廖格 趙美麗 宋希強 梅文莉 楊錦玲 戴好富

摘 要 采用整樹結(jié)香法誘導健康白木香樹結(jié)香，并根據(jù)樹體受傷后木材的顏色形態(tài)特征將木材分為腐爛層、沉香層和白木層，運用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)分別對三層的乙醚提取物進行了分析。結(jié)果表明，不同層化學成分的種類和相對含量上有明顯差異。沉香層與腐爛層的2-（2-苯乙基）色酮類成分總相對含量都很高，腐爛層的色酮類成分相對含量（70.25%）高于沉香層（60.08%），但沉香層的色酮種類（14個）比腐爛層（10個）多；倍半萜類成分在沉香層和腐爛層中的相對含量均較低，沉香層的倍半萜類成分相對含量（5.75%）略高于腐爛層（3.75%），而腐爛層的倍半萜個數(shù)（11個）略多于沉香層（8個）。白木層則以甾體類化合物為主，沒有檢出色酮類和倍半萜類成分。

關(guān)鍵詞 整樹結(jié)香法；沉香；GC-MS；2-（2-苯乙基）色酮

中圖分類號 O656.22 文獻標識碼 A

GC-MS Analysis of the Agarwood Produced by

Whole-tree Agarwood-Inducing Technology

LIAO Ge1，2， ZHAO Meili3， SONG Xiqiang1， MEI Wenli2， YANG Jinling1，2， DAI Haofu2 *

1 Horticultural and Landscape College， Hainan University， Haikou， Hainan 572008， China

2 Hainan Engineering Research Center of Agarwood / Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，

Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

3 Jiangxi Chemical Industry School， Nanchang， Jiangxi 330012， China

Abstract In this paper， the agarwood was induced to form in the healthy Aquilaria sinensis with whole-tree agarwood-inducing technology. Then the wood was divided into three sections， which respectively named rotten layer， agarwood layer， and whitewood layer， according to their color and morphological characteristics. The chemical constituents of the three layers were analyzed by using gas chromatography - mass（GC-MS）spectrometry. The results showed that different types and relative content of the chemical components were found in different layers. Compared with the relative content of 2-（2-phenylethyl）chromone derivatives in the agarwood layer（60.08%）， it was more abundant in the rotten layer（70.25%）， however， the former had more 2-（2-phenylethyl）chromone derivatives（14）than the latter（10）. Meanwhile， the relative content of sesquiterpenes was rather low in both the agarwood layer and the rotten layer. The agarwood layer had slightly more content（5.75%）than the rotten layer（3.75%）， while the rotten layer（11）had a little more sesquiterpenes than the agarwood layer（8）. Unlike other two layers， the whitewood layer mainly contains steriods instead of 2-（2-phenylethyl）chromone derivatives or sesquiterpenes.

Key words Whole-tree agarwood-inducing technology； Agarwood； GC-MS； 2-（2-phenylethyl）chromone

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.031

沉香為瑞香科沉香屬（Aquilaria）植物中含有樹脂的木材[1]。白木香（Aquilaria sinensis）是國產(chǎn)沉香的唯一藥源植物，主產(chǎn)于海南、廣東等地，具有極高的經(jīng)濟價值[2]。一方面，巨大的經(jīng)濟利益驅(qū)使和自然生態(tài)環(huán)境的破壞導致野生白木香資源急劇減少，白木香現(xiàn)已被載入《中國植物紅皮書》[3]及《國家重點保護野生植物名錄》[4]；另一方面，天然沉香形成的幾率低——“有香者百無一二”[5]，且形成的過程緩慢，使得野生沉香資源供不應求。因此，20世紀70年代初很多學者開始探索人工結(jié)香技術(shù)，除了傳統(tǒng)的砍傷、鑿洞、火燒、打釘和半斷干法之外，近年來化學法、人工接菌法等新技術(shù)也不斷應用于研究和生產(chǎn)實踐中[6]。

國內(nèi)外學者對沉香的化學成分研究較多，目前已報道沉香中的揮發(fā)和半揮發(fā)性成分主要是倍半萜類和2-（2-苯乙基）色酮類化合物[1，7]。近年來關(guān)于人工沉香的研究漸熱，主要是采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對其進行分析。林峰等[8-9]先后用GC-MS分別對打釘法、砍傷法和鑿洞法所產(chǎn)沉香及接菌法半年及一年的沉香進行了分析。陳曉穎等[10]用GC-MS分別對刀砍、鉆釘和化學法所產(chǎn)沉香進行了分析。陳懷瓊等[11]用GC-MS研究了輸液法處理半年得到的沉香、國產(chǎn)野生沉香和健康白木香的揮發(fā)油成分。劉洋洋等[12]用GC-MS分別比較研究了通體結(jié)香技術(shù)處理6個月所得沉香及火烙法、半斷干法和接菌法所產(chǎn)沉香的揮發(fā)性成分。張興麗等[13]用半斷干法處理白木香后，根據(jù)其宏觀形態(tài)顏色和微觀結(jié)構(gòu)分為腐爛層、沉香層、過渡層和白木層，并對不同處理時間不同層的樣品進行了GC-MS分析。以上學者的研究表明，不同結(jié)香技術(shù)、不同結(jié)香年限、不同結(jié)香部位的人工沉香，其化學成分均有所不同。

