邵敏　張小秋　張琨琨　楊麗濤　李楊瑞

摘要：【目的】對甘蔗宿根矮化病病原菌（Leifsonia xyli subsp. xyli， Lxx）一推測為抗K因子的膜蛋白基因（Lxx18460）進行研究，為今后研究該基因在感病甘蔗體內表達打下基礎?！痉椒ā空T導表達并純化含有推測為抗K因子的膜蛋白Lxx18460基因的pET-30a質粒菌液，委托南京金斯瑞生物科技有限公司制備單克隆抗體；用Western blotting對細菌及感病和健康甘蔗樣品總蛋白進行檢測?！窘Y果】Lxx18460基因具有特異性，只存在于甘蔗Lxx中。ELISA單克隆抗體效價大于 1∶512000，能夠靈敏地檢測細菌總蛋白和甘蔗樣品蛋白。Western blotting檢測結果表明，Lxx18460基因在細菌中和感病甘蔗樣品中表達，在健康甘蔗樣品中幾乎不表達。【結論】Lxx18460基因具有特異性，是Lxx中的抗K因子的膜蛋白基因，能夠在細菌和感病甘蔗樣品體外進行表達。

關鍵詞： 甘蔗宿根矮化??；Lxx18460基因；單克隆抗體；ELISA檢測；Western blotting檢測

中圖分類號： Q-331 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0382-07

0 引言

【研究意義】甘蔗宿根矮化?。≧atoon stunting disease， RSD）是普遍存在于植蔗地區(qū)的一種世界性重要病害（馬丁等，1982；黃應昆和李文鳳，2002），其病原為棒狀桿菌屬Leifsonia xyli subsp. xyli（Lxx） （Davis et al.，1980），寄生于蔗株的維管束中，受害甘蔗發(fā)育慢，植株矮小，嚴重影響甘蔗產量和品質，且該病原細菌特別細小，分離、培養(yǎng)和檢測都極其困難。 因子是細菌RNA聚合酶全酶（α2ββ ）的一個蛋白質亞基，它可以識別目的基因啟動子區(qū)域，促進該區(qū)域與RNA聚合酶全酶的結合（Chan et al.，2008），而抗 因子能通過影響 因子的作用抑制轉錄。因此，對Lxx中抗 因子進行研究，對于防治RSD具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】AsiA是大腸桿菌σ70 RNA聚合酶基因轉錄的一種抑制子，亦即抗 因子，Urbauer等（2002）通過將AsiA亞克隆進pET-24b表達載體并轉化進大腸桿菌BL21（DE3）菌株中誘導表達，其大小約10 kD，進一步分析表明該蛋白以二聚體的形式存在，是一種新型的螺旋折疊結構，它的表達會導致宿主基因轉錄關閉。RseA是大腸桿菌中跨膜的抗 因子，Campbell等（2003）采用PCR擴增目的片段DNA，構建σE和RseA的表達載體，轉入大腸桿菌BL21（DE3）菌株中誘導表達并進行共純化，結果表明，RseA能夠與 E結合，從而抑制轉錄。周丹（2012）克隆了Lxx中推測為抗 K因子的膜蛋白Lxx18460基因去跨膜區(qū)域的基因可讀框349～717序列（385 bp），將該基因克隆至pET-30a表達載體并轉化進大腸桿菌BL21（DE3）菌株中誘導表達和純化，大小為27 kD，并對該基因結構進行了分析，認為該蛋白位于細胞質膜上。Rebecc等（2014）為了研究抗 因子FpvR與 因子PvdS、FpvR的關系，采用TAG標簽的串聯(lián)親和層析方法對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中的抗 因子FpvR和 因子PvdS進行共純化，從生理水平證明了抗 因子FpvR與 因子PvdS結合在一起；采用Western blotting對結合在一起的抗 因子FpvR與 因子PvdS進行檢測，結果能檢測出目的條帶，大小為15 kD，但使用FpvI的多克隆抗體未能檢測到FpvI，到目前也未發(fā)現(xiàn)合適的單克隆抗體；通過構建含有多克隆位點的載體，測定相關β-半乳糖苷酶的活性，證明FpvR的胞質區(qū)會對FpvI和PvdS產生抑制?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關Lxx中推測為抗 K因子的膜蛋白Lxx18460基因單克隆抗體的制備和檢測未見報道，該基因在細菌及甘蔗體外的表達情況尚不清楚?！緮M解決的關鍵問題】采用PCR檢測和Western blotting對Lxx18460基因進行研究，旨在了解該基因的特異性、是否存在于細菌體內以及在細菌和感病甘蔗樣品體外的表達情況，為今后研究該基因在感病甘蔗體內的表達打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

