祁小妮 馬曉紅 李振亮 黨金寧

摘要：【目的】優(yōu)化丹參多糖提取的柔化工藝參數(shù)，并分析其抗氧化活性，為丹參多糖產(chǎn)品的研發(fā)提供參考依據(jù)。【方法】以液料比（A）、浸提溫度（B）、浸提時間（C）為自變量，以丹參多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，采用3因素3水平的響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化丹參多糖提取工藝，同時測定丹參多糖對羥基自由基的清除能力?！窘Y(jié)果】建立的丹參多糖提取二次多項回歸方程為：Y=1.94-0.041A-0.056B+0.022C-0.046AB+0.13AC-0.03BC-0.24A2-0.75B2-0.44C2，其中浸提溫度與浸提時間的交互作用對丹參多糖提取率影響顯著（P<0.05）。丹參多糖提取的最佳柔化工藝條件為：液料比25∶1（mL/g）、浸提溫度75 ℃、浸提時間90 min，在此條件下多糖提取率為1.94%，與預(yù)測值1.97%接近。丹參多糖對羥基自由基有明顯的清除能力，且隨多糖質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強；丹參多糖質(zhì)量濃度為4.5 mg/mL的清除率最高，為42%?！窘Y(jié)論】采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化的提取柔化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于丹參多糖提取；丹參多糖具有一定的體外抗氧化能力，可作為食品及醫(yī)藥行業(yè)的天然抗氧化劑資源進行開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞： 丹參；多糖；響應(yīng)曲面；抗氧化活性

中圖分類號： R284.2 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）11-1926-06

Abstract：【Objective】Diffusion process parameters in Salvia miltiorrhiza Bunge polysaccharide extraction was optimized and antioxidant activity was analyzed， in order to provide reference basis for development and research of S. miltiorrhiza polysaccharide products. 【Method】With liquid to material ratio（A）， extraction temperature（B） and extraction time（C） as independent variable， extraction rate of S. miltiorrhiza polysaccharide（Y） as response value， extraction process of S. miltiorrhiza polysaccharide was optimized using response surface methodology with three factors and three levels. Meanwhile， scavenging effects of S. miltiorrhiza polysaccharide on hydroxyl radical were measured. 【Result】The quadratic multinomial regression equation of S. miltiorrhiza polysaccharide extraction was presented as follows： Y=1.94-0.041A-

0.056B+0.022C-0.046AB+0.13AC-0.03BC-0.24A2-0.75B2-0.44C2. The interaction of extraction temperature and extraction time had significant influence on S. miltiorrhiza polysaccharide extraction（P<0.05）. The optimal diffusion process condition was as follows： liquid to material ratio 25∶1（mL/g）， extraction temperature 75 ℃， extraction time 90 min. Under such condition， polysaccharide extraction rate reached 1.94%， which was close to the expected value 1.97%. S. miltiorrhiza polysaccharide had obvious scavenging effects on hydroxyl radical， and the scavenging effects strengthened as mass concentration of polysaccharide increased. The scavenging effects reached maximum（42%） when mass concentration of polysaccharide was 4.5 mg/mL. 【Conclusion】The diffusion process parameters optimized by response surface methodology are reasonable and reliable， which can be used in extraction process of S. miltiorrhiza polysaccharide. S. miltiorrhiza polysaccharide enjoys certain in vitro antioxidant activity and can be developed as natural antioxidant in food and pharmaceuticals indusrties.

Key words： Salvia miltiorrhiza Bunge； polysaccharide； response surface methodology； antioxidant activity

