林玲 陳立 李瑋 謝蜀豫 文仁德 陳國品 李洪艷 韓佳宇 盤豐平 白先進(jìn) 曹慕明

摘要：【目的】探索葡萄黑痘病病原菌在不同培養(yǎng)條件下的生長情況，優(yōu)化其培養(yǎng)條件，以縮短培養(yǎng)該菌純培養(yǎng)物的周期，提高培養(yǎng)效率?！痉椒ā客ㄟ^常規(guī)培養(yǎng)手段，從患黑痘病黑巴拉多病葉上分離葡萄黑痘病病原菌，PCR擴(kuò)增該菌ITS片段，經(jīng)測序后在NCBI比較該片段序列。用同一規(guī)格培養(yǎng)皿培養(yǎng)病原菌，每隔7 d觀察并統(tǒng)計(jì)該病原菌在4種不同培養(yǎng)基組分、5個(gè)不同溫度梯度、4個(gè)不同蔗糖濃度梯度、4種光照時(shí)間、5個(gè)不同pH條件下共計(jì)21 d的生長情況?！窘Y(jié)果】分離到病原菌并擴(kuò)增獲得其ITS片段，經(jīng)比對，該片段序列與NCBI已公布葡萄痂囊腔菌序列AY826763的相似度達(dá)99.9%，證實(shí)所分離病原菌為葡萄痂囊腔菌（Elsinoe ampelina）。葡萄痂囊腔菌的生長最適培養(yǎng)基為PSA，其次是YEB；最適培養(yǎng)溫度為25 ℃、最適蔗糖濃度為4.5 g/L、最適pH為8，在最適培養(yǎng)溫度、蔗糖濃度和pH下病原菌的生長速度分別為0.07、0.03和0.01 cm/d；光照時(shí)間對葡萄痂囊腔菌生長影響不明顯?！窘Y(jié)論】葡萄痂圓孢菌生長受環(huán)境條件影響，通過培養(yǎng)條件優(yōu)化能顯著加快其生長速度，提高培養(yǎng)效率。

關(guān)鍵詞： 葡萄黑痘?。黄咸佯枘仪痪?；培養(yǎng)條件；生長特性

中圖分類號： S436.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）04-0571-05

0 引言

【研究意義】葡萄黑痘?。℅rape black pox）是危害葡萄的主要真菌病害之一，其病原菌有性態(tài)為葡萄痂囊腔菌[Elsinoe ampelina（de Bary） Shear]，無性態(tài)為葡萄痂圓孢（Sphaceloma ampelinum de Bary），由于該菌屬于寄生性真菌，營養(yǎng)要求苛刻，在實(shí)驗(yàn)室中離體培養(yǎng)較困難（張劍俠等，2009；徐寧等，2014；劉會寧和李彬，2015），不利于對黑痘病的后續(xù)研究。因此，通過研究葡萄痂囊腔菌的生長特性，優(yōu)化其培養(yǎng)條件，從而快速大量地獲得其純培養(yǎng)菌體，對于葡萄黑痘病研究有著重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】葡萄黑痘病害發(fā)生廣泛，嚴(yán)重影響葡萄的食用價(jià)值和商品價(jià)值。國內(nèi)研究人員目前已對黑痘病的發(fā)生規(guī)律進(jìn)行了一些研究，王倩（2011）研究發(fā)現(xiàn)，我國葡萄主產(chǎn)區(qū)除新疆和少數(shù)干旱地區(qū)外，均有葡萄黑痘病害發(fā)生；在春夏多雨潮濕的地區(qū)，黑痘病發(fā)病盛期為3月中旬～4月下旬，這段時(shí)間是防治黑痘病的關(guān)鍵時(shí)期。劉志剛（2006）調(diào)查發(fā)現(xiàn)葡萄黑痘病的發(fā)生與氣候因素（如大氣濕度、降雨等）密切相關(guān)，多雨高濕的環(huán)境不僅有利于黑痘病病菌分生孢子形成、傳播和萌發(fā)侵入，還能促使患病組織迅速生長，導(dǎo)致葡萄植株抵抗力下降，加重病害的發(fā)生；干旱年份或少雨地區(qū)則發(fā)病較輕。楊華等（2009）研究發(fā)現(xiàn)黑痘病菌能夠侵染葡萄的花穗、幼果、卷須和新生枝葉等幼嫩組織，嚴(yán)重影響葡萄的食用價(jià)值和商品價(jià)值，使葡萄各產(chǎn)區(qū)蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在葡萄黑痘病病原分離及培養(yǎng)方面的研究報(bào)道較少。肖歡等（2010）通過分子生物學(xué)手段分離得到黑痘病病原菌——葡萄痂囊腔菌。目前國內(nèi)研究人員僅采用以葡萄糖為碳源的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)葡萄痂囊腔菌，沒有探索其生長特性，且生長至肉眼可見菌落時(shí)間長達(dá)3個(gè)月，難以快速有效地滿足后續(xù)對黑痘病研究的需求（王倩，2011）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對于葡萄黑痘病致病菌本身生長特性的研究尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過單因素試驗(yàn)，對葡萄痂囊腔菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以加快該菌的生長速度，提高獲得純培養(yǎng)物的效率，為葡萄黑痘病研究提供菌源保障。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試葡萄品種為黑痘病高感品種黑巴拉多，取自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院明陽雙季葡萄示范基地種質(zhì)資源圃。

