劉源　楊剛　張孝琴　楊學(xué)武

摘要：【目的】優(yōu)化微波協(xié)同復(fù)合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的工藝條件，為提高虎掌菌多糖提取率提供新的工藝技術(shù)?！痉椒ā恳愿首位⒄凭鸀樵囼?yàn)材料、多糖提取率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法優(yōu)化微波協(xié)同復(fù)合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的工藝條件?！窘Y(jié)果】影響微波協(xié)同復(fù)合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的因素順序?yàn)椋簭?fù)合酶用量>酶解溫度>微波功率>微波時(shí)間，復(fù)合酶用量和酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響極顯著（P<0.01），酶解溫度與微波時(shí)間兩因素交互作用影響顯著（P<0.05），其最佳提取工藝條件為：纖維素酶與木瓜蛋白酶的復(fù)合酶質(zhì)量比1∶1、復(fù)合酶用量0.70%、 pH 5.0、酶解溫度51 ℃、微波時(shí)間4.3 min、微波功率550 W，在此條件下的虎掌菌多糖提取率為16.09%，與模型預(yù)測值16.2537%的相對(duì)誤差為1.02%，誤差較小?！窘Y(jié)論】建立的模型對(duì)甘孜虎掌菌多糖具有較好的預(yù)測作用，優(yōu)化的工藝參數(shù)可用于實(shí)際生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞： 虎掌菌；多糖；響應(yīng)面法；微波協(xié)同復(fù)合酶法；甘孜

中圖分類號(hào)： S646.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）03-0442-07

0 引言

【研究意義】虎掌菌（Sarcodon imbricatus）又稱獐子菌、翹鱗肉齒菌，其子實(shí)體中等至大型，表面有暗灰色至黑褐色大鱗片。中醫(yī)認(rèn)為，虎掌菌性平味甘，具有追風(fēng)散寒、降低膽固醇等作用，同時(shí)具有益氣補(bǔ)氣、治風(fēng)破血、和胃通便、降血壓、解食物之毒、治頭痛頭昏等功效（趙雨霽和王琦，2014）。已有研究表明，虎掌菌多糖具有抗腫瘤、抗氧化及抑菌活性等作用（才媛，2013；丁祥等，2015）。虎掌菌主要分布于云南省楚雄州和麗江縣，目前對(duì)云南野生虎掌菌的研究較多（杜萍等，2010；王雪冰，2011）；但海拔3500 m以上的川西高原每年也出產(chǎn)此菌，據(jù)調(diào)查四川甘孜州的野生虎掌菌年生長量超300 t，其年產(chǎn)量與云南相當(dāng)，也是我國虎掌菌的主產(chǎn)區(qū)之一（陳杭等，2014）。由于開發(fā)較晚，目前尚無甘孜虎掌菌的研究報(bào)道。因此，研究甘孜虎掌菌的多糖提取工藝，對(duì)真菌多糖的藥用開發(fā)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】近年來，真菌多糖的提取已由傳統(tǒng)水提醇沉法轉(zhuǎn)為酶解法、超聲波和微波輔助提取。微波協(xié)同酶法提取真菌多糖，是利用酶對(duì)細(xì)胞壁的破壞，結(jié)合微波的高能，促使目標(biāo)物進(jìn)入溶劑，從而提高提取率。苗曉燕等（2012）利用微波協(xié)同纖維素與果膠酶的復(fù)合酶提取猴頭菌絲體多糖，在復(fù)合酶用量1%、pH 4.2、水浴溫度50 ℃、酶解時(shí)間30 min、微波功率500 W、微波時(shí)間3 min、料液比1∶50的條件下得到多糖提取率為8.01%；黃瓊和丁玲（2013）采用微波協(xié)同果膠酶提取金針菇多糖，得到提取率為21.76%，比單一微波法提取率提高了13.95%；汪振炯等（2014）對(duì)蛹蟲草菌絲體采用纖維素酶協(xié)同微波法提取，得到18.45%的蛹蟲草基質(zhì)多糖。關(guān)于云南虎掌菌多糖提取工藝的研究也有一些文獻(xiàn)報(bào)道，王雪冰（2011）采用水提、酸堿浸提、酶解、超聲波、微波、超臨界萃取等6個(gè)單一工藝提取云南虎掌菌多糖，并比較不同方法在多糖提取工藝中的利弊；之后，王雪冰等（2011）采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化水法提取云南野生虎掌菌多糖的工藝條件，得出最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間3.25 h、提取溫度94 ℃、水料比45.5∶1，在此條件下，虎掌菌多糖提取率為9.14%；韋丁（2011）利用熱水回流提取法得到黑虎掌菌多糖提取率為2.29%。【本研究切入點(diǎn)】目前關(guān)于微波協(xié)同復(fù)合酶法提取虎掌菌多糖的研究尚未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以甘孜虎掌菌為試驗(yàn)材料，以多糖提取率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法優(yōu)化微波協(xié)同復(fù)合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的工藝條件，為提高虎掌菌多糖提取率提供新的工藝技術(shù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

