王義勛　王星冉　陳京元　黃俊斌　鄭露

摘要：【目的】篩選對馬尾松毛蟲具有高毒力的白僵菌菌株，為生產(chǎn)上防治馬尾松毛蟲提供優(yōu)良菌種資源?！痉椒ā繌牟煌貐^(qū)林間收集僵蟲和采集土壤，分別采用組織分離和稀釋涂皿法分離白僵菌菌株，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列分析鑒定白僵菌菌株的種級分類地位，通過孢子液浸漬法篩選對馬尾松毛蟲的高毒力菌株。【結(jié)果】共分離獲得20株白僵菌菌株，在PDA培養(yǎng)基上各菌株的菌落、菌絲、分生孢子（梗）形態(tài)與球孢白僵菌（Beauveria bassiana）相似，且20株菌株ITS序列與GenBank中的球孢白僵菌遺傳距離最近。對20株菌株的毒力測定結(jié)果表明，B-2、B-14、B-19、B-1和B-13等5株菌株對馬尾松毛蟲的毒力較強，其中B-2、B-14和B-19菌株的致病力最強，接種11 d后馬尾松毛蟲的校正死亡率為100%，3株菌株對馬尾松毛蟲的致死中時（LT50）均小于8.00 d，分別為7.63、7.62和7.88 d，致死中濃度（LC50）分別為0.63×106、0.96×106和0.78×106個/mL?！窘Y(jié)論】篩選得到3株對馬尾松毛蟲具有高毒力的球孢白僵菌菌株B-2、B-14和B-19，且均具有較高的生物防治潛力和開發(fā)應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞： 球孢白僵菌；馬尾松毛蟲；鑒定；毒力

中圖分類號： S763.421 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）05-0662-05

Abstract：【Objective】Highly virulent strains of Beauveria bassiana were screened out， in order to provide excellent strain resource for controlling Dendrolimus punctatus in field. 【Method】The dead insect and soil were collected from different woodlands in China， and Beauveria strains were isolated by tissue isolation and gradient dilution method， respectively. Based on morphological observation and ITS sequence analysis， species of all Beauveria strains were identified. And then virulence of Beauveria strains was tested by dipping larvae with spore suspensions. 【Result】A total of 20 Beauveria strains were obtained from dead insect and soil. After being cultured on PDA plates， morphologies of colonies， mycelia， conidia and conidiospores of all strains were observed， and these strains were similar with Beauveria bassiana. Moreover， comparison with sequences in GenBank showed that， the ITS sequences of 20 Beauveria strains were the clos genetic distance with that of B. bassiana in GenBank. The vtrulence determination results showed that， among all strains， the strains B-2， B-14， B-19， B-1 and B-13 had higher vtrulence， especially strains B-2， B-14 and B-19 with the highest virulence， leading to that the corrected mortality of D. punctatus was up to 100% after 11 days post-inoculation. The LT50 of B-2， B-14 and B-19 were 7.63， 7.62 and 7.88 d， respectively， and their LC50 were 0.63×106， 0.96×106 and 0.78×106 conidia/mL， respectively. 【Conclusion】The screened B. bassiana strains B-2， B-14 and B-19 show high virulence to D. punctatus， and have great application and potential in biological control.

