楊軍　徐吉　宋一鳴　朱堅

摘要：【目的】鑒定灰樹花交配型，為灰樹花雜交育種提供理論依據(jù)。【方法】灰樹花孢子萌發(fā)后挑取單孢進(jìn)行鏡檢，收集孢子單核體；采用原生質(zhì)體單核化獲得原生質(zhì)體單核體并通過互配確定標(biāo)準(zhǔn)測交菌株T1和T2；采用標(biāo)準(zhǔn)測交菌株與孢子單核體配對及孢子單核體互配后，進(jìn)行孢子單核體交配型分類，并利用核遷移試驗和OWE-SOJ技術(shù)鑒定孢子單核體交配型?！窘Y(jié)果】分離鑒定獲得71株灰樹花孢子單核體菌株，原生質(zhì)體單核化獲得17株原生質(zhì)體單核體菌株，其中標(biāo)準(zhǔn)測交菌株T1（A1B1）10株、T2（A2B2）7株；鑒定71株孢子單核體分別為T1、T2、T3和T4型，其中T1型28株、T2型35株、T3型 4株、T4型4株；核遷移試驗鑒定T1、T2、T3和T4的交配型分別為A1B1、A2B2、A2B1和A1B2，OWE-SOJ鑒定結(jié)果分別為A1B1、A2B2、A1B2和A2B1。【結(jié)論】灰樹花屬于四極性交配型系統(tǒng)，其交配型分析應(yīng)以核遷移試驗為準(zhǔn)，OWE-SOJ技術(shù)不適用于灰樹花的交配型分析。

關(guān)鍵詞： 灰樹花；單核體；OWE-SOJ技術(shù)；核遷移試驗；交配型

中圖分類號： S646.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0412-07

0 引言

【研究意義】灰樹花（Grifola frondosa）又名貝葉多孔菌、蓮花菇、舞茸（日本）等，分類學(xué)上隸屬于真菌門、擔(dān)子菌綱、無褶菌目、多孔菌科、樹花菌屬，是食、藥兼用蕈菌（徐錦堂，1997）?；覙浠ㄊ澄鄂r美，富含多種維生素、礦物質(zhì)及生物活性物質(zhì)，其多糖具有抗腫瘤、改善免疫系統(tǒng)、抗HIV病毒、調(diào)節(jié)血糖和血脂及膽固醇水平等作用（李小定等，2003），具有極高的利用價值，市場上對其需求量不斷增加。有性生殖對食用菌子實體發(fā)育和種群多樣性及其雜交育種非常重要，學(xué)者對食用菌交配系統(tǒng)及交配行為的研究從未間斷，但對灰樹花的交配型分析未見報道。因此，鑒定灰樹花交配型及其交配型系統(tǒng)，對選育更優(yōu)良高產(chǎn)的灰樹花品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，有關(guān)灰樹花的研究主要集中在活性成分方面（郭予斌等，2011；王帥和李杰，2014；朱小華等，2014），遺傳育種方面的研究較少（徐志祥等，2004；劉振偉和史秀娟等，2005；郭家瑞等，2010）。林芳燦等（2000）、程莉等（2007）、陳裕新等（2012）研究表明，OWE-SOJ技術(shù)可應(yīng)用于香菇、側(cè)耳、靈芝等食、藥用菌的交配型分析。針對交配型研究，李安政和林芳燦（2013）認(rèn)為，除在核遷移發(fā)生部位、范圍不規(guī)則時應(yīng)注意對交配型結(jié)果進(jìn)行審慎分析和驗證外，核遷移試驗是交配型因子鑒定中一種便捷而準(zhǔn)確的研究手段。有關(guān)食用菌交配型的研究結(jié)果顯示，黑木耳（張紅等，2002）、大球蓋菇（汪虹和曹暉，2006）、金福菇（傅俊生等，2007）和雞腿菇（尹清玉和李林輝，2008）等菌類是四極性交配型系統(tǒng)?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關(guān)于灰樹花交配型鑒定的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在借鑒其他食用菌交配型研究的基礎(chǔ)上，分離、鑒定灰樹花孢子單核體極性，并利用核遷移試驗和OWE-SOJ技術(shù)準(zhǔn)確鑒定其交配型，為灰樹花雜交育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 菌株 供試菌株庫藏編號Gr0001+3源自東北食藥用菌研究所的白灰樹花，由福建省食用菌種質(zhì)資源保藏管理中心提供。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g。原種培養(yǎng)基（質(zhì)量比）：木屑75.0%（粗∶細(xì)=1∶2），麥麩8.0%，玉米粉15.0%，蔗糖1.0%，石膏1.0%，配方水含量65.0%。栽培袋培養(yǎng)基（質(zhì)量比）：木屑45.0%（粗∶細(xì)=1∶3），棉籽殼30.0%，麥麩8.0%，玉米粉15.0%，過磷酸鈣1.0%，蔗糖1.0%，配方水含量65.0%。MYG再生培養(yǎng)基：麥芽糖5.0 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖10.0 g，維生素B1 30.0 mg，溶于1.0 L 0.6 mol/mL甘露醇。OWE培養(yǎng)基：5.0%橡樹木屑浸汁200.0 mL，瓊脂20.0 g，加蒸餾水定容至1.0 L。SOJ培養(yǎng)基：鮮榨橘汁200.0 mL，瓊脂20.0 g，加蒸餾水定容至1.0 L。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 灰樹花栽培 在23～25 ℃下菌絲走菌滿袋后、原基開始形成時移入特定條件菇房出菇。菇房條件：溫度16～18 ℃，濕度85%～95%，光照強(qiáng)度200～500 lx，二氧化碳濃度不高于1000 mg/L。形成豬腦狀原基時，開袋出菇。

