楊家大　吳聲榕　潘盛榕

摘要：【目的】開展貴州地區(qū)不同山羊品種的黑皮質(zhì)素受體-3（MC3R）基因轉(zhuǎn)錄水平研究，為研究山羊MC3R的作用部位、特點及功能提供理論參考?！痉椒ā恳郧瓥|南小香羊、貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊和南江黃羊5個山羊品種為研究對象，利用雙標準曲線法和TaqMan實時熒光定量PCR對肝臟、腎臟、心臟、肺臟、背最長肌、半膜肌和皮下脂肪中MC3R基因的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測?！窘Y果】MC3R基因在山羊的心臟、肝臟、肺臟、腎臟、背最長肌、半膜肌、皮下脂肪中均轉(zhuǎn)錄成mRNA，其中在皮下脂肪、腎臟、肝臟高度轉(zhuǎn)錄，在肺臟中度轉(zhuǎn)錄，而在心臟、背最長肌、半膜肌中的轉(zhuǎn)錄水平較低。7個組織中，MC3R基因轉(zhuǎn)錄水平均以貴州白山羊最高。【結論】山羊MC3R基因的轉(zhuǎn)錄水平存在組織及品種間差異，在非肌肉類組織中的轉(zhuǎn)錄水平高于在肌肉類組織，且在貴州白山羊組織中轉(zhuǎn)錄水平高于其他品種，在今后研究MC3R基因與生長和肉質(zhì)性狀關聯(lián)性時應注意取材品種和部位對其轉(zhuǎn)錄水平的影響。

關鍵詞： 山羊；黑素皮質(zhì)素受體-3（MC3R）；轉(zhuǎn)錄水平；貴州

中圖分類號： S827.89 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0466-06

0 引言

【研究意義】黔東南小香羊、貴州白山羊、貴州黑山羊和黔北麻羊是貴州省的優(yōu)良山羊品種，南江黃羊是四川南江縣選育而成的肉用型山羊品種，這5個山羊品種對重巒疊嶂、山高谷深、溝壑縱橫的貴州高原山地有很好的適應性，可常年放牧，且育肥性能好，繁殖力強，肉質(zhì)優(yōu)良，是貴州存欄量較大的山羊品種。研究其生長及肉質(zhì)性狀的相關基因，對于發(fā)展貴州羊肉產(chǎn)業(yè)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】黑皮質(zhì)素受體（Melanocortin receptor，MCR）基因家族有5個成員，MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R。其中，MC3R是由單一外顯子編碼的包含323個氨基酸殘基的一種跨膜G蛋白耦聯(lián)受體，是MCR中最晚被克隆和鑒定的一個，具有降低攝食頻率控制采食行為、增加能量消耗調(diào)節(jié)能量平衡、減少脂肪貯量調(diào)節(jié)體重的功能（Singh et al.，2013；Okutsu et al.，2015；Yang et al.，2015），因此，MC3R基因常作為體重標記的候選基因。蘇毅（2006）研究發(fā)現(xiàn)雞MC3R基因1424 SNP位點與屠宰前體重和屠體重、胸肌重、腿肌重及腹脂重顯著相關；王彥等（2007）研究發(fā)現(xiàn)雞MC3R基因A1424G突變與屠體性狀、腹脂重、皮下脂肪顯著相關；李世鵬等（2008）研究發(fā)現(xiàn)石岐肉鴿MC3R基因T91G突變與活重、屠體重、全凈膛重顯著相關；杜鵬等（2010）研究發(fā)現(xiàn)比格犬MC3R基因T167A堿基置換對犬體重有顯著影響；張軼博和巴彩鳳（2013）研究發(fā)現(xiàn)北方實驗用犬MC3R基因A167T位點突變與其體重、胸圍和體重指數(shù)等顯著相關；薛倩等（2015）從京海黃雞的MC3R基因編碼區(qū)序列檢測到6個SNP位點，得到5種單倍型和11種單倍型組合，不同單倍型組合間京海黃雞屠體性狀（包括活體重、屠體重、胸肌重、腿肌重、全凈膛重、半凈膛重和腹脂重）存在顯著或極顯著差異；張心揚等（2015）在肉雞高、低脂雙向選擇品系的研究中發(fā)現(xiàn)MC3R基因C273T突變對第六世代和第八世代兩個群體的7周齡體重和屠體重有顯著影響?！颈狙芯壳腥朦c】目前國內(nèi)外關于山羊生長和肉質(zhì)相關基因的研究較多，但鮮見MC3R基因在不同山羊品種及其不同組織中轉(zhuǎn)錄水平的研究報道。【擬解決的關鍵問題】采用雙標準曲線和Taqman實時熒光定量PCR對黔東南小香羊、貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊和南江黃羊5個山羊品種的心臟、肝臟、肺臟、腎臟、背最長肌、半膜肌和皮下脂肪中MC3R基因轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，并分析MC3R基因在不同品種及組織間的表達差異，為深入研究山羊MC3R的作用部位、特點及功能提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