本研究所用整樹結(jié)香法是輸液法的一種，是將獨特配方的結(jié)香劑[14]輸入健康白木香樹體，從而誘導其結(jié)香的方法，也屬于化學結(jié)香方法。本研究用整樹結(jié)香法處理健康白木香樹，一年后根據(jù)白木香受傷后樹體的外觀形態(tài)變化將樹干分為3層，分別是：腐爛層、沉香層和白木層，并用GC-MS技術(shù)分別對這3層的揮發(fā)性成分進行比較分析，以期為整樹結(jié)香法所得人工沉香的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 美國安捷倫公司的HP6890/5975C GC/MS聯(lián)用儀，色譜柱為ZB-5MSI 5% Phenyl-95%DiMethylpolysiloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱；美國BRANSONIC-5510E-DTH超聲波清洗儀。試劑：乙醚（分析級），氯仿（色譜級）。

1.1.2 樣品 結(jié)香所用白木香樹為七年生，位于海南省定安縣南海農(nóng)場白木香種植基地，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所戴好富研究員鑒定為白木香（Aquilaria sinensis）；采用本課題組已獲國家發(fā)明專利授權(quán)的“整樹結(jié)香法”（ZL 2013 1 0150138.5）處理健康白木香樹，一年后根據(jù)樹體受傷后木材的外觀形態(tài)變化由內(nèi)而外分為腐爛層、沉香層和白木層（見圖1），不同層樣品的描述見表1。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)香方法 在距離地面約45 cm處，與樹干保持45度用普通電鉆鉆孔，鉆頭直徑為0.6 cm，孔深約4 cm。將500 mL配制好的結(jié)香劑[配方中不含2-（2-苯乙基）色酮類化合物]通過營養(yǎng)袋緩慢輸入鉆孔，輸完后用橡膠塞封住孔洞，防止雨水沖刷和結(jié)香劑流出。

1.2.2 樣品制備 用整樹結(jié)香法處理白木香樹后，木材組織最先從鉆孔部位開始結(jié)香，一年后沿鉆孔部位砍下長約15 cm，寬約10 cm，厚約2 cm的木塊。根據(jù)前人按照外觀顏色形態(tài)對結(jié)香部位的劃分，將采集的樣品分為腐爛層、沉香層和白木層[13，15]，然后分別曬干后削成小塊，精確稱取腐爛層1.349 1 g、沉香層0.902 4 g、白木層1.551 9 g，分別用50 mL乙醚在冰水浴下超聲提取30 min，靜置5 min后過濾得到乙醚提取液。重復提取3次，合并3次提取液，揮干后得到各層的乙醚油狀提取物分別為0.054 7、0.053 6、0.037 4 g，根據(jù)公式（提取率=提取物質(zhì)量/樣品質(zhì)量×100%）計算提取率分別為4.05%、5.94%、2.40%。

1.2.3 GC-MS分析條件 色譜條件。色譜柱：ZB-5MSI 5% Phenyl-95% Dimethylpolysiloxane （30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱；升溫程序：柱溫50 ℃，以5 ℃/min升溫至310 ℃，保持10 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓7.36 psi，載氣流量1.0 mL/min；分流比40 ∶ 1，溶劑：氯仿（色譜級），溶劑延遲時間：4.0 min。

質(zhì)譜條件。電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度280 ℃；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 612 V；質(zhì)量掃描范圍m/z 29～500。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)白木香經(jīng)誘導后的分層結(jié)果，用GC-MS技術(shù)分別對各層乙醚提取物進行分析，總離子流圖見圖2。多數(shù)化合物通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist2005和Wiley275標準質(zhì)譜圖得到鑒定，而2-（2-苯乙基）色酮類化合物則是根據(jù)本課題組總結(jié)的質(zhì)譜特征和裂解規(guī)律[16]，再結(jié)合文獻數(shù)據(jù)和標準品的質(zhì)譜圖鑒定而得。由表2可知，在整樹結(jié)香法所得沉香的腐爛層、沉香層和白木層的乙醚提取物中分別檢測到46、51、31個色譜峰，并用峰面積歸一化法測定了這些色譜峰在樣品中的總相對含量之和分別為90.94%、90.67%和87.34%。