虎掌菌采自四川省甘孜州稻城縣色拉鄉(xiāng)，經(jīng)清水洗凈后晾干、粉碎，過50目篩備用。纖維素酶（酶活單位≥50 U/mg，最適溫度30～60 ℃，最適pH 4.0～6.5）購自江蘇銳陽生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活單位≥100 U/mg，最適溫度50～60 ℃，最適pH 5.0～7.5）購自南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；葡萄糖、硫酸、苯酚、丙酮、乙醚、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、MCR-3S微波爐（西安予輝儀器有限公司）、SP-1901型紫外可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）、FW80-1粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州智博瑞儀器制造有限公司）。

1. 2 多糖提取工藝流程

準(zhǔn)確稱取甘孜虎掌菌子實(shí)體干粉→添加一定量復(fù)合酶→加入50%乙醇溶解→調(diào)節(jié)pH→控制酶解溫度→進(jìn)行微波處理→水浴鍋酶解1 h→90 ℃滅酶30 min→抽濾→定容→計(jì)算提取率。

1. 3 提取工藝最佳參數(shù)確定

在單因素試驗(yàn)中，以分析純葡萄糖為對(duì)照，依次改變不同酶的質(zhì)量比、復(fù)合酶用量、微波時(shí)間、微波功率、pH、酶解溫度，以虎掌菌多糖提取率為考察指標(biāo)進(jìn)行分析。結(jié)合實(shí)際工藝過程的條件，確定最佳參數(shù)再進(jìn)行響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