黔東南小香羊、貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊、南江黃羊的心臟、肝臟、肺臟、腎臟、背最長肌、半膜肌、皮下脂肪等組織采自貴州省雷山縣和榕江縣。每個品種4只，雌雄各2只，年齡5～7月齡，體重14～17 kg/只?？俁NA提取試劑Trizol購自上海英駿（Invitrogen）生物技術有限公司，標準品PCR試劑盒GeneSolution 2×Taq Master Mix購自上海碩盟生物科技有限公司，膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit和實時熒光定量PCR試劑盒Realtime PCR Master Mix購自東洋紡（上海）生物科技有限公司。主要儀器設備：H1650-W臺式微量高速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司），Eppendorf Centrifuge 5415D離心機（德國Eppendorf公司），Ultra Pure UF除熱源型超純水機（上海和泰儀器有限公司），F(xiàn)TC-3000實時熒光定量PCR系統(tǒng)（加拿大Funglyn Biotech公司），Eppendorf Research Plus移液器（德國Eppendorf公司），Mini Centrifuge八聯(lián)管離心機（Eppendorf公司），BIO-RAD Powerpac Basic電泳儀系統(tǒng)（BIO-RAD公司）。

1. 2 引物及探針

根據(jù)NCBI公布的山羊MC3R基因序列（XM_ 005688325.1）及β-actin基因序列（XM_005694067.1）設計標準品引物、定量引物及TaqMan探針（表1），并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。其中，探針的5'端標記FAM基團，3'端標記TAMRA基團。

1. 3 總RNA提取及cDNA合成

用Invitrogen Trizol RNA提取試劑盒提取各組織樣品的總RNA，再用ReverTra Ace qPCR RT Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程：0.1～2.0 μg總RNA加RNase-free ddH2O至14.0 μL，混勻，65 ℃變性5 min，冷卻。再加5×RT Buffer 4.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，RT Primer 1.0 μL，混勻，42 ℃逆轉(zhuǎn)錄18 min，然后98 ℃滅活5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 實時熒光定量標準品制備

PCR反應體系：2×Taq Master Mix 10.0 μL，10.0 μmol/L的標準品上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板 2.0 μL， RNase-free ddH2O 7.2 μL。擴增程序：94 ℃預變性90 s；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，進行40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，再用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，然后計算MC3R和β-actin基因的拷貝數(shù)濃度，并進行4倍梯度稀釋，即得到MC3R基因拷貝數(shù)濃度分別為6.78×1010、1.80×1010、5.29×109、1.32×109、3.31×108和8.27×107 Copies/μL的梯度定量標準品，及β-actin基因拷貝數(shù)濃度分別為3.53×107、8.82×106、2.21×106、5.51×105、1.38×105和3.45×104 Copies/μL的梯度定量標準品。

N= ×6.02×1023

式中，N為膠回收產(chǎn)物的拷貝數(shù)濃度（Copies/μL），C為質(zhì)量濃度（ng/μL），M為擴增片段的堿基對數(shù)。

1. 5 TaqMan實時熒光定量PCR檢測

利用FTC-3000實時熒光定量PCR儀和Realtime PCR Master Mix試劑盒對樣品進行實時熒光定量PCR檢測，每個樣品重復測定3次。PCR反應體系：2×Realtime PCR Master Mix 10.0 μL，10.0 μmol/L定量上、下游引物各0.8 μL，10.0 μmol/L TaqMan探針0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，RNase-free ddH2O 6.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，61 ℃ 60 s，進行40個循環(huán)。