0 引言

【研究意義】丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）又稱赤參、紫丹參、紅根，為唇形科鼠尾草屬植物，具有緩解疼痛、祛除瘀堵、活絡(luò)經(jīng)脈等功效（劉偉等，2015），對于治療心臟病、高血脂、高血壓等常見臨床病癥具有顯著作用（石亞飛等，2014）。丹參含有黃酮苷類、酚酸類、多糖類等物質(zhì)（張金濤和于敏佳，2011；董順福等，2013；姚慧娟等，2015），已有研究表明丹參多糖具有一定的抗氧化活性（劉振亮等，2013）。因此，研究丹參多糖提取工藝，對其藥用開發(fā)與利用具有重要意義。【前人研究進展】目前，已有不少學(xué)者對丹參多糖提取工藝進行研究。鞏?。?015）采用響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶法提取白花丹參多糖工藝，得到最佳工藝條件為：復(fù)合酶添加量8.0 mg/mL、液料比45∶1（mL/g）、酶解溫度52 ℃、酶解時間70 min，在此條件下多糖提取率為13.36%；張海容等（2015）在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取丹參多糖工藝，結(jié)果表明，在超聲功率90 W、超聲溫度50 ℃、液固比55∶1的條件下提取30 min、提取2次，丹參多糖提取率為8.23%；楊瑞花和張玥莉（2016）采用3因素3水平響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取丹參多糖工藝，結(jié)果表明，在加酶量0.5%、酶解溫度65 ℃、提取時間120 min的最優(yōu)條件下，丹參多糖提取率為2.59 mg/g。有關(guān)丹參多糖抗氧化活性的研究也有一些報道，如劉振亮等（2013）研究發(fā)現(xiàn)白花丹參多糖的抗氧化能力隨多糖質(zhì)量濃度的增加而增強，1 mg/mL白花丹參多糖對亞油酸過氧化抑制率為23.05%；鞏健（2015）、王燕華等（2015）的研究結(jié)果表明，丹參多糖可有效清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基?！颈狙芯壳腥朦c】在已有的提取丹參多糖研究中，大多采用超聲波法或酶法以提高多糖提取效率，但超聲波產(chǎn)生的超強輻射作用對原始多糖結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的改變，使大分子多糖降解成小分子單糖，不僅改變了原始多糖的生物學(xué)多級構(gòu)象，還影響多糖的生物活性（高擎等，2012）；而在酶解過程中，多糖易水解生成新的還原糖。故本研究采用柔化的多糖提取工藝參數(shù)（液料比、浸提時間、浸提溫度），最大限度地保持丹參多糖的原始活性，有效合理地評價丹參多糖的生物體外抗氧化活性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化丹參多糖提取的柔性工藝參數(shù)，并分析丹參多糖的體外抗氧化活性，為丹參多糖產(chǎn)品的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

丹參購自甘南中藥材大藥房。無水乙醇、三氯甲烷、苯酚、正丁醇、乙醚、濃硫酸、30%過氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、葡萄糖均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。主要儀器設(shè)備：SHB-Ⅲ循環(huán)水真空泵（河南鞏義予華儀器有限責(zé)任公司）；GZX-DH-600電熱恒溫干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；PHS-3C精密pH計（上海雷磁儀器廠）；FA2004電子天平（上海精密科學(xué)儀器公司）；HHS數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海精密科學(xué)儀器公司）；UV1900雙光束紫外可見分光光度計（浙江福立分析儀器有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司）；CT14D高速離心機（上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 丹參多糖提取工藝流程 丹參粉碎→稱量（5 g左右）→浸泡1 h（去離子水）→浸提（不同溫度下）→真空抽濾→濃縮提取液（40 mL）→醇沉淀（24 h）→離心、過濾→加入去離子水溶解沉淀→加1/4體積的Sevage試劑脫蛋白（Sevage試劑為氯仿∶正丁醇=4∶1，攪拌30 min離心取上清液，反復(fù)操作3次直至蛋白脫盡）→干燥→稱重（吳從平等，2007；江磊等，2013）。

1. 2. 2 丹參多糖含量測定 多糖含量采用苯酚—硫酸法（劉振亮等，2013）測定。以蒸餾水為試劑空白，在最大吸收波長490 nm處測不同濃度所對應(yīng)的吸光值，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，配制相應(yīng)準(zhǔn)確濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算丹參多糖含量（祁小妮等，2015）。多糖提取率計算公式為：

多糖提取率=M×V×（F/m）×100

式中，M為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出供試品的多糖質(zhì)量濃度（μg/mL）；V為供試液體積（mL）；F為稀釋倍數(shù)；m為丹參樣品質(zhì)量（g）。