1. 4 多糖提取率測定

以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得回歸方程：y=0.00631x-0.028（R=

0.9992）。

多糖提取率（%）=提取得到的多糖質(zhì)量/原料總質(zhì)量×100

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 1. 1 不同酶質(zhì)量比對(duì)甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定pH 5.5、酶解溫度50 ℃、微波時(shí)間3.0 min、微波功率600 W的條件下，分別添加酶總用量為0.5%的纖維素酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶與木瓜蛋白酶組成的復(fù)合酶（質(zhì)量比1∶2、1∶1、2∶1），結(jié)果見圖1。復(fù)合酶的甘孜虎掌菌多糖提取率均高于單一酶的多糖提取率，且以復(fù)合酶質(zhì)量比為1∶1的多糖提取率最高（15.42%），顯著高于單一酶的多糖提取率（P<0.05，下同），但單一酶的多糖提取率與復(fù)合酶質(zhì)量比為1∶2和2∶1的多糖提取率間無顯著差異（P>0.05，下同）。最終選擇纖維素酶與木瓜蛋白酶以質(zhì)量比1∶1組成的復(fù)合酶進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2. 1. 2 復(fù)合酶用量對(duì)甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定pH 5.5、酶解溫度50 ℃、微波時(shí)間3.0 min、微波功率600 W的條件下，分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的復(fù)合酶，結(jié)果見圖2。隨著復(fù)合酶用量的增加，甘孜虎掌菌多糖提取率逐漸升高，復(fù)合酶用量為0.6%時(shí)達(dá)最大值，顯著高于復(fù)合酶用量0.2%和0.4%的提取率；繼續(xù)增加復(fù)合酶用量，多糖提取率有所下降，但用量在0.6%～1.0%的提取率間無顯著差異。最終選擇0.4%、0.6%、0.8%的復(fù)合酶用量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2. 1. 3 酶解溫度對(duì)甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定復(fù)合酶用量0.5%、pH 5.5、微波時(shí)間3.0 min、微波功率600 W的條件下，設(shè)置不同酶解溫度分別為35、40、45、50、55和60 ℃，結(jié)果見圖3。甘孜虎掌菌多糖提取率隨著酶解溫度的升高而逐漸增大，當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)達(dá)最大值，40～60 ℃的多糖提取率無顯著差異，但在50 ℃后呈下降趨勢。最終選擇酶解溫度45、50、55 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2. 1. 4 微波時(shí)間對(duì)甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定復(fù)合酶用量0.5%、pH 5.5、酶解溫度50 ℃、微波功率600 W的條件下，設(shè)置不同微波時(shí)間分別為1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 min，結(jié)果見圖4。甘孜虎掌菌多糖提取率隨著微波時(shí)間的延長而逐漸升高，當(dāng)微波時(shí)間超過3.0 min后，多糖提取率間無顯著性差異，4.0 min后提取率略有下降。最終選擇微波時(shí)間3.0、4.0、5.0 min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2. 1. 5 微波功率對(duì)甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定復(fù)合酶用量0.5%、pH 5.5、酶解溫度50 ℃、微波時(shí)間3.0 min的條件下，設(shè)置不同微波功率分別為500、550、600、650和700 W，結(jié)果見圖5。甘孜虎掌菌多糖提取率隨著微波功率的增大逐漸升高，當(dāng)微波功率為550 W時(shí)達(dá)最大值，除與600 W間無顯著性差異外，與其他微波功率均有顯著性差異，超過550 W后，多糖提取率快速下降。最終選擇微波功率500、550、600 W進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2. 1. 6 pH對(duì)甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定復(fù)合酶用量0.5%、酶解溫度50 ℃、微波功率600 W、微波時(shí)間3.0 min的條件下，設(shè)置不同pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，結(jié)果見圖6。甘孜虎掌菌多糖提取率在酸性較大的情況下（pH 4.0～4.5）有顯著性差異，但隨著pH的增加，在4.5～7.0范圍內(nèi)無顯著變化，因此選擇pH 5.0（提取率為最大值）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2. 2 響應(yīng)面法優(yōu)化甘孜虎掌菌多糖提取工藝

2. 2. 1 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Design-Expert 8.0.6 軟件的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，確定纖維素酶與木瓜蛋白酶的復(fù)合酶質(zhì)量比1∶1、pH 5.0，以復(fù)合酶用量、酶解溫度、微波時(shí)間和微波功率為主要因素，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平編碼見表1。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果（表2）進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到模型的擬合曲線方程為：Y=15.78+1.29A+0.76B+0.21C-0.46D-0.27AB+

0.13AC+0.022AD+1.06BC-0.44BD-0.47CD-1.32A2-

1.85B2-1.04C2-2.38D2。

對(duì)模型的回歸系數(shù)和方差分析結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，由表3可知，該模型的P=0.0001<0.05，表明該模型的回歸方程具有顯著性。各因素對(duì)甘孜虎掌菌多糖提取率影響排序?yàn)椋篈>B>D>C，其中，交互項(xiàng)BC作用顯著，一次項(xiàng)A、B和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2作用極顯著（P<0.01）。在P<0.05顯著水平下剔除不顯著項(xiàng)后，對(duì)模型式進(jìn)行優(yōu)化，其結(jié)果為：Y=15.78+1.29A+0.76B+ 1.06BC-1.32A2-1.85B2-1.04C2-2.38D2。

2. 2. 2 響應(yīng)面分析因素間的交互作用 根據(jù)擬合回歸方程，繪制兩個(gè)交互項(xiàng)的響應(yīng)面圖（圖7），以考察其對(duì)甘孜虎掌菌多糖提取率的影響。響應(yīng)曲面坡度較平滑，說明響應(yīng)值受各變量變化的影響較??；反之，響應(yīng)曲面坡度較陡峭，則說明響應(yīng)值受變量交互作用較為明顯。由圖7可知，酶解溫度與微波時(shí)間之間存在顯著的交互作用，而復(fù)合酶用量與酶解時(shí)間、微波時(shí)間、微波功率之間的交互作用，以及酶解溫度與微波功率、微波時(shí)間與微波功率間的交互作用不顯著，與響應(yīng)面方差分析結(jié)果相一致。