在白木層中以甾體類化合物為主，沒有檢測出2-（2-苯乙基）色酮類和倍半萜類化合物；而腐爛層和沉香層的化學成分則以2-（2-苯乙基）色酮類化合物為主，相對含量分別高達70.25%和60.08%，此外，還含有少量倍半萜類化合物，相對含量分別為3.75%和5.75%。由于倍半萜類成分骨架多變，種類眾多，鑒定難度較大，因而有小部分倍半萜類化合物未能鑒定。在沉香層和腐爛層中檢測到的15個2-（2-苯乙基）色酮類化合物中，6，7-二甲氧基-2-（2-苯乙基）色酮在沉香層和腐爛層中的相對含量都很高，分別為12.75%和19.73%。而據(jù)文獻報道[1，7，10，17-18]，該化合物在大多數(shù)沉香的揮發(fā)性成分分析中均有鑒定（相對含量在1.29%～39.11%之間），說明它在沉香中普遍存在。除此之外，還有2-（2-苯乙基）色酮、2-[2-（4-甲氧基苯）乙基]色酮、6，7-二甲氧基-2-[2-（4-甲氧基苯）乙基]色酮等都較為常見[9-10，17-19]。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)GC-MS的分析結(jié)果可知，本次實驗中整樹結(jié)香法所得沉香的化學成分以2-（2-苯乙基）色酮類化合物為主，在沉香層和腐爛層中的總相對含量分別高達60.08%和70.25%。近年來，很多學者對人工結(jié)香法所得沉香的揮發(fā)性成分采用GC-MS技術(shù)進行了分析[8-13]，但其中能檢測到2-（2-苯乙基）色酮類化合物的報道不多。原因可能是Nist和Wiley質(zhì)譜庫中的2-（2-苯乙基）色酮類化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)有限，以致未能鑒定出色酮類成分。見諸報道的僅林峰[9]從接菌法所得沉香中鑒定出兩個色酮，總相對含量為29.12%，及陳曉穎[10]分別從刀砍法、鉆釘法和化學法所得沉香中鑒定出色酮，總相對含量分別為22.24%、32.34%和53.11%。

前人報道的奇楠沉香揮發(fā)性成分中色酮類成分總相對含量也比較高，在39.30%～95.59%之間[17-19]。此外，楊德蘭等[18]研究發(fā)現(xiàn)奇楠沉香乙醚提取率達20.3%～40.2%，化合物2-（2-苯乙基）色酮和2-[2-（4-甲氧基）苯乙基]色酮的相對含量之和高達66.47%～84.71%，建議將兩者在乙醚提取物中的相對含量之和以及乙醚提取得率作為沉香品質(zhì)評價的指標之一。而本研究中雖然腐爛層和沉香層的色酮類成分總相對含量分別高達60.08%和70.25%，但是其中2-（2-苯乙基）色酮和2-[2-（4-甲氧基）苯乙基]色酮的相對含量之和僅分別為13.50%和4.26%，且乙醚提取得率較低，僅分別為4.05%和5.94%，因此與奇楠沉香相比還是有明顯差別。

對不同層樣品乙醚提取物的揮發(fā)性成分進行分析可知，白木層、腐爛層和沉香層之間有明顯差異。沉香層與腐爛層的2-（2-苯乙基）色酮類成分總相對含量都很高，沉香層中14個色酮類成分的總相對含量為60.08%，腐爛層的10個色酮類成分的總相對含量為70.25%；倍半萜類成分在沉香層和腐爛層中總相對含量均較低，沉香層的8個倍半萜類成分的總相對含量為5.75%，而腐爛層的11個倍半萜類成分的總相對含量為3.75%。另外，2-（2-苯乙基）色酮、6，7-二甲氧基-2-[2-（4-甲氧基苯）乙基]色酮、色酮母核有一個甲氧基取代的色酮（出峰時間為44.65 min，取代位置不確定）、色酮母核有一個羥基取代的色酮（出峰時間為46.70 min，取代位置不確定），這4個色酮是沉香層和腐爛層的主要成分，在腐爛層中的相對含量之和為59.33%，在沉香層中相對含量之和為37.70%。

白木層則與沉香層和腐爛層不同，沒有檢測到色酮類和倍半萜類化合物，而以甾體類、烷烴類和芳香族化合物為主。本次實驗首次從白木層中檢測出大量甾體類化合物，總相對含量達45.81%。這可能是由于筆者采用了耐高溫的色譜柱，能在310 ℃下保持10 min，使得較難揮發(fā)的甾體類化合物得以揮發(fā)出來并得到鑒定。