感病甘蔗和健康甘蔗材料均采自廣西大學農學院試驗基地，Lxx細菌總蛋白、含有推測為抗 K因子的膜蛋白Lxx18460基因的pET-30a質粒菌液由廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室保存。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 抗原制備與純化 利用IPTG（0.1 mmol/L）誘導表達推測為抗 K因子的Lxx18460基因的pET-30a質粒菌液，收集誘導蛋白表達后的菌液100.0 mL左右，分裝在50.0 mL的離心管中，置于經4 ℃預冷的離心機內，4 ℃下5000 r/min離心20 min，棄盡上清液。用QIAGEN公司的Ni2+-NTA及配制的緩沖液純化重組蛋白，用變性緩沖液Buffer B（100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Urea，pH 8.0）重懸菌體，按緩沖液體積（mL）∶菌體濕重（g）=5∶1進行超聲波破碎，加終濃度為1 mg/mL的溶菌酶。將破胞后的菌液分裝到1.5 mL離心管中，4 ℃下12000 r/min離心30 min，用1.5 mL離心管收集上清液，約收集3.0 mL左右。Ni2+-NTA搖勻，每個吸2.0 mL，4 ℃下400 r/min離心5 min，甩掉多余水分。加入Buffer B（4.0 mL左右），4 ℃下4000 r/min離心5 min，重復3次。加入2.0 mL變性緩沖液Buffer B，將2.5 mL破胞后的菌體上清液緩慢加入到Ni2+-NTA柱內，使上清與柱內填料混和均勻，放入搖床搖勻 2 h。取出層析柱，室溫靜置30 min，打開柱底端封口，收集洗脫液。待液體流盡后，用4.0 mL Buffer B漂洗未結合蛋白，收集洗脫液。用Buffer C（100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Urea， pH 6.3）洗脫，每次0.5 mL，洗2次，收集洗脫液。用Buffer D（100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Urea，pH 5.9）洗脫，每次0.5 mL，洗7次。最后用Buffer E（100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HC，8 mol/L Urea，pH 4.5）洗脫，每次0.5 mL，洗4次，目的蛋白一般會在Buffer E中出現(xiàn)。經SDS-PAGE分析鑒定后，用紫外分光光度法檢測獲得的純化蛋白質量濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 樣品PCR檢測 本研究參考Pan等（1998）報道的Lxx 16S-23S rDNA內部轉錄間隔區(qū)（ITS）設計特異引物（表1），同時根據Lxx18460基因的特異性（周丹，2012）設計引物（表1），引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。根據PCR擴增產物有無DNA的特異擴增條帶（438 bp）判斷樣品是否含有RSD病原菌Lxx。以RSD病原菌Lxx DNA作為陽性對照，水為負對照。

1. 2. 3 抗原透析與濃縮 選擇美國即用型透析袋，截留分子量為15000，用去離子水將透析袋浸泡10 min，配透析液N10（1 mol/L Tris，10% NP-40，0.1 mol/L PMSF，glycerol，2 mol/L NaCl，2 mol/L Imidazole）2 L左右，將透析袋剪成8 cm左右長度，一頭用夾子夾好，放入水中，檢查是否漏水，用玻璃珠撐開袋，將水吸出后加入2.0 mL左右的抗原，用鑷子夾出玻璃珠，再用夾子將透析袋的另一頭夾好，將透析袋放入裝有透析液的大燒杯中，再將大燒杯放在攪拌器上不停攪拌，每隔2 h更換一次透析液，約更換4次。在方形盒底部鋪一定厚度的PEG-2000，將透析完的透析袋放入，再覆蓋一定厚度的PEG-2000，置于4 ℃展示柜進行濃縮，約濃縮 4 h。用紫外分光光度法檢測獲得的濃縮后蛋白質量濃度，即為制備單克隆抗體的免疫抗原。

1. 2. 4 抗血清制備與純化 委托南京金斯瑞生物科技有限公司制備單克隆抗體。

1. 2. 5 單克隆抗體效價測定 以Lxx18460蛋白為包被抗原，含有His標簽的不相關蛋白為陰性對照，未加抗原的磷酸鹽緩沖液為空白對照，Lxx18460為免疫原制備的單克隆抗體為第一抗體，以辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG F（c）（GOAT）為酶標抗體。單克隆抗體第一次稀釋1000倍，以后采用2倍等比稀釋法。在96孔酶聯(lián)板上檢測單克隆抗體的效價，用BIO-RAD Model 550型酶標儀測定450 nm波長下的OD值，計算S/N=樣品OD值/對照OD值，最大稀釋S/N≥2.1即為陽性。