1. 2. 3 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上（李淵，2015；張海容等，2015），根據(jù)實際條件適當(dāng)調(diào)整考察因素。根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選擇液料比、浸提溫度、浸提時間為自變量，以丹參多糖提取率為響應(yīng)值，采用3因素3水平的響應(yīng)曲面分析法確定丹參多糖提取的最佳柔性工藝參數(shù)。因素及水平編碼見表1。

1. 2. 4 多糖抗氧化活性分析 參考Fenton反應(yīng)體系模型（何傳波等，2013；祁小妮等，2015），配制9 mmol/L水楊酸—乙醇溶液、9 mmol/L硫酸亞鐵溶液和8.8 mmol/L過氧化氫溶液，分別取上述3種標(biāo)準(zhǔn)溶液按等體積比例混合，再加入抗氧化活性物質(zhì)，多糖與水楊酸同時競爭體系中產(chǎn)生的羥基自由基，根據(jù)生成有色物質(zhì)含量的變化，進行定量分析。以蒸餾水為試劑空白，在最大吸收波長處（490 nm）測各濃度的吸光值。以羥基自由基清除率為衡量抗氧化活性指標(biāo)，以維生素C為陽性對照，丹參多糖對羥基自由基的清除率計算公式為：

清除率=[1-（A1-A2）/A3]×100

式中，A1為加多糖的吸光值；A2為不加顯色劑的多糖吸光值；A3為蒸餾水吸光值。

1. 3 統(tǒng)計分析

利用Design-Expert 8.0對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=0.006x+0.047（R2=0.9995），說明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度在0.01～0.05 μg/mL范圍內(nèi)與其吸光值呈良好的線性關(guān)系。

2. 2 響應(yīng)曲面優(yōu)化丹參多糖提取工藝

2. 2. 1 響應(yīng)曲面試驗結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理進行響應(yīng)曲面試驗，結(jié)果如表2所示。表2中試驗1～12為析因試驗點，13～15為中心試驗點。利用Design-Expert 8.0對表2數(shù)據(jù)進行二次多項數(shù)學(xué)擬合回歸分析，得到丹參多糖提取率對提取因素的二次多項回歸方程為：

Y=1.94-0.041A-0.056B+0.022C-0.046AB+0.13AC-

0.03BC-0.24A2-0.75B2-0.44C2

對試驗結(jié)果（表2）進行方差（ANOVA）檢驗，該模型系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果如表3所示。由表3可看出，模型P<0.0001，說明試驗?zāi)Ｐ途哂袠O顯著性；模型的失擬項檢驗不顯著（P>0.05），說明模型選擇較合適，試驗相對誤差較??；校正決定系數(shù)R2Adj=0.9820，說明該模型能夠?qū)憫?yīng)值98.20%的變化規(guī)律作出解釋。浸提時間與浸提溫度的交互作用（BC）及浸提時間的二次項（C2）對丹參多糖提取率影響顯著（P<0.05，下同），而料液比、浸提溫度的二次項（A2、B2）對丹參多糖提取率影響極顯著（P<0.01）。

2. 2. 2 響應(yīng)曲面分析結(jié)果 采用固定單因素法，繪制另外兩個因素的交互作用對丹參多糖提取率影響的三維立體曲面圖。從圖1～圖3可看出，響應(yīng)曲面二次函數(shù)拋物面曲面圖開口朝下，說明該復(fù)合函數(shù)的二階導(dǎo)數(shù)不為零，模型包括的因素水平均為最優(yōu)化組合。橢圓形的等高線圖反映因素交互作用顯著，反之，則不顯著。由圖1可看出，當(dāng)浸提溫度為65 ℃時，浸提時間與液料比的交互作用對丹參多糖提取率的影響明顯，曲線呈上升趨勢，且變化幅度較大。由圖2可看出，當(dāng)浸提時間為60 min時，浸提溫度對丹參多糖提取率的影響較大，其曲線呈先升高后降低趨勢；料液比的影響曲線變化較平緩，表明其對多糖提取率影響較小。由圖3可看出，浸提時間與浸提溫度的交互作用對丹參多糖提取率影響顯著。

