羅福廣　黎婭　黃杰　易弋

摘要：【目的】篩選出能夠指示硫酸銅藥效濃度的水生動物，為促進(jìn)硫酸銅防病技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)?！痉椒ā繉?shí)驗(yàn)室環(huán)境下探討不同硫酸銅濃度（0.07、0.15、0.30、0.60和1.20 mg/L）治療人工感染寄生蟲魚類的效果，通過多個急性毒性試驗(yàn)篩選藥效濃度區(qū)間內(nèi)敏感的指示生物，并結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，設(shè)計一套合理的生物指示硫酸銅藥效的養(yǎng)殖病害防治辦法?！窘Y(jié)果】0.60 mg/L為實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下硫酸銅治療多子小瓜蟲、車輪蟲、斜管蟲等寄生蟲病的適宜濃度；綜合各急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，篩選出硫酸銅殺蟲濃度區(qū)間（0.15～1.20 mg/L）內(nèi)敏感的指示生物是麥穗魚（Pseudorasbora parva），并建立了一套硫酸銅藥效評估體系，即在施藥后4 h內(nèi)投放麥穗魚進(jìn)行行為、異常情況觀察，可評估硫酸銅藥效濃度情況。【結(jié)論】麥穗魚可作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中硫酸銅治療寄生蟲病藥效濃度的指示生物。

關(guān)鍵詞： 麥穗魚；硫酸銅；藥效評估；急性毒性

中圖分類號： S965.199 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0494-06

0 引言

【研究意義】硫酸銅是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的殺蟲、除藻、消毒劑，因其藥效明顯、價格低廉、低毒、施放簡易而備受養(yǎng)殖戶青睞（陳輝和楊先樂，2003；黃琪琰，2004）。實(shí)際生產(chǎn)中，硫酸銅潑灑的濃度一般為0.50～0.70 mg/L（黃琪琰和宋承方，1992；周劍等，2014）。由于硫酸銅易受水體有機(jī)物、懸浮物、總堿度、水溫、酸堿度等生態(tài)因子影響，其有效濃度難以掌控，且通過實(shí)驗(yàn)室檢測方法測量養(yǎng)殖水體的藥物濃度也不現(xiàn)實(shí)，生產(chǎn)中常因治療濃度不夠或過量而延誤病情或產(chǎn)生毒副作用。生物監(jiān)測是根據(jù)水生動物對化學(xué)物質(zhì)敏感度不同的特性，利用其異常生理或行為參數(shù)變化，可直接判斷水體毒性物質(zhì)對水生動物潛在影響及毒性作用。若能夠通過某種水生動物對硫酸銅的急性反應(yīng)迅速判斷當(dāng)前藥物濃度，對促進(jìn)硫酸銅防病技術(shù)的推廣應(yīng)用將具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國內(nèi)外利用大型蚤（Daphnia magna Straus）（Connon et al.，2008）、四膜蟲（Tetrahymena spp.）（Sauvant et al.，1999；Aydin et al.，2015）、虹鳉（Poecilia reticulata）（Strigul et al.，2010）、劍尾魚（Xiphophorus helleri）（Han and Fang，2010）、斑馬魚（Brachydanio rerio）（Yu et al.，2015）、青鳉（Oryzias latipes）（Liao et al.，2015）、黑頭軟口鰷（Pimephales promelas）（Mahler et al.，2015）、金魚（Carassius auratus）（Feng et al.，2015）、錦鯉（Cyprinus carpio）（Li et al.，2015）、藍(lán)鰓魚（Lepomis macro-