Key words： Beauveria bassiana； Dendrolimus punctatus； identification； virulence

0 引言

【研究意義】馬尾松毛蟲（Dendrolimus punctatus Walker）屬鱗翅目枯葉蛾科昆蟲，是我國南方林區(qū)的主要森林害蟲之一，主要為害馬尾松、濕地松等松屬植物。其幼蟲啃食松針，引起松針卷曲枯黃，嚴(yán)重時可吃光松針，形似火燒，影響松樹生長甚至枯死（肖剛?cè)幔?983）。受害后的松樹樹勢衰弱，易遭受天牛、小蠹蟲、松莖象等蛀干類害蟲入侵，造成松樹大面積死亡，威脅森林生態(tài)安全（費海澤等，2014）。目前，對馬尾松毛蟲的防治主要有物理防治、化學(xué)防治和生物防治，化學(xué)防治雖然在一定程度上可以快速有效地殺滅該蟲，但化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用嚴(yán)重影響生態(tài)環(huán)境和人類健康；而物理防治雖具有一定效果，但耗時耗力，不利于大面積防治。生物防治不僅能有效持續(xù)殺蟲，還不污染環(huán)境，能夠保持森林生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定與平衡。因此，采用生物防治手段對控制馬尾松毛蟲的發(fā)生危害具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】與球孢白僵菌（Beauveria bassiana）作為一種蟲生真菌，能夠侵染15目149科的700余種農(nóng)林業(yè)害蟲（蒲蟄龍和李增智，1996；李增智等，1998），其中白僵菌的大面積林間應(yīng)用能夠促使對馬尾松毛蟲的控制達(dá)到持續(xù)性效果，從而對維護(hù)生物多樣性及森林生態(tài)平衡具有重要意義；而且白僵菌生物制劑對人畜安全、無污染，對害蟲不產(chǎn)生抗藥性（Feng and Johnson，1990）。我國自20世紀(jì)50年代開始研究和應(yīng)用白僵菌防治林業(yè)害蟲，其中對馬尾松毛蟲防治效果最顯著。以浙江省為例，20世紀(jì)70年代初，白僵菌防治松毛蟲僅限安吉、余杭長樂、平陽、麗水等地，70年代末至80年代初，白僵菌防治在浙江省大面積推廣，防治效果達(dá)70%。近年來也有報道利用白僵菌菌株防治馬尾松毛蟲取得較好效果。胡凌云和湯均友（2012）的研究結(jié)果表明，400億孢子/g球孢白僵菌可濕性粉劑對馬尾松毛蟲有較好的防治效果，藥后15 d防效在96%。查玉平等（2013）在湖北省采用白僵菌大面積防治馬尾松毛蟲，無論地面人工防治還是飛機防治效果均較佳，平均防效在60%以上?！颈狙芯壳腥朦c】雖然白僵菌應(yīng)用于馬尾松毛蟲的防治已有多年歷史，但仍存在菌株致病力退化和田間防治效果不穩(wěn)定等缺點。高毒力菌種篩選和定向培育是白僵菌生產(chǎn)中急需解決的重要課題，也是提高白僵菌對馬尾松毛蟲防治效果的最佳途徑。【擬解決的關(guān)鍵問題】以從我國不同地區(qū)林間收集的僵蟲和采集的土壤中分離的白僵菌為材料，采用室內(nèi)馬尾松毛蟲毒力測定方法篩選出高毒力白僵菌菌株，旨在為生產(chǎn)上防治馬尾松毛蟲提供可持續(xù)使用的優(yōu)良白僵菌菌株。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

僵蟲和土壤采自湖北、福建、吉林等不同地區(qū)林間；對照商品球孢白僵菌可濕性粉劑（400億孢子/g）由江西天人生態(tài)工業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)提供；供試健康馬尾松毛蟲3齡幼蟲采集于湖北省紅安縣馬尾松林。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌株分離與鑒定

1. 2. 1. 1 菌株分離和保存 僵蟲樣品采用組織分離法（方中達(dá)，2007）分離白僵菌菌株：將林間收集的僵蟲表面消毒后切成約0.5 cm小塊置于PDA培養(yǎng)基中央，25 ℃恒溫培養(yǎng)。土壤樣品采用稀釋涂皿法（Chase et al.，1986）分離白僵菌菌株：稱取2 g土壤樣品置于18 mL的無菌水中攪拌2 min制成土壤懸浮液，稀釋10倍后涂布于多果定培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)。將分離得到的菌株采用分生孢子單菌落分離獲得純培養(yǎng)菌株，以PDA斜面培養(yǎng)基4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 1. 2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 將上述純化培養(yǎng)菌株接于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，7 d后觀察菌落形態(tài)特征。采用玻片培養(yǎng)法，記錄其菌絲隔膜、孢子形態(tài)和大小、產(chǎn)孢梗形狀等形態(tài)特征。參照相關(guān)文獻(xiàn)的形態(tài)特征進(jìn)行白僵菌的種級鑒定（Macleod，1954；李增智，1991）。

