器廠），電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；（3）BioSens SC 810B凝膠成像儀（上海山富科學(xué)儀器有限公司）；（4）Centrifuge 5415D離心機(jī)（德國eppendorf公司）；（5）GeneAmp 9600 PCR儀（ABI公司）；（6）3730XL DNA analyzer（ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 蝴蝶蘭基因組DNA提取材料采用根尖0.2 g，按照天根生物科技（北京）有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒操作步驟進(jìn)行，提取的DNA溶解在80 μL 1×TE溶液中。提取的DNA分別采用分光光度計(jì)檢測和瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 引物合成 引物分別采用3種不同顏色的熒光標(biāo)記：FAM、HEX和TMR。根據(jù)前人研究結(jié)果，挑選了25條在蝴蝶蘭中擴(kuò)增效果較好的引物進(jìn)行擴(kuò)增[5，22-24]，擴(kuò)增產(chǎn)物大小介于150～750 bp之間，預(yù)測多集中于250～550 bp之間。經(jīng)過篩選，其中10條引物（見表1）在本實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增結(jié)果較好，無雜峰，能擴(kuò)增出穩(wěn)定的DNA條帶。

1.2.3 PCR反應(yīng) 進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為15 μL，其中含1.0 μL（50 ng/μL）DNA模板，6.0 μL 2.5×Buffer V緩沖液，0.1 μL（5 U/μL）Taq酶，上下游引物共1.0 μL（5 μmol/L），去離子水6.9 μL。SSR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，58 ℃ 35 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 35 s，60 ℃ 30 min，1個(gè)循環(huán)，最后降至15 ℃。

1.2.4 測序儀檢測及分析 96孔板中每孔加入分子量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液（0.5 ∶ 8.5）9 μL，PCR產(chǎn)物1.0 μL，95 ℃變性3 min后，上機(jī)進(jìn)行多重混檢。1 kV電壓進(jìn)樣10 s，電泳15 kV，30 min。將Data Colletion軟件收集的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入GeneMapper v4.0軟件進(jìn)行分析，系統(tǒng)將各峰值的位置與其泳道中的ROX-500或ROX-800分子量內(nèi)標(biāo)予以比較，直接給出目標(biāo)DNA片段的準(zhǔn)確大小。各熒光標(biāo)記座位上獨(dú)立進(jìn)行3次重復(fù)的毛細(xì)管電泳檢測，取3次重復(fù)的平均值并四舍五入取整，作為實(shí)驗(yàn)材料在該座位上的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，基于8個(gè)實(shí)驗(yàn)材料，10個(gè)SSR熒光標(biāo)記共檢測到38個(gè)等位基因（見表2，圖2）。10個(gè)SSR熒光標(biāo)記中只有SSR4沒有多態(tài)性，其余引物均能在一定程度上將各個(gè)品種或者正常株與突變體之間區(qū)分開。其中，SSR1和SSR6能夠?qū)ⅰ疂M天紅及其變異株與其他的品種區(qū)分開，但是‘滿天紅及其變異株之間未能區(qū)分。SSR2不能區(qū)分‘紅珍珠及其變異株，但能將二者與其他的品種區(qū)分開。SSR3在‘滿天紅上表現(xiàn)出特異性缺失，而在‘滿天紅變異中則擴(kuò)增出1條234 bp的條帶；在‘V31及其變異間檢測不到多態(tài)性，但是與其他3個(gè)品種有所區(qū)分；能夠?qū)ⅰ饷⑺纳浜汀t珍珠這2個(gè)品種、‘光芒四射及其變異區(qū)分開，但是不能將‘紅珍珠及其變異區(qū)分開。SSR5的結(jié)果將8個(gè)品種分為3組，滿天紅及其變異株條帶一樣，‘V31及其變異株條帶一樣，而剩下的4個(gè)品種條帶一樣。SSR7則能將4個(gè)品種都分開，但是每個(gè)品種與其變異株之間都不能檢測出差異。SSR8即能把‘滿天紅、‘V31和‘光芒四射3個(gè)品種區(qū)分開，又能把3個(gè)品種與他們的突變體區(qū)分開。SSR9能夠?qū)?個(gè)品種區(qū)分開，但在突變體區(qū)分中只能將‘紅珍珠及其突變體區(qū)分開。SSR10可以將‘滿天紅及其突變體和‘V31及其突變體區(qū)分開，而‘滿天紅、‘V31和‘光芒四射3個(gè)品種的擴(kuò)增條帶各不相同，‘紅珍珠的擴(kuò)增條帶則與‘V31一樣。

SSR3擴(kuò)增‘滿天紅時(shí)和SSR9擴(kuò)增‘光芒四射變異時(shí)都出現(xiàn)了特異性缺失，不能擴(kuò)增出條帶，可能的原因有2種：（1）該SSR位點(diǎn)由于插入或者缺失而導(dǎo)致該位點(diǎn)缺失；（2）可能是該SSR位點(diǎn)的引物結(jié)合區(qū)發(fā)生點(diǎn)突變，導(dǎo)致引物不能結(jié)合。

從擴(kuò)增結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，10個(gè)SSR引物中，SSR3+SSR8+SSR9的組合就能夠完全將4個(gè)品種及其突變體全部區(qū)分開，說明SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法檢測蝴蝶蘭突變體高效可行。