整樹結(jié)香法作為一種新型的結(jié)香方法，與傳統(tǒng)結(jié)香方法相比，具有操作簡便，結(jié)香品質(zhì)更好，產(chǎn)量更大，效率更高的優(yōu)點，具有極大的應用前景。本研究用整樹結(jié)香法處理健康白木香后，根據(jù)樹體受傷后木材的外觀形態(tài)變化進行分層，并分別對其揮發(fā)性成分進行了分析，發(fā)現(xiàn)腐爛層和沉香層都含有沉香的特征性成分：色酮類和倍半萜類化合物，且腐爛層與沉香層的色酮類成分總相對含量都很高，分別為70.25%和60.08%。一般采收沉香時是將白木和腐爛的木頭都剔除掉，但本次實驗發(fā)現(xiàn)腐爛層有大量色酮類化合物，并不是毫無價值的“爛木頭”，可被用于制作線香等。因此在采收整樹結(jié)香法所得人工沉香時，只需刮除白木部分，腐爛層和沉香層可分別采收用作不同用途。

參考文獻

[1] Naef R. The volatile and semi-volatile constituents of agarwood， the infected heartwood of Aquilaria species： a review[J]. Flavour Fragr J， 2011， 26（2）： 73-87.

[2] 田耀華， 原慧芳， 倪書邦， 等. 沉香屬植物研究進展[J]. 熱帶亞熱帶作物學報， 2009， 17（1）： 98-104.

[3] 傅立國. 中國植物紅皮書：稀有瀕危植物[M]. 北京：中國科技出版社， 1992： 670.

[4] 國家林業(yè)局. 國家重點保護野生植物名錄[Z]. 1999.

[5] 寇宗奭. 本草衍義[M]//張麗君， 丁 侃， 校注. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2012： 53.

[6] 黃俊卿， 魏建和， 張 爭， 等. 沉香結(jié)香方法的歷史記載、 現(xiàn)代研究及通體結(jié)香技術(shù)[J]. 中國中藥雜志， 2013， 38（3）： 302-306.

[7] Chen H Q， Wei J H， Yang J S， et al. Chemical constituents of agarwood originating from the endemic genus aquilaria plants[J]. Chemistry & Biodiversity， 2012， 9（2）： 236-249.

[8] 林 峰， 梅文莉， 吳 嬌， 等. 人工結(jié)香法所產(chǎn)沉香揮發(fā)性成分的GC-MS分析[J]. 中藥材， 2010， 33（2）： 222-225.

[9] 林 峰， 戴好富， 王 輝， 等. 兩批接菌法所產(chǎn)沉香揮發(fā)油化學成分的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2010， 21（8）： 1 901-1 902.

[10] 陳曉穎， 高 英， 李衛(wèi)民. 不同結(jié)香方法與國產(chǎn)沉香揮發(fā)性化學成分的相關(guān)性研究[J]. 中國藥房， 2012， 23（11）： 1 017-1 020.

[11] 陳懷瓊. 白木香通體結(jié)香技術(shù)的初步評價[D]. 北京： 北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所， 2011.

[12] Liu Y Y， Chen H Q， Yun Y， et al. Whole-tree agarwood-Inducing technique： an efficient novel technique for producing high-quality agarwood in cultivated aquilaria sinensis trees[J]. Molecules， 2013， 18（3）： 3 086-3 106.

[13] 張興麗. 傷害誘導的白木香防御反應與沉香形成的關(guān)系研究[D]. 北京： 北京林業(yè)大學， 2013.

[14] 梅文莉， 戴好富， 王 輝， 等. 一種生產(chǎn)沉香的方法： 中國， ZL 2013 1 0150138.5[P]. 2013-04-26.

[15] 曾幻添， 董文忠， 吳質(zhì)樸. 沉香的人工沉香[J]. 中草藥通訊， 1978（12）： 38-42.

[16] Mei W L， Yang D L， Wang H， et al. Characterization and determination of 2-（2-Phenylethyl） chromones in agarwood by GC-MS[J]. Molecules， 2013， 18（10）： 12 324-12 345.

[17] 梅文莉， 楊德蘭， 左文健， 等. 奇楠沉香中2-（2-苯乙基）色酮的GC-MS分析鑒定[J]. 熱帶作物學報， 2013， 34（9）： 1 819-1 824.

[18] 楊德蘭， 梅文莉， 楊錦玲， 等. GC-MS分析四種奇楠沉香中致香的倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮類成分[J]. 熱帶作物學報， 2014， 35（6）： 1 235-1 243.

[19] Ishihara M， Tsuneya T， Uneyama K. Components of the volatile concentrate of agarwood[J]. J Essent Oil Res， 1993， 3（5）： 283-289.