2. 2. 3 最佳提取條件的確定和驗(yàn)證 利用Design- Expert 8.0.6軟件得到優(yōu)化的提取工藝為：復(fù)合酶用量0.69%、酶解溫度51.37 ℃、微波時(shí)間4.30 min、微波功率542.57 W，在此條件下甘孜虎掌菌多糖提取率的預(yù)測值為16.2537%。綜合考慮多糖提取率和試驗(yàn)可操作性等因素，修正最佳工藝條件為：纖維素酶與木瓜蛋白酶的復(fù)合酶質(zhì)量比1∶1、復(fù)合酶用量0.70%、pH 5.0、酶解溫度51 ℃、微波時(shí)間4.3 min、微波功率550 W，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)際測定值為16.09%，相對(duì)誤差為1.02%。表明該模型推測得到的最佳工藝參數(shù)對(duì)實(shí)際的預(yù)測較可靠，有一定指導(dǎo)意義。

3 討論

目前，關(guān)于云南虎掌菌的多糖提取多采用單一工藝完成。王雪冰（2011）采用水提醇沉法提取云南黑虎掌菌多糖的提取率為9.01%，采用微波輔助提取多糖的提取率為16.92%；韋?。?011）利用熱水回流提取黑虎掌菌多糖的提取率為為2.29%。比較發(fā)現(xiàn)水提醇沉法耗時(shí)多，提取率低；單一微波法的提取率較高，但易破壞活性成分。微波協(xié)同復(fù)合酶法提取真菌多糖，選擇適宜的復(fù)合酶配比，使植物細(xì)胞壁降解，讓多糖成分充分釋放，從而提高提取率，目前此法已廣泛應(yīng)用于真菌多糖的提?。ㄖ觳势胶托ぶ敲簦?011；苗曉燕等，2012；黃瓊和丁玲，2013）。本研究采用微波協(xié)同復(fù)合酶法從甘孜野生虎掌菌中提取多糖，通過6個(gè)單因素考察試驗(yàn)，結(jié)合Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)建立了4因素3水平試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在?yōu)化的工藝條件下得到多糖提取率為16.09%，較采用水提醇沉法（王雪冰，2011）、熱水回流法（韋丁，2011）的提取率高，也高于同屬野生竹蓀菌托（吳雪艷等，2015）和青頭菌（王靜等，2015）的多糖提取率?？梢?，甘孜虎掌菌多糖含量較高，采用微波協(xié)同復(fù)合酶法提取甘孜虎掌菌多糖可有效提高提取率。

在本研究中，單因素和兩因素交互作用對(duì)甘孜虎掌菌多糖提取率的影響表現(xiàn)為：復(fù)合酶用量>酶解溫度>微波功率>微波時(shí)間，其中復(fù)合酶用量和酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響極顯著，酶解溫度與微波時(shí)間兩因素交互作用影響顯著，與黃瓊和丁玲（2013）的研究結(jié)果一致。在微波協(xié)同復(fù)合酶法提取多糖的工藝中，還存在其他影響因素，如料液比、酶解時(shí)間、提取次數(shù)、其他生物酶的選擇等，下一步將綜合考察這些因素，得出更優(yōu)的提取方案，以期獲得更高的提取率。

4 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化微波協(xié)同復(fù)合酶法提取甘孜虎掌菌多糖工藝，得到最佳提取工藝條件為：纖維素酶與木瓜蛋白酶的復(fù)合酶質(zhì)量比1∶1、復(fù)合酶用量0.70%、 pH 5.0、酶解溫度51 ℃、微波時(shí)間4.3 min、微波功率550 W，在此條件下的多糖提取率為16.09%，與模型預(yù)測值16.2537%的相對(duì)誤差為1.02%。表明建立的模型對(duì)甘孜虎掌菌多糖具有較好的預(yù)測作用，優(yōu)化的工藝參數(shù)可用于實(shí)際生產(chǎn)。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）