2. 2. 3 模型驗證試驗結(jié)果 根據(jù)回歸模型分析得到丹參多糖最佳提取工藝條件為：液料比25.3∶1、浸提溫度74.6 ℃、浸提時間89.5 min，在此條件下丹參多糖提取率預(yù)測值為1.97%。為了檢驗響應(yīng)曲面法對丹參多糖提取工藝優(yōu)化的可靠性，進行驗證試驗，結(jié)合實際操作條件，將柔性工藝參數(shù)調(diào)整優(yōu)化為：液料比25∶1、浸提溫度75 ℃、浸提時間90 min，進行3次平行試驗，丹參多糖提取率最高為1.94%，與回歸模型預(yù)測值間具有良好的吻合性。說明該模型可以很好地預(yù)測丹參多糖提取條件與提取率之間的關(guān)系。

2. 3 丹參多糖抗氧化活性分析結(jié)果

丹參多糖對羥基自由基的清除效果如圖4所示。由圖4可知，丹參多糖和維生素C對羥基自由基均具有明顯的清除能力，且清除率呈濃度依賴型變化；當(dāng)?shù)⒍嗵琴|(zhì)量濃度為4.5 mg/mL時，清除率達最大值（42%）。由于平臺效應(yīng)影響（何傳波等，2013），隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，丹參多糖對羥基自由基的清除率趨于穩(wěn)定，但丹參多糖清除羥基自由基的能力弱于維生素C。

3 討論

丹參是藥食兩用中藥材，藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)丹參多糖具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用（張湘東等，2012；王燕華等，2015）。不少學(xué)者選擇高效、省時的強化技術(shù)對其進行提取研究，如孟國良（2009）利用微波在水料比10∶1、50目粉碎、萃取3次、每次高火萃取5 min的條件下萃取白花丹參多糖；王燕華等（2015）利用超聲波在超聲功率212 W、超聲時間18 min、顆粒大小55目的條件下提取得到丹參多糖提取率4.73%。雖然微波法和超聲波法提取多糖省時、提取率較高，但超聲波和微波的機械作用及超聲空化作用易破壞植物多糖的原始活性，從而影響對多糖抗氧化活性的準(zhǔn)確評估。鞏?。?015）研究白花丹參多糖酶法提取條件及其抗氧化活性，在最佳工藝條件下得到多糖提取率13.36%，抗氧化試驗結(jié)果表明白花丹參多糖濃度為10 mg/mL時，對羥基自由基的清除率達88.57%。雖然采用酶法可提高丹參多糖的提取率，但破壞了一部分原始多糖的活性。

本研究采用響應(yīng)曲面法對丹參多糖提取的柔化工藝參數(shù)液料比、浸提溫度和浸提時間進行優(yōu)化，在最佳柔化工藝條件下得到丹參多糖提取率為1.94%，提取的多糖對羥基自由基的最大清除率為42%，相當(dāng)于單位濃度多糖的抑制率為9.4%，較鞏?。?015）采用酶法提取的單位濃度多糖對羥基自由基的抑制率（8.857%）高。本研究的柔化工藝與其他提取工藝相比，可有效保存丹參多糖的原始生物活性，提高準(zhǔn)確評估多糖生物活性的可信度；但其提取率略低，可能與柔化試驗參數(shù)設(shè)計有關(guān)，故下一步的研究重點是在保存多糖原始活性的基礎(chǔ)上提高多糖提取率，找出更優(yōu)的參數(shù)水平。此外，本研究采用響應(yīng)曲面優(yōu)化法對3個因素的各水平進行分析，發(fā)現(xiàn)浸提溫度與浸提時間的交互作用對丹參多糖提取率影響顯著，反映了因素間的交互作用，并以較少試驗次數(shù)和較短時間對所選試驗參數(shù)進行全面研究，克服了正交試驗只能對一個孤立的試驗點進行分析及不能給出直觀圖形的缺陷。

4 結(jié)論

采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化的提取柔化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于丹參多糖提?。坏⒍嗵蔷哂幸欢ǖ捏w外抗氧化能力，可作為食品及醫(yī)藥行業(yè)的天然抗氧化劑資源進行開發(fā)利用。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）