1. 2. 2 孢子單核體分離、鑒定 摘取已成熟的灰樹花子實體，用75%酒精噴灑消毒，在超凈工作臺上用滅菌鑷子撕取灰樹花菇片置于已滅菌的硫酸紙上，菇片具菌管一面朝下。待彈孢24 h后，自封袋收集硫酸紙密封，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用移液槍吸取少量無菌水在硫酸紙孢子印處吸打，制成擔(dān)孢子懸液，經(jīng)梯度稀釋至10-3，每個梯度吸取100 μL擔(dān)孢子液涂布于抗性培養(yǎng)基上（100 μL氨芐西林/100 mL培養(yǎng)基），25 ℃暗培養(yǎng)。1周后待小菌落陸續(xù)出現(xiàn)即在顯微鏡下挑取新萌發(fā)菌絲或大菌落邊緣的尖端菌絲，轉(zhuǎn)接到PDA試管斜面培養(yǎng)基上。待菌絲長成一定大小的菌落后鏡檢，將無鎖狀聯(lián)合的菌株保藏備用。

1. 2. 3 原生質(zhì)體單核化和標(biāo)準(zhǔn)測交菌株確定 轉(zhuǎn)接菌株Gr0001+3的菌絲于液體PDA培養(yǎng)基，25 ℃搖床培養(yǎng)7 d，以0.6 mol/mL甘露醇作滲透壓穩(wěn)定劑，采用2%真菌溶壁酶于pH 5.5和30 ℃下酶解5 h（薛平海等，2004）。獲得原生質(zhì)體后，于MYG再生培養(yǎng)基上涂布再生，25 ℃培養(yǎng)3 d，在顯微鏡下挑取剛萌發(fā)的原生質(zhì)體并轉(zhuǎn)移至PDA斜面繼續(xù)培養(yǎng)。鏡檢觀察并選取單核化菌絲（無鎖狀聯(lián)合）保藏備用。

任取一株原生質(zhì)體單核化菌株與余下所有菌株配對，凡能與該菌株配對形成鎖狀聯(lián)合的歸為一類，記為T1；凡不能與該菌株配對形成鎖狀聯(lián)合的歸為另一類，記為T2。指定T1的交配型為A1B1，T2的交配型為A2B2，T1、T2即為所需的標(biāo)準(zhǔn)測交菌株。

1. 2. 4 孢子單核體4類交配型確定 分別從T1和T2中任取一株菌株與所有孢子單核體菌株配對，凡能與T1菌株配對形成鎖狀聯(lián)合的菌株記為T2，能與T2菌株配對形成鎖狀聯(lián)合的菌株記為T1；從與T1、T2配對均不能形成鎖狀聯(lián)合的菌株中任取一株，與剩余菌株配對，凡能配對形成鎖狀聯(lián)合的菌株記為T3，不能形成鎖狀聯(lián)合的菌株記為T4。

1. 2. 5 OWE-SOJ技術(shù)應(yīng)用 利用對峙培養(yǎng)，將4種交配型T1、T2、T3及T4菌株兩兩對峙接種于OWE培養(yǎng)基上，兩接種塊間相距約0.5 cm，25 ℃下對峙培養(yǎng)1周。當(dāng)接種塊間菌絲接觸后，將兩接種塊沿配對區(qū)垂直方向整條切塊，并轉(zhuǎn)接至SOJ培養(yǎng)基上。25 ℃下培養(yǎng)10～15 d觀察菌落形態(tài)。出現(xiàn)無鎖狀聯(lián)合的絨毛狀菌落，則為A=B≠反應(yīng)；出現(xiàn)無鎖狀聯(lián)合的柵欄型菌落，則為A≠B=反應(yīng)。