1. 6 統(tǒng)計分析

儀器自動根據(jù)MC3R、β-actin基因標準品拷貝數(shù)的對數(shù)（以4為底）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）制作定量標準曲線，并擬合回歸方程。再根據(jù)回歸方程與樣品檢測得到的Ct，計算出待測樣品中的基因拷貝數(shù)。各樣品的MC3R基因轉(zhuǎn)錄水平是由MC3R基因的拷貝數(shù)除以β-actin基因的拷貝數(shù)計算得出，并利用SPSS 19.0軟件方差分析品種間或組織間的差異顯著性。方差不齊時，需先用平方根反正弦再開方[（sin-1 ）1/2]對數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換。

2 結果與分析

2. 1 標準品定量擴增產(chǎn)物的電泳結果

MC3R、β-actin基因定量標準品擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結果與預期結果相符（圖1）。

2. 2 TaqMan實時熒光定量PCR標準曲線

MC3R基因的TaqMan實時熒光定量PCR標準曲線回歸方程為y=-0.2845x+20.971，R2=0.9955（圖2）。β-actin基因的TaqMan實時熒光定量PCR標準曲線回歸方程為y=-0.371x+17.109，R2=0.9967（圖3）。

2. 3 MC3R基因轉(zhuǎn)錄水平

根據(jù)上述雙標準曲線，分別求出各樣品中MC3R和β-actin基因轉(zhuǎn)錄拷貝數(shù)，以β-actin基因為內(nèi)參，計算出山羊個體MC3R基因的轉(zhuǎn)錄水平，每個品種4個個體轉(zhuǎn)錄平均值即為該品種該組織的平均轉(zhuǎn)錄水平（表2）。5個山羊品種在組織中MC3R基因轉(zhuǎn)錄水平分析結果顯示，在心臟、肝臟、肺臟、腎臟、背最長肌、半膜肌、皮下脂肪中均有MC3R基因轉(zhuǎn)錄，但轉(zhuǎn)錄水平存在差異。組織間比較結果顯示，MC3R基因在皮下脂肪、腎臟、肝臟高度轉(zhuǎn)錄，在肺臟中度轉(zhuǎn)錄，但在心臟、背最長肌、半膜肌中的轉(zhuǎn)錄水平較低。品種間比較結果顯示，在心臟、肝臟、肺臟、腎臟、背最長肌、半膜肌和皮下脂肪中，MC3R基因轉(zhuǎn)錄水平均以貴州白山羊最高，顯著高于其他品種（P<0.05）。

3 討論

基因轉(zhuǎn)錄是實現(xiàn)從DNA到蛋白質(zhì)的重要環(huán)節(jié)，是遺傳型到表現(xiàn)型的重要過渡，研究基因的組織表達對了解基因的表達規(guī)律、蛋白質(zhì)的分泌部位及可能的功能位點具有重要意義。在某些特殊情況下（如蛋白含量低、功能活性不明顯、抗體獲得困難、假基因等），從mRNA水平檢測基因表達比從蛋白質(zhì)水平檢測更方便、靈敏。本研究所檢測5個山羊品種的心臟、肝臟等7個組織器官均有MC3R基因轉(zhuǎn)錄生成，與已有研究結果相似。如Rpselli-Rehfuss等（1993）認為，MC3R基因在外周組織中轉(zhuǎn)錄生成mRNA。Chhajlani等（1993）和Tao（2010）研究發(fā)現(xiàn)，MC3R基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大部分區(qū)域和一些邊緣組織包括胃腸道和胎盤中均轉(zhuǎn)錄。Abbott等（2000）研究表明，MC3R基因主要在下丘腦、丘腦、海馬、胎盤、小腸、胰腺、脂肪組織、骨骼肌、腎和心臟等組織中轉(zhuǎn)錄。Abdel-Malek（2001）研究發(fā)現(xiàn)，MC3R基因主要在下丘腦、丘腦、海馬、前杏仁核、皮質(zhì)、胎盤、胃、十二指腸、胰臟中轉(zhuǎn)錄。馮力等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，MC3R基因在脂肪組織、心臟、骨骼肌等組織中轉(zhuǎn)錄。MC3R基因在山羊的多種組織中轉(zhuǎn)錄，從轉(zhuǎn)錄水平說明山羊體內(nèi)MC3R的作用靶組織廣泛。