chirus）（Barron et al.，2015）、稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）（Guo et al.，2015）等作為水生模型動物進(jìn)行藥物毒性試驗(yàn)、計算藥物安全濃度、評價藥物安全及有效性或監(jiān)測水質(zhì)污染程度等已得到廣泛應(yīng)用。指示生物或組織器官作為水體銅污染標(biāo)記已成為水產(chǎn)研究的熱點(diǎn)之一。如Shao等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，異齒裂腹幼魚（Schizothorax oconnori Lloyd）和拉薩裂腹幼魚（Schizothorax waltoni Regan）對銅離子敏感，尤其是拉薩裂腹魚非常適合作為水產(chǎn)養(yǎng)殖銅藥物安全使用濃度的指示生物；Wu等（2015）通過檢測莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）鰓上的Na+-K+-ATPase（NKA）活性，評估水產(chǎn)養(yǎng)殖使用銅制劑藥物后魚類的健康情況；Hu等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，鰓上膽堿硫酸酯（Choline-O-sulfate）的變化也可作為紅鯉暴露于銅離子污染水體中的生物標(biāo)記?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，硫酸銅在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用中的藥物劑量尚缺乏有效指示，但盲目用藥可能會毒死養(yǎng)殖魚類或因用量不夠影響藥效，因此有必要篩選出適宜的指示生物用于評估硫酸銅的藥物濃度，為實(shí)際生產(chǎn)用藥提供指導(dǎo)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過不同條件下的硫酸銅急性毒性試驗(yàn)、藥效試驗(yàn)篩選出合適的魚類指示生物，并結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，設(shè)計一套合理的生物指示硫酸銅藥效的養(yǎng)殖病害防治辦法，以期達(dá)到科學(xué)合理用藥、保障水產(chǎn)品安全的目的，為促進(jìn)硫酸銅防病技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

硫酸銅（CuSO4·5H2O）購自上海埃彼化學(xué)試劑公司；麥穗魚（Pseudorasbora parva）、斑馬魚、高體鳑鲏（Rhodus ocellatus）、錦鯉、尼羅羅非魚（Tilapia niloticus）、鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）、草魚（Ctenopharynodon idellus）、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）等通過市場采購、江河采捕等方法引進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，按品種、合理密度隔離暫養(yǎng)于專用水泥池或水族箱中，保證充足溶氧、水質(zhì)清新，其水溫（23.0±0.5）℃，pH 7.3±0.2，以CaCO3計總堿度145±21 mg/L，以CaCO3計總硬度88±14 mg/L。每天投喂相當(dāng)于魚體重0.5%～1.0%的餌量，以30 min內(nèi)吃完為宜。投喂餌料為人工配合餌料，蛋白水平在20%以上。隔離暫養(yǎng)30 d后篩選健康無異常魚類進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)前3 d不再投喂餌料。主要儀器設(shè)備：生物顯微鏡（型號Eclipse50i，日本尼康公司）、便攜式水質(zhì)分析實(shí)驗(yàn)室（型號DR1900-05C，美國哈希公司）、溫度計、便攜式溶氧儀[型號YSI-550A，維賽儀器（北京）有限公司]、便攜式pH計（型號FG2-ELK，瑞士梅特勒—托利多集團(tuán)）、水族箱、單道可調(diào)量程移液器（型號Research Plus，德國艾本德股份公司）等。

1. 2 硫酸銅藥效測試

藥效試驗(yàn)在廣西柳州市漁業(yè)技術(shù)推廣站水生動物疫病防治實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，以人工感染多子小瓜蟲（Ichthyophthirius mulifiliis）、斜管蟲（Chilodonella cyprini）、車輪蟲（Trichodina spp.）的斑點(diǎn)叉尾鮰為研究對象，設(shè)養(yǎng)殖水體硫酸銅濃度為0.07、0.15、0.30、0.60和1.20 mg/L，放入人工感染后的斑點(diǎn)叉尾鮰各10尾，連續(xù)觀察15 d。每種寄生蟲設(shè)1個空白對照組，不進(jìn)行藥物處理。試驗(yàn)期間不喂料、不換水。

1. 3 不同硫酸銅濃度對不同魚類的急性毒性試驗(yàn)

采用靜水水生生物測試方法，設(shè)養(yǎng)殖水體硫酸銅濃度為0.30、0.60和1.20 mg/L，每個濃度處理分別放入麥穗魚（規(guī)格4.82±0.74 cm）、斑馬魚（規(guī)格3.44±0.67 cm）、高體鳑鲏（規(guī)格3.77±0.36 cm）、錦鯉（規(guī)格12.37±1.22 cm）、羅非魚（規(guī)格6.79±0.59 cm）、鰱魚（規(guī)格15.74±1.09 cm）、草魚（規(guī)格11.68±0.99 cm）、黃顙魚（規(guī)格8.26±0.71 cm）各30尾，期間統(tǒng)計24和96 h平均死亡率。每個濃度處理均設(shè)1個空白對照組。試驗(yàn)期間不喂料、不換水。

1. 4 不同溫度下硫酸銅對魚類的急性毒性試驗(yàn)