3 討論與結(jié)論

突變體的產(chǎn)生主要來源于物理化學(xué)因素、組織培養(yǎng)和太空誘發(fā)[25-26]。蝴蝶蘭這類采用組培繁殖種苗的觀賞作物，其突變體除人為進(jìn)行外，主要來源于組織培養(yǎng)。突變體鑒定方法共4種：（1）表型鑒定；（2）細(xì)胞學(xué)鑒定；（3）生物化學(xué)鑒定；（4）分子生物學(xué)鑒定。各種方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和適用性。在蝴蝶蘭的突變體鑒定上，我們主要采用表型鑒定結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，通過表型鑒定發(fā)現(xiàn)突變體，然后利用RAPD[27]或SSR等分子標(biāo)記手段進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，即首先通過表型鑒定篩選出相對于野生型有顯著差異外觀性狀的突變體，然后通過分子鑒定確定其從基因組水平上發(fā)生了變異，最終確定突變體為不受環(huán)境因素影響的可遺傳突變體。

本研究通過對4個(gè)蝴蝶蘭品種及其組培突變體的SSR分析，發(fā)現(xiàn)不同品種間及正常株與突變體間在一些SSR位點(diǎn)的基因型差異明顯，說明SSR標(biāo)記可用于蝴蝶蘭組培突變體鑒別及品種鑒定。通過擴(kuò)增結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，雖然‘滿天紅及其突變體與V31及其突變體、‘光芒四射及其突變體的表型變異類似，均表現(xiàn)為紅色的增多或者減少，但是擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶卻完全不同，說明3個(gè)突變體的變異可能是由不同的基因突變引起的。Su等[28]從蝴蝶蘭中克隆到F3′5′H基因的cDNA全長，利用基因槍法在蝴蝶蘭的花瓣中瞬時(shí)表達(dá)，花瓣在48 h內(nèi)從粉紅色變成品紅色，說明F3′5′H基因的上調(diào)可能引起紅色素的增加；Han等[29]將pchs-1全長基因轉(zhuǎn)化到煙草中發(fā)現(xiàn)花的顏色變紅從而進(jìn)一步證明了Pchs基因可能參與花朵的紅色素合成；是形成穩(wěn)定花色素苷所必需的。Chen等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在紅花蝴蝶蘭中類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（flavonoid 3-O-glucosyltransferase，UFGT）基因大量表達(dá)，表達(dá)量顯著高于白花，而PeUFGT3-RNAi植株則表現(xiàn)出不同程度的褪色，且花青素含量明顯降低，說明UFGT基因與紅色花的形成高度相關(guān)。這些結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)變化都有可能引起花部色素含量的變化，進(jìn)而導(dǎo)致花色的改變，另外調(diào)控花青素苷生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因時(shí)空表達(dá)的3種轉(zhuǎn)錄因子R2R3-Myb、Myc基因家族的bHLH（basic helix-loop-helix）和WD40型轉(zhuǎn)錄因子[31]的變化也會(huì)引起花色的改變，所以三個(gè)突變體的表型雖然類似，成因卻各不相同。而‘紅珍珠晚花突變體的成因則可能與FT、SOC1和LFY等成花基因[32]的突變相關(guān)，Xiang等[33]從春蘭中克隆的FT同源基因CgFT在煙草中超量表達(dá)會(huì)出現(xiàn)早花表型，Huang等[34]從春蘭克隆的FT同源基因CgFT在擬南芥中超量表達(dá)會(huì)也導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥提早開花，說明FT基因會(huì)抑制成花，其突變體可能就會(huì)是晚花突變體。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，在實(shí)際應(yīng)用方面，前期的蝴蝶蘭高效檢測突變體技術(shù)非常必要。（1）從種質(zhì)資源的收集利用來講，需要通過高效分子標(biāo)記檢測表型相同或者不同的各類突變體來篩選出不同基因型的突變體，豐富種質(zhì)資源的收集保存，減小重復(fù)保存，擴(kuò)大相同表型的不同基因型種質(zhì)資源，為蝴蝶蘭的分子生物學(xué)研究和生理生化研究奠定堅(jiān)實(shí)的資源基礎(chǔ)；（2）從實(shí)際生產(chǎn)上來講，蝴蝶蘭由于生產(chǎn)規(guī)模大、成本高，在前期進(jìn)行抽樣檢測，保證種苗的品種純正非常必要。從本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，大部分的SSR特異性片段間大小的差異較小，有的小到只差2 bp，傳統(tǒng)的SSR檢測方法根本不能檢測到如此小的差異，毛細(xì)管電泳技術(shù)則能夠檢測小到1 bp的差異，使SSR分型變得高效快捷，實(shí)用性也更強(qiáng)，更適用于蝴蝶蘭的品種及突變體檢測鑒定。

當(dāng)然，用分子標(biāo)記對種質(zhì)進(jìn)行鑒定目前還處于研究階段，還存在不少問題，特別對于蝴蝶蘭這種原生種眾多、高度雜合的物種，基因組參考性較差，設(shè)計(jì)的引物并不一定和重要的形態(tài)性狀連鎖，并不能完全包含一個(gè)品種的所有信息。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針對大規(guī)模的生產(chǎn)檢測，SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法檢測行之有效且高效低投入。但是如果是針對生物學(xué)實(shí)驗(yàn)材料的鑒定檢測，還應(yīng)與染色體水平、細(xì)胞學(xué)水平和形態(tài)水平等鑒定相結(jié)合，才能更加準(zhǔn)確地描述一個(gè)品種的全部種質(zhì)信息。

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