1. 2. 6 單克隆抗體Western blotting檢測 Lxx18460蛋白跑完SDS-PAGE膠后，拆膠，去掉濃縮膠并用ddH2O沖洗2次。把膠、膜浸泡在Transfer Buffer（25 mmol/L Tris Base，192 mmol/L Glycin，0.037% SDS，20%甲醇）中搖15 min。厚濾紙、薄濾紙在轉膜之前用Transfer Buffer稍加浸泡，吸掉多余水后即可使用。自上而下依次擺放 1張厚濾紙、2張薄濾紙、膠、膜、2張薄濾紙、1張厚濾紙，200 mA，40 min。轉膜后，用鉛筆在膜正面左上角做好標記，夾出膜，放在含有PBS-T的盒里，搖5 min，倒掉，倒入含有5%脫脂奶粉的PBS-T中，置于4 ℃展示柜，搖過夜。倒掉脫脂奶粉，用PBS-T洗4次，每次5 min。用含0.1%脫脂奶粉的PBS-T對一抗進行稀釋（材料推薦一抗最終濃度為10 μg/mL），置37 ℃恒溫箱孵育2 h。PBS-T洗4次，每次5 min，用含0.5%脫脂牛奶的PBS-T對二抗進行稀釋（推薦二抗1∶1000），置37 ℃恒溫箱孵育1 h。PBS-T洗4次，每次5 min。ECL顯色，兩液等體積混勻，吸1 mL均勻滴在膜上，顯色1.0 min，拍照保存。

2 結果與分析

2. 1 樣品的PCR檢測結果

以F1/R1為引物的PCR檢測結果（圖1）顯示，甘蔗樣品5、7、8、9含有RSD病原菌Lxx，樣品3、4、6不含RSD病原菌Lxx，DX120（克雷伯氏菌）、Escherichia coli（大腸桿菌）、HLB（柑橘黃龍病菌）不含RSD病原菌Lxx。以F2/R2為引物的PCR檢測結果顯示（圖2），甘蔗樣品5、7、8、9含有RSD病原菌Lxx，樣品3、4、6不含有RSD病原菌Lxx，DX120、E. coli、HLB不含有RSD病原菌Lxx（圖2）。檢測結果說明Lxx18460基因引物具有特異性，可進一步用于單克隆抗體檢測。

2. 2 抗原的純化和濃縮結果

通過進一步的誘導表達獲得帶有His Tag標簽的融合蛋白，相對分子質量大小約27.0 kD，采用His Tag蛋白純化試劑盒純化Lxx18460蛋白，并通過SDS- PAGE電泳分析，獲得清晰的蛋白條帶（圖3）。目的蛋白主要在Buffer E中出現(xiàn)，可以從E中收集目的蛋白用于進一步透析和濃縮（圖4）。濃縮后，用紫外分光光度法檢測獲得的純化蛋白質量濃度為17.1 μg/μL，進行SDS-PAGE鑒定。從圖4可以看出，目的蛋白條帶較單一，純度較高，濃度和純度均達到制備單克隆抗體的要求，可以用作免疫抗原。

2. 3 單克隆抗體的效價檢測結果

將純化后的Lxx18460蛋白免疫小鼠，獲得特異性較好的單克隆抗體。用間接ELISA在96孔酶聯(lián)板上檢測鼠單克隆抗體的效價，結果見表2。由表2可知，將抗血清稀釋至256000倍時仍有明顯的陽性反應，而陰性對照OD值無明顯梯度，表明本研究制備的鼠單克隆抗體的效價大于1∶512000。

2. 4 單克隆抗體的Western blotting檢測結果

小鼠腹水中除有抗體外還含有一些復雜的混合物，如大量非抗體雜蛋白等，為了消除對試驗干擾的物質，需要對小鼠腹水進行純化。為了檢測所制備單克隆抗體的特異性和免疫學活性，采用Western blotting對制備的Lxx18460蛋白進行鑒定，結果（圖5）顯示，純化后的血清抗體與His融合的Lxx18460蛋白具有特異性的結合反應，只有一條主要條帶，說明Protein A能較好地去除腹水中的雜蛋白，純化后的抗體檢測不出含有His標簽的不相關蛋白，表明該抗體具有特異性，制備的單克隆抗體完全能滿足下一步試驗的要求。

2. 5 甘蔗莖、葉樣品的PCR檢測結果

根據Lxx18460基因的特異性設計引物進行PCR檢測，以RSD病原菌Lxx DNA作為陽性對照，水為負對照，檢測甘蔗莖、葉樣品的帶病情況，結果見圖6。從圖6可以看出，3～5、8、10～13為感病甘蔗葉，6、7、9、14、15為健康甘蔗葉，16～24為感病甘蔗莖，25、26為健康甘蔗莖。根據甘蔗帶病情況可進一步提取蛋白，用于Western blotting檢測。