1. 2. 6 核遷移試驗 從4組孢子單核菌株T1、T2、T3及T4中，每組取數(shù)個單核體進(jìn)行核遷移試驗。第一次配對按T1×T3、T1×T4、T2×T3和T2×T4組合配對。兩配對菌塊間相距約2.0 cm，培養(yǎng)至菌絲接觸后，在配對塊外側(cè)各取一菌塊分別與相應(yīng)單核體進(jìn)行二次配對。以鏡檢觀察有無鎖狀聯(lián)合形成來判斷有無核遷移現(xiàn)象發(fā)生。凡二次配對產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合，表明相應(yīng)的第一次配對有核遷移發(fā)生，其交配反應(yīng)為A=B≠；凡二次配對無鎖狀聯(lián)合產(chǎn)生，表明相應(yīng)的第一次配對無核遷移發(fā)生，其交配反應(yīng)為A≠B=。據(jù)此確定T1與T3間交配型關(guān)系是A=B≠或A≠B=；同理，可鑒定對應(yīng)的T1與T4間、T2與T3間、T2與T4間的交配型關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2. 1 灰樹花菌株原生質(zhì)體單核體鑒定及標(biāo)準(zhǔn)測交菌株T1、T2確定

對供試菌株Gr0001+3的菌絲進(jìn)行原生質(zhì)體單核化（圖1），在其萌發(fā)的不同時間點挑取再生原生質(zhì)體，共獲得再生菌株35株，經(jīng)鏡檢確認(rèn)其中17株為單核體（表1）。將確認(rèn)的17株單核體相互配對后獲得兩種交配型菌株，其中10株為T1型（即交配型為A1B1），7株為T2型（即交配型為A2B2）。

2. 2 灰樹花標(biāo)準(zhǔn)菌株T3、T4確定及孢子單核體交配型常規(guī)分析

收集菌株Gr0001+3的孢子并分離鑒定獲得71株單核體（圖2）。通過與標(biāo)準(zhǔn)測交菌株T1、T2分別配對發(fā)現(xiàn)，其中28株單核體為T1型，35株單核體為T2型，余下8株單核體菌株互配，4株為T3型，4株為T4型。將所有的單核體分為T1、T2、T3和T4 4種類型，其各自所占比例分別為39.4%、49.3%、5.6%和5.6%（表2）。

2. 3 4類孢子單核體菌株交配型的準(zhǔn)確鑒定

2. 3. 1 OWE-SOJ技術(shù)與交配型的準(zhǔn)確鑒定 從4種類型孢子單核體菌株中每組隨機(jī)取3株[T1（3、12、69），T2（5、24、37），T3（34、48、64），T4（16、56、79）]，通過OWE-SOJ技術(shù)進(jìn)行6種組合配對（T1×T2，T3×T4，T1×T3，T2×T4，T2×T3，T1×T4），并觀察分析上述54個配對在SOJ培養(yǎng)基上的反應(yīng)情況，結(jié)果出現(xiàn)3種特征反應(yīng)（圖3）。由表3可知，在6種配對組合中，T1×T2和T3×T4的菌絲反應(yīng)均為一致的“+”反應(yīng)，進(jìn)一步確認(rèn)T1組與T2組、T3組與T4組均為A≠B≠；T1×T3以“F”反應(yīng)占多數(shù)（8個“F”反應(yīng)，1個不典型“F-”反應(yīng)），T2×T4以“F”反應(yīng)稍占優(yōu)勢（5個“F”反應(yīng)，4個不典型“F-”反應(yīng)）；T2×T3以“B”反應(yīng)占多數(shù)（7個“B”反應(yīng)，2個不典型“B-”反應(yīng)），T1×T4以“B”反應(yīng)稍占優(yōu)勢（5個“B”反應(yīng)，4個不典型“B-”反應(yīng)）。從反應(yīng)結(jié)果可以看出一種趨勢，即T1×T3、T2×T4屬于“F”反應(yīng)；T2×T3和T1×T4屬于“B”反應(yīng)。