本研究結果顯示，MC3R基因在皮下脂肪、腎臟、肝臟中的轉(zhuǎn)錄水平高于心臟、背最長肌、半膜肌等肌肉組織，與何夏萍等（2013）研究發(fā)現(xiàn)性成熟長白豬的MC3R基因在大腦和脾臟高轉(zhuǎn)錄，在垂體、肺臟和腎臟低轉(zhuǎn)錄，在肌肉中檢測不到其轉(zhuǎn)錄的結果相似。不同組織器官中，不但MC3R基因轉(zhuǎn)錄水平不同，而且MC3R基因的主要功能作用也不同。謝建中等（2010）研究表明，在犬的下丘腦內(nèi)尤其在下丘腦腹內(nèi)側核、弓狀核和脊髓等部位，MC3R基因高轉(zhuǎn)錄，其主要功能是調(diào)節(jié)能量平衡；在心臟、腸、胎盤、巨噬細胞等外周組織細胞，MC3R基因也有轉(zhuǎn)錄，但其主要功能是維持體重穩(wěn)態(tài)，也調(diào)控某些炎性因子的分泌；張冬杰和劉娣（2012）研究發(fā)現(xiàn)，民豬腿肌內(nèi)MC3R基因在低溫冷誘導后轉(zhuǎn)錄明顯上升，據(jù)此推測民豬是通過上調(diào)MC3R基因的轉(zhuǎn)錄來增加能量消耗而抵御寒冷氣候。因此，在研究MC3R基因轉(zhuǎn)錄水平與體重、能量平衡等生長性狀和肉質(zhì)性狀的關聯(lián)性時，應考慮實驗取材部位對MC3R基因轉(zhuǎn)錄水平差異的影響。

本研究結果還顯示，MC3R基因在同一組織的轉(zhuǎn)錄水平存在品種間差異，貴州白山羊顯著高于其他品種。本課題組的前期研究（楊家大等，2015）結果表明，在黔東南小香羊、貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊和南江黃羊的腎臟、心臟、肺臟、背最長肌、半膜肌、皮下脂肪中，Leptin及MC4R基因的轉(zhuǎn)錄水平均以貴州白山羊最高，與本研究結果一致。MC3R、MC4R與Leptin的主要生物學功能十分相似，均具有調(diào)控攝食、能量平衡和體重的功能（Hoggard et al.，2004；戴漢川和龍良啟，2005；張軼博等，2005；蘇毅，2006）。Leptin是上游信號分子，MC3R和MC4R則是Leptin通路中的下游分子，也是Leptin受體的下游信號，Leptin信號通過MC3R、MC4R分子介導傳遞，最終調(diào)控動物的采食量、采食頻率和體重等（Benoit et al.，2000；Hoggard et al.，2004）。據(jù)此推測，正是由于Leptin與MC3R、MC4R間的協(xié)同關系，導致三者在5個山羊品種中的轉(zhuǎn)錄規(guī)律高度相似。貴州白山羊心臟、肝臟等7個組織MC3R基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于其他山羊品種，是否表明其肌內(nèi)脂肪蓄積低、肉質(zhì)風味遜色于其他山羊品種尚需進一步探究。

4 結論

山羊MC3R基因的轉(zhuǎn)錄存在品種及組織間差異，在非肌肉組織中的轉(zhuǎn)錄水平高于在肌肉組織，且貴州白山羊的轉(zhuǎn)錄水平高于其他山羊品種，在MC3R基因與生長和肉質(zhì)性狀關聯(lián)性研究中應注意取材品種和部位對其轉(zhuǎn)錄水平差異的影響。

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（責任編輯 陳 燕）