1. 2. 1. 3 ITS序列分析 采用CTAB法提取各白僵菌菌株的基因組DNA（Sambrook et al.，2001）。rDNA-

ITS區(qū)段采用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACC

TGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATG

C-3'）進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)體系（50.0 μL）：10×Buffer（含Mg2+）5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 3.0 μL，10 μmol/L ITS1和ITS4各1.0 μL，DNA模板2.0 μL， ddH2O補足至50.0 μL。擴增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ l min，進(jìn)行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至武漢擎科創(chuàng)新生物有限公司進(jìn)行測序。將測序獲得的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對分析，然后應(yīng)用MEGA 5.0軟件中的Neighbor- joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 2 菌株毒力測定 參照湯強等（2009）的方法對白僵菌菌株進(jìn)行室內(nèi)毒力測定。將分離獲得的白僵菌菌株分別轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫產(chǎn)孢培養(yǎng)。12 d后收集孢子，用0.1%吐溫-20無菌水配制成1.0×107個/mL的孢子懸液。將野外采集的馬尾松毛蟲3齡幼蟲在配制好的孢子懸液中浸漬10 s，用濾紙吸去多余水分，然后將蟲放入裝有馬尾松松針的廣口瓶中，以紗布封口，置于培養(yǎng)箱（25 ℃，RH 90%，L∶D=14 h∶10 h）中飼養(yǎng)。每處理15頭幼蟲，3次重復(fù)。將對照商品400億孢子/g球孢白僵菌可濕性粉劑稀釋至1.0×107個/mL處理作陽性對照，以等量0.1%吐溫-20無菌水處理作陰性對照。接種24 h后每2 d統(tǒng)計死亡蟲數(shù)。死亡的僵蟲置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)25 ℃保濕培養(yǎng)，觀察蟲體上菌絲生長情況，以區(qū)分白僵菌致死和非白僵菌致死。以死亡后蟲體表面產(chǎn)生白色菌絲記為被白僵菌感染有效致死，觀察菌絲生長及產(chǎn)孢情況，統(tǒng)計死亡率（%），計算校正死亡率（%）、致死中時（LT50）。

1. 2. 3 不同孢子濃度處理馬尾松毛蟲對菌株毒力的影響 通過1.2.2篩選得到5株毒力較強的白僵菌菌株B-1、B-2、B-13、B-14和B-19，將各菌株孢子分別配制成×106、×107、×108個/mL的3個梯度懸浮液（含0.1%吐溫-20），以0.1%吐溫-20無菌水作對照。參照1.2.2的方法，對馬尾松毛蟲3齡幼蟲進(jìn)行不同孢子濃度處理。記錄僵蟲數(shù)量，統(tǒng)計死亡率（%），計算校正死亡率（%）、致死中時（LT50）和致死中濃度（LC50）。

1. 3 統(tǒng)計分析

根據(jù)下列公式計算馬尾松毛蟲死亡率和校正死亡率。以時間（d）的對數(shù)值為自變量x，校正死亡率的機率值為因變量y，采用機率值分析法，利用SPSS 19.0計算LT50和回歸方程。以孢子濃度（個/mL）的對數(shù)值為自變量x，校正死亡率的機率值為因變量y，利用SPSS 19.0計算LC50和回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2. 1 菌株分離和鑒定

從僵蟲和土壤中共分離獲得20株菌株，其中，從不同寄主的僵蟲中分離獲得16株菌株；從土壤中分離獲得4株菌株（表1）。

在PDA培養(yǎng)基上，供試20株菌株菌落形態(tài)相似。培養(yǎng)7 d后菌落白色、圓形，后期菌落變?yōu)榈S色。初生菌絲白色茸毛狀，菌落較厚，有褶皺，質(zhì)地致密柔軟；產(chǎn)生分生孢子呈粉末狀；菌絲具隔膜、分枝、細(xì)長延伸，寬1.60～2.63 μm，隔膜長7.64～l6.50 μm；分生孢子梗多不分枝，呈筒形或瓶形，著生于營養(yǎng)菌絲上；產(chǎn)孢細(xì)胞濃密簇生于菌絲、分生孢子?；蚺菽疑?，呈球形或瓶形，頸部延長形成產(chǎn)孢軸，呈“之”字形彎曲；分生孢子球形或近球形，單孢、無色、透明，著生于產(chǎn)孢細(xì)胞延伸而成的產(chǎn)孢軸上。

通過BLAST進(jìn)行序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20株菌株ITS序列與球孢白僵菌（B. bassiana）的同源性均在99%以上。采用MEGA 5.0軟件Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖1）表明，20株菌株序列與GenBank中的球孢白僵菌（登錄號AY334539、AY334541和HQ222980）遺傳距離最近；與布氏白僵菌（B. brongniartii， 登錄號KM458168）、小蟬白僵菌（B. Sobolifera， 登錄號AJ309325）、蛹蟲草（Cordyceps militaris， 登錄號EU825996）和綠僵菌（Metarhizium anisopliae， 登錄號KJ573520）等近緣種ITS序列聚類區(qū)分明顯。鑒于20株菌株的ITS序列同源性較高，排除了混有球孢白僵菌隱含種的可能性（Rehner et al.， 2011）。

結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征和ITS序列的BLAST比對分析結(jié)果，將分離所得的20株菌株鑒定為球孢白僵菌（B. bassiana）。