固定養(yǎng)殖水體硫酸銅濃度為0.60 mg/L，通過恒溫培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)水溫分別為（14.0±0.5）、（17.0±0.5）、（20.0±0.5）、（23.0±0.5）、（26.0±0.5）和（29.0±0.5）℃，每個溫度處理分別放入麥穗魚、高體鳑各30尾，期間統(tǒng)計24和96 h平均死亡率。每個溫度處理均設(shè)1個空白對照組。試驗(yàn)期間不喂料、不換水。

1. 5 硫酸銅對麥穗魚的急性毒性試驗(yàn)

設(shè)養(yǎng)殖水體硫酸銅濃度為0.07、0.15、0.30、0.60和1.20 mg/L，每個濃度處理分別放入30尾健康麥穗魚，每2 h觀察記錄1次，連續(xù)觀察24 h，期間按時段統(tǒng)計異常行為及平均死亡率。同時設(shè)1個空白對照組。試驗(yàn)期間不喂料、不換水。

1. 6 硫酸銅對不同時間段放入麥穗魚的急性毒性試驗(yàn)

設(shè)養(yǎng)殖水體硫酸銅濃度為0.30和0.60 mg/L，從配好濃度時間開始計，按0、1、2、4、8和16 h后放入30尾健康麥穗魚，每2 h觀察記錄1次，連續(xù)觀察24 h（按投放麥穗魚后開始計），期間統(tǒng)計24 h平均死亡率。同時設(shè)1個空白對照組。試驗(yàn)期間不喂料、不換水。

1. 7 池塘藥效試驗(yàn)

試驗(yàn)地點(diǎn)為廣西柳州市魚峰區(qū)洛維園藝場水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。選用的養(yǎng)殖池塘0.67 ha，放養(yǎng)有鯉魚、鯽魚、斑點(diǎn)叉尾鮰、鳙魚、鰱魚等品種，主養(yǎng)品種為鯉魚（規(guī)格100～200 g），養(yǎng)殖密度12000尾/ha。正暴發(fā)斜管蟲病，每天死亡魚數(shù)約30尾。采用硫酸銅進(jìn)行治療，施藥過程保持水體有效濃度在0.50～0.70 mg/L，每天施藥1次，連續(xù)2 d。上午10：00采用0.70 mg/L硫酸銅均勻潑灑池塘后，立即在池塘四周投放4個分別裝有10尾健康麥穗魚的聚乙烯密封網(wǎng)籠（30目），4 h內(nèi)密切觀察麥穗魚異常反應(yīng)和死亡情況，藥物治療期間，每天用生物顯微鏡檢查魚塘內(nèi)養(yǎng)殖魚類體表和鰓部寄生蟲情況2次。

2 結(jié)果與分析

2. 1 硫酸銅藥效測試結(jié)果

以0.30 mg/L以上硫酸銅處理人工感染車輪蟲的斑點(diǎn)叉尾鮰，可獲得良好的防治效果，藥物處理4 h后刮取魚體表黏液鏡檢，無車輪蟲活體檢出。以0.60 mg/L以上硫酸銅處理人工感染斜管蟲的斑點(diǎn)叉尾鮰，具有很好的防治效果，藥物處理4 h后刮取魚體表黏液鏡檢，無斜管蟲活體檢出；以0.07～0.30 mg/L硫酸銅進(jìn)行處理，對斜管蟲的殺滅效果不理想，15 d后魚體仍有大量斜管蟲寄生，且病魚死亡率在60.00%以上（表1）。以0.15 mg/L以上硫酸銅處理人工感染多子小瓜蟲的斑點(diǎn)叉尾鮰，即可獲得良好的防治效果；硫酸銅處理濃度為0.15～0.60 mg/L時，病魚身上白點(diǎn)在5 d后開始明顯減少，15 d后無多子小瓜蟲寄生。綜合考慮硫酸銅的防治效果及其成本，確定0.60 mg/L為實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下硫酸銅治療多子小瓜蟲、車輪蟲、斜管蟲等寄生蟲病的適宜濃度。

2. 2 魚類對不同硫酸銅濃度處理的急性毒性反應(yīng)

由表2可以看出，8種受試魚類在0.30、0.60和1.20 mg/L硫酸銅處理濃度下，只有麥穗魚和高體鳑鲏表現(xiàn)出敏感和異常行為反應(yīng)，死亡率在13.33%～100.00%，且以麥穗魚更明顯，因此可在短時間內(nèi)根據(jù)麥穗魚和高體鳑鲏的異常反應(yīng)及平均死亡率來判斷硫酸銅藥效區(qū)間范圍。