因此，在指定T1和T2的交配型分別為A1B1和A2B2的情況下，可推斷T3的交配型為A1B2、T4的交配型為A2B1。

2. 3. 2 核遷移試驗與交配型的準(zhǔn)確鑒定 已指定T1（3、12、69）和T2（5、24、37）的交配型分別為A1B1和A2B2，經(jīng)核遷移試驗，通過216組二次配對，發(fā)現(xiàn)第一次配對中T1與T4、T2與T3分別發(fā)生了核遷移，而T1與T3、T2與T4均未發(fā)生核遷移。若第一次配對有核遷移發(fā)生，其交配反應(yīng)為A=B≠，若無核遷移發(fā)生，其交配反應(yīng)為A≠B=。據(jù)此推測T3（34、48、64）、T4（16、56、79）的交配型分別為A2B1和A1B2。

2. 3. 3 交配型的鑒定結(jié)果 通過OWE-SOJ技術(shù)和核遷移試驗，發(fā)現(xiàn)兩種方法鑒定出的交配型不一致。OWE-SOJ技術(shù)鑒定T1、T2、T3及T4的交配型分別為A1B1、A2B2、A1B2和A2B1，而核遷移試驗鑒定T1、T2、T3和T4的交配型分別為A1B1、A2B2、A2B1和A1B2。鑒于核遷移試驗是常規(guī)鑒定方法，OWE-SOJ技術(shù)是一種輔助驗證手段，因此以核遷移試驗結(jié)果為準(zhǔn)（表4）。

3 討論

本研究中灰樹花親本型單核體菌株T1和T2的數(shù)量占T1、T2、T3和T4 4種類型孢子單核體菌株總數(shù)的88.7%，可能與親本型孢子比非親本型孢子更易萌發(fā)或交配型因子發(fā)生了偏分離現(xiàn)象有關(guān)，此偏分離現(xiàn)象也存在于香菇（程水明和林范學(xué)，2007）和楊柳田頭菇（張小雷等，2012）等菇類中。

灰樹花菌株Gr0001+3的原生質(zhì)體再生率較低，其原生質(zhì)體單核化率僅48.57%，與潘迎捷等（1993）對異宗結(jié)合食用菌的研究結(jié)果基本相符。林芳燦和朱勤釗（1993）研究指出，原生質(zhì)體的分離主要取決于細(xì)胞的生理狀態(tài)、裂解酶和滲透穩(wěn)定劑；潘迎捷等（1993）研究指出，形成雙核體、單核體和無核體3種原生質(zhì)體是造成原生質(zhì)體再生率較低的主要原因；此外，挑取再生菌落的時機(jī)也很重要，一般雙核體萌發(fā)快于單核體。本研究也獲得了相似的結(jié)果。

OWE-SOJ技術(shù)已成功應(yīng)用于蜜環(huán)菌（Darmonoet and Burdsall，1992）、香菇（林芳燦等，2000）和側(cè)耳（程莉等，2007）等食用菌的交配型鑒定，但本研究利用OWE-SOJ技術(shù)鑒定灰樹花交配型的結(jié)果與核遷移試驗鑒定結(jié)果不一致，說明OWE-SOJ技術(shù)不適用于灰樹花的交配型分析。原因可能與平菇、香菇菌落表觀形態(tài)（均呈絨毛狀）及菌落反應(yīng)穩(wěn)定而灰樹花菌落表觀形態(tài)（主要呈氈狀，絨毛少且絨毛狀不明顯）易受環(huán)境影響、菌落反應(yīng)不穩(wěn)定有關(guān)。OWE-SOJ技術(shù)是否適用于其他類型菌落形態(tài)菌類交配型判斷有待進(jìn)一步探討。

核遷移試驗作為鑒定食用菌交配型的一種手段，是從微觀水平觀察鎖狀聯(lián)合并以此來推斷交配型，可靠性和穩(wěn)定性高。Raudaskeski和Kothe（2010）及Heitman等（2013）研究認(rèn)為，核遷移試驗是基于B因子的特定功能，在四極性異宗結(jié)合菌中只有A≠B≠或A=B≠，即B因子不相同的菌株配對才會發(fā)生核遷移，因此兩個交配反應(yīng)同為不親和配對，根據(jù)二次配對有無鎖狀聯(lián)合即是否發(fā)生核遷移來區(qū)分A=B≠及A≠B=兩種類型。鑒于此，本研究利用核遷移試驗鑒定T1、T2、T3和T4交配型分別為A1B1、A2B2、A2B1和A1B2。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，灰樹花屬于四極性交配型系統(tǒng)，其交配型分析應(yīng)以核遷移試驗為準(zhǔn)，OWE-SOJ技術(shù)不適用于灰樹花的交配型分析。

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（責(zé)任編輯 思利華）