2. 2 球孢白僵菌菌株毒力測定結(jié)果

馬尾松毛蟲接種孢子懸液處理24 h后開始表現(xiàn)死亡癥狀，不同菌株對馬尾松毛蟲毒力存在明顯差異，其中，B-2、B-14和B-19菌株接種11 d后校正死亡率達(dá)100%。從表2可以看出，菌株B-1、B-2、B-13、B-14和B-19等5株菌株的LT50均小于9.00 d，致死速度相對較快，且5株菌株的LT50比對照商品球孢白僵菌可濕性粉劑（CK）低，其中，B-14和B-2菌株致死速度最快，LT50分別為7.26和7.63 d，其后依次為B-19（7.88 d）、B-1（8.39 d）和B-13（8.71 d）。因此，選取B-2、B-14、B-19、B-1和B-13等5株高毒力菌株進(jìn)行后續(xù)試驗。

2. 3 不同孢子濃度對菌株毒力的影響

用供試5株高毒力白僵菌菌株不同濃度分生孢子懸液處理馬尾松毛蟲幼蟲，結(jié)果（表3）表明，隨著各供試菌株分生孢懸子液濃度的增加，馬尾松毛蟲幼蟲的LT50逐漸降低，分生孢子懸液濃度為1×108個/mL時，供試菌株對馬尾松毛蟲幼蟲的毒力最強，致死速度最快（LT50均小于6.60 d）。從表4可以看出，供試菌株間對馬尾松毛蟲幼蟲的LC50存在差異，其中，B-2菌株的LC50最低，為0.63×106個/mL；B-19與B-14菌株的LC50較接近，分別為0.78×106和0.96×106個/mL， B-1和B-13菌株的LC50較高，分別為4.97×106和7.86×106個/mL。通過上述試驗結(jié)果分析，篩選出對馬尾松毛蟲幼蟲具有高毒力的菌株B-2、B-14和B-19。

3 討論

本研究從不同寄主來源僵蟲及土壤中分離白僵菌，經(jīng)鑒定證實所分離菌株均為球孢白僵菌，說明球孢白僵菌在自然界中以優(yōu)勢種群存在，寄生性可能相對其他種類白僵菌更強。利用昆蟲病原真菌防治靶標(biāo)害蟲，關(guān)鍵是選擇對靶標(biāo)害蟲毒力強的菌株（李會平等，2007；徐進(jìn)等，2015）。從室內(nèi)毒力測定結(jié)果可以看出，不同白僵菌菌株對馬尾松毛蟲毒力存在分化，B-2、B-14和B-19菌株對馬尾松毛蟲的毒力強，接種11 d后校正死亡率達(dá)100%，LT50均小于8.00 d。從不同孢子濃度接種試驗結(jié)果可以看出，菌株的孢子濃度越高，對馬尾松毛蟲的LT50越短；B-2菌株的LC50最低，為0.63×106個/mL，B-19和B-14菌株的LC50分別為0.78×106和0.96×106個/mL。本研究結(jié)果還表明，白僵菌菌株之間存在一定的寄主?；浴７蛛x自馬尾松毛蟲僵蟲的白僵菌菌株比其他寄主的白僵菌菌株的LT50相對偏小，分離自馬尾松毛蟲的白僵菌對馬尾松毛蟲的LT50多數(shù)小于10.00 d，而分離自尺蠖的B-20和分離自松褐天牛的B-98和B-100對馬尾松毛蟲的LT50大于20.00 d。不同寄主來源白僵菌菌株毒力存在一定差異，分離自馬尾松毛蟲僵蟲的菌株其毒力普遍較高；而分離自土壤的白僵菌菌株未顯示出較強毒力，說明分離自土壤的菌株可能需要通過接種寄主昆蟲恢復(fù)其毒力。鑒于白僵菌菌株毒力分化明顯，因此廣泛收集和大量篩選菌株是獲得高致病力球孢白僵菌菌株的重要途徑。

此外，白僵菌的質(zhì)量不僅與菌株的毒力有密切關(guān)系，還與菌株培養(yǎng)溫度、濕度、營養(yǎng)元素等因素及菌株間的多型性和種群遺傳異質(zhì)性等有關(guān)系（陳名君等，2010；齊永霞等，2011）。這些特性致使白僵菌在毒力等生物學(xué)性狀上存在顯著差異，進(jìn)而影響防治效果的穩(wěn)定性。針對本研究篩選出具有生防潛力的高毒力菌株B-2、B-14和B-19，將進(jìn)一步對其生物學(xué)性狀、菌株毒力穩(wěn)定性及定向培育等方面開展深入研究。

4 結(jié)論

本研究從僵蟲和土壤中分離獲得20株球孢白僵菌菌株，從中篩選出B-2、B-14和B-19等3株對馬尾松毛蟲具有高毒力的菌株，3株菌株的毒力水平比現(xiàn)已推廣應(yīng)用的400億孢子/g球孢白僵菌可濕性粉劑高，具有較高的開發(fā)應(yīng)用價值。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）