2. 3 不同溫度下硫酸銅對魚類的急性毒性作用

在不同溫度下麥穗魚、高體鳑鲏對硫酸銅耐受反應(yīng)結(jié)果見表3。在水溫14.0～26.0 ℃下，麥穗魚對0.60 mg/L硫酸銅有很好的敏感反應(yīng)，24 h內(nèi)即大部分死亡或出現(xiàn)劇烈應(yīng)激癥狀，死亡率在66.67%～100.00%；而高體鳑鲏敏感反應(yīng)一般，死亡率在0～26.67%。水溫超過26.0 ℃后，麥穗魚、高體鳑鲏對硫酸銅的耐受力隨溫度的升高而增強(qiáng)；而水溫低于26.0 ℃時麥穗魚、高體鳑鲏對于硫酸銅的耐受力隨溫度變化不明顯。

2. 4 不同濃度硫酸銅對麥穗魚的急性毒性作用

麥穗魚經(jīng)0.07 mg/L硫酸銅處理24 h內(nèi)無異常變化，經(jīng)0.15 mg/L硫酸銅處理4 h內(nèi)部分麥穗魚體色變深，其4、8、16和24 h平均死亡率分別為0、0、6.67%和13.33%；經(jīng)0.30 mg/L硫酸銅處理4 h內(nèi)部分麥穗魚有急游、翻轉(zhuǎn)身體、體色變深等不適反應(yīng)，24 h平均死亡率為33.33%；在0.60 mg/L硫酸銅濃度下，麥穗魚剛放入即表現(xiàn)出明顯的不適反應(yīng)，4 h平均死亡率為53.33%；經(jīng)1.20 mg/L硫酸銅處理4 h后麥穗魚全部死亡（表4）。說明麥穗魚對0.15 mg/L以上的硫酸銅濃度有明顯敏感反應(yīng)。

2. 5 硫酸銅對不同時段放入麥穗魚的急性毒性作用

由表5可知，在0.30 mg/L硫酸銅濃度處理下，藥物施放后立即放入麥穗魚和1 h后放入麥穗魚的24 h平均死亡率為33.33%，4和8 h后放入麥穗魚的24 h平均死亡率為13.33%，16 h后放入麥穗魚的24 h平均死亡率為零；在0.60 mg/L硫酸銅濃度處理下，藥物施放4 h后放入麥穗魚的24 h平均死亡率仍為80.00%，8 h后放入麥穗魚的24 h平均死亡率為66.67%，16 h后放入麥穗魚的24 h平均死亡率為16.67%。說明硫酸銅溶液配制后其藥效隨放置時間的增加而減弱。

2. 6 生物指示法評估體系的建立

在水溫低于26.0 ℃的情況下，本研究從麥穗魚、斑馬魚、高體鳑鲏、錦鯉、羅非魚、鰱魚、草魚、黃顙魚等8種供試水生動物中篩選出在硫酸銅殺蟲濃度區(qū)間內(nèi)敏感的指示生物是麥穗魚，并建立了一套硫酸銅藥效評估體系。評估體系主要是通過判斷和統(tǒng)計4 h內(nèi)麥穗魚的異常反應(yīng)及死亡情況，其間接指示硫酸銅藥效濃度情況見表6。

2. 7 池塘藥效試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)麥穗魚的生物指示評估方法，于上午10：00時全塘潑灑0.70 mg/L硫酸銅后在池塘四周立即投入4個裝有10尾健康麥穗魚的聚乙烯網(wǎng)籠進(jìn)行觀察判定，結(jié)果顯示4 h內(nèi)麥穗魚無反應(yīng)，故判定水體硫酸銅濃度受環(huán)境因素影響，當(dāng)次潑灑藥物藥效差。下午17：00時再次潑灑0.55 mg/L硫酸銅，池塘四周重新放置4個更換指示魚的網(wǎng)籠，其4、8和16 h平均死亡率為37.50%、37.50%和50.00%，判定硫酸銅濃度在0.30～0.60 mg/L，藥效較好，但因晚上不宜再次施藥，故當(dāng)日未進(jìn)行0.10～0.40 mg/L藥物二次處理。次日上午10：00時繼續(xù)采用0.70 mg/L硫酸銅均勻潑灑池塘，四周重新放置更換指示魚的網(wǎng)籠，其4、8和16 h平均死亡率分別為47.50%、55.00%和70.00%，判定硫酸銅濃度在0.60 mg/L左右，藥效理想而無需進(jìn)行藥物二次處理。療程結(jié)束后第2 d病魚死亡數(shù)量明顯減少，1周后無死亡現(xiàn)象發(fā)生；施藥期間隨機(jī)捕撈鯉魚采樣（鰓部和尾鰭）鏡檢，施藥當(dāng)天晚上蟲體明顯減少，第2 d下午開始無蟲體檢出。