2. 6 感病和健康甘蔗莖、葉總蛋白及細菌總蛋白SDS-PAGE檢測結果

用酚抽提的方法分別提取感病和健康甘蔗莖、葉的總蛋白進行SDS-PAGE鑒定，結果見圖7和圖8。由圖7和圖8可以看出，蛋白條帶清晰，質量較好，可以進行Western blotting檢測。

2. 7 感病和健康甘蔗莖、葉總蛋白及細菌總蛋白Western blotting檢測結果

將獲得的單克隆抗體稀釋后作為一抗，對感病和健康甘蔗莖、葉總蛋白及細菌總蛋白進行Western blotting檢測，以Lxx18460蛋白為陽性對照。結果表明，Lxx18460蛋白在細菌中能夠表達且表達量較高（圖9）。對感病和健康甘蔗葉進行Western blotting檢測，結果表明，Lxx18460蛋白在健康甘蔗葉中不表達，在感病甘蔗葉中表達（圖10）。對感病和健康甘蔗莖進行Western blotting檢測，結果表明，Lxx18460蛋白在健康甘蔗莖中不表達，在感病甘蔗莖中表達（圖11）?？梢?，制備的單克隆抗體具有較好的特異性，能夠較靈敏地對材料進行檢測。

3 討論

RSD是一個比較難研究的細菌病害，隨著生物學技術的發(fā)展，人們開始采用一些技術手段研究該菌的致病機理，并采取一些措施對該病菌進行檢測。細菌能根據胞外環(huán)境的變化而調節(jié)自身，為了適應多變的環(huán)境，細菌能在細胞受到傷害之前感受和響應這些變化。因此，細菌需要信號轉導系統(tǒng)使其感受胞外環(huán)境的變化，從而啟動不同基因的表達。在轉錄水平調節(jié)基因表達的常見機制是 因子調節(jié)，決定了啟動子的識別，而抗 因子與 因子又存在密切的聯(lián)系，抗 因子能結合在σ因子上影響甚至阻礙一些基因表達（Missiakas and Raina，1998；Bashyam and Hasnain，2004）。周丹（2012）克隆了RSD病原菌Lxx中推測為抗 K因子的Lxx18460基因，分析了基因結構和在感病蔗株體內的表達情況，但未證明該基因是否具有特異性、是否存在于RSD病原菌Lxx中及其體外表達情況。

本研究根據Lxx18460基因的特異性設計引物（周丹，2012），雖然PCR產物大小與Pan等（1998）存在不同，但通過比較分析得出該基因具有特異性。謝曉娜等（2013）分離純化了RSD的病原菌并制備了RSD的多克隆抗體，為甘蔗宿根矮化病的快速檢測提供了必要保證，但在Western blotting檢測中，多克隆抗體的特異性較低，產生的非特異性條帶更多，不能夠明確研究某個致病基因。為了進一步研究Lxx18460基因的表達情況，本研究利用IPTG（0.1 mmol/L）誘導Lxx18460基因的蛋白表達并純化，委托南京金斯瑞生物科技有限公司制備單克隆抗體，ELISA單克隆抗體效價大于1∶512000，能夠檢測出目的條帶，初步證明該基因誘導表達的蛋白在RSD病原菌Lxx中和感病甘蔗樣品體外能夠表達。但在檢測細菌和甘蔗樣品的過程中不可避免也會產生一些雜帶，一方面，樣品本身在提取的過程中會產生降解，尤其是細菌樣品較難培養(yǎng)，需要多次收集細菌蛋白進行保存，操作相對繁瑣，蛋白在多次收集和保存的過程中產生降解；另一方面，Western blotting只是初步檢測，還不夠優(yōu)化，導致背景較深、雜帶較多，在后續(xù)試驗中有必要進一步優(yōu)化。由于Lxx18460基因誘導表達的蛋白在細菌及樣品體外的具體表達量還不明確，因此在后續(xù)研究中有必要設計相關的內參基因進行Western blotting分析，以明確該基因誘導表達的蛋白在細菌及樣品體外的具體表達量。目前，關于Lxx18460基因誘導表達的蛋白在感病甘蔗體內的表達情況尚不清楚，需要進一步進行切片觀察，并以該抗體為探針，直接作用于處理的感病甘蔗莖、葉等各部分，觀察在植物體內的表達情況。

4 結論

Lxx18460基因具有特異性，只存在于感染RSD病原菌Lxx的甘蔗中，初步證明Lxx18460基因是Lxx中的抗 K因子的膜蛋白基因；利用該基因誘導表達的蛋白制備單克隆抗體對細菌總蛋白和甘蔗樣品進行檢測，能夠檢測出目的條帶，進一步證明Lxx18460基因是Lxx中的抗 K因子的膜蛋白基因，且該基因能夠在細菌和感病甘蔗樣品體外進行表達。

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（責任編輯 麻小燕）