3 討論

硫酸銅已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，常用劑量為0.50～0.70 mg/L（黃琪琰和宋承方，1992；周劍等，2014）。實(shí)驗(yàn)室條件下，以0.50～0.70 mg/L硫酸銅濃度治療魚類常見寄生蟲病如多子小瓜蟲、車輪蟲、斜管蟲等，治療效果良好。但在實(shí)際生產(chǎn)中，由于硫酸銅受水體多種因子影響，施藥濃度并不能達(dá)到實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的用藥濃度，造成治療效果不穩(wěn)定，養(yǎng)殖戶時常根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)盲目加大用量，毒死養(yǎng)殖魚類的案例時有發(fā)生，損失慘重。因此，急需一種有效、直觀的指示硫酸銅藥效方法來指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖科學(xué)用藥。Wu等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，暴露在0.20 mg/L銅離子水體中時，羅非魚鰓上的Na+-K+-ATPase（NKA）滲透調(diào)節(jié)功能會受到嚴(yán)重?fù)p害；而Hu等（2015）認(rèn)為1.53 mg/L以上的銅離子濃度才能造成魚類能量、氨基酸相關(guān)代謝的變化。這些方法都是采用原子吸收儀、核磁共振儀等進(jìn)行標(biāo)記物檢測，檢測工作僅適宜在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下操作，耗時長，測試的銅離子濃度范圍非常有限，不適用于實(shí)際生產(chǎn)。

Shao等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，異齒裂腹幼魚和拉薩裂腹幼魚暴露在銅離子水體中的96 h半數(shù)致死濃度分別為0.31和0.28 mg/L，即可通過這兩種指示魚尤其是拉薩裂腹幼魚來判斷生產(chǎn)養(yǎng)殖水體銅離子的安全濃度，但該研究缺乏進(jìn)一步闡述生產(chǎn)應(yīng)用方法。本研究通過篩選獲得0～1.20 mg/L硫酸銅濃度下有敏感反應(yīng)的指示魚類——麥穗魚。雖然國內(nèi)也有關(guān)于銅離子對麥穗魚的急性毒性研究，如宋維彥和解相林（2010）研究發(fā)現(xiàn)，銅離子對麥穗魚的24 h半數(shù)致死濃度為0.283 mg/L，說明麥穗魚對銅離子非常敏感；王曉南等（2013）研究表明，銅離子對麥穗魚的96 h半數(shù)致死濃度為0.101 mg/L，麥穗魚是環(huán)境監(jiān)測中較理想的指示生物，同時也是潛在的水質(zhì)基準(zhǔn)受試生物。但這些研究僅為某一溫度下的結(jié)果測試，對不同條件下銅離子毒性對麥穗魚產(chǎn)生的直觀影響沒有進(jìn)行更多描述，對生產(chǎn)用藥的指導(dǎo)意義不明顯。為此，本研究不僅探索硫酸銅對麥穗魚的急性毒性反應(yīng)，還結(jié)合不同濃度、不同溫度、不同時段麥穗魚的反應(yīng)情況作為評估依據(jù)，建立硫酸銅藥效濃度評估方法，且評估方法直觀、便捷、廉價、易于操作，對指導(dǎo)養(yǎng)殖戶科學(xué)判斷硫酸銅的有效濃度具有重要意義。

4 結(jié)論

麥穗魚可作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中硫酸銅治療寄生蟲病藥效濃度的指示生物，在保證溶氧的條件下于施藥后4 h內(nèi)投放麥穗魚進(jìn)行行為、異常情況觀察，可評估硫酸銅藥效濃度情況，為生產(chǎn)管理提供科學(xué)參考和用藥指導(dǎo)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）