供試主要試劑：三羥甲基氨基甲烷（Tris）、蛋白胨、酵母提取物、瓊脂為OXOID.LTD產(chǎn)品，Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（真菌）、ITS通用引物、Taq DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTP、100 bp Plus DNA Ladder為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品，NaCl、酒精、NaOH等均為國產(chǎn)分析純。

供試主要儀器：低溫離心機(jī)（Eppendorf，5804R，Germany）、常溫離心機(jī)（Eppendorf，5418R，Germany）、PCR儀（Eppendorf，5341，Germany）、烘箱（上海精宏 實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DHG-9123A型）、水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，DK-8D）、高壓滅菌鍋（TOMY、SX-500，Japan）、恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司，ZHWY-2102）、超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，SW-CJ-2FD）、微波爐（Galanz，P7021P- 61A）、電泳儀（北京六一儀器廠，DDY-6C型）、凝膠成像系統(tǒng)（SYNGENEG：BOX）、智能生化培養(yǎng)箱（黑龍江東拓儀器制造有限公司，SPX-2508）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 常用培養(yǎng)基配制 PSA培養(yǎng)基（1 L）：馬鈴薯（去皮）200 g，加水1000 mL煮沸30 min，紗布過濾，加入蔗糖10 g，瓊脂14 g，加熱充分溶解后，加水補(bǔ)足至1000 mL，最后分裝至三角瓶中，121 ℃高壓滅菌20 min后取出，冷卻備用。

YEB培養(yǎng)基（1 L）：酵母提取物6 g，蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，瓊脂7 g，加熱充分溶解后，加水補(bǔ)足至1000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min后取出，冷卻備用。

LB培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨（Tryptone）10 g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉15～20 g，加雙蒸水至1000 mL，用5 mol/L NaOH（約0.2 mL）調(diào)pH至7.2，121 ℃滅菌30 min。

CM培養(yǎng)基（1 L）：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂7 g，加熱充分溶解后，加水補(bǔ)足至1000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min后取出，冷卻備用。

1. 2. 2 葡萄痂囊腔菌的分離培養(yǎng)及純化 2014年4月，自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院明陽雙季葡萄示范基地葡萄種質(zhì)資源圃患病黑巴拉多上摘取病葉片（圖1），置于冰壺中帶回實(shí)驗(yàn)室，采用傳統(tǒng)方法分離黑痘病病原菌。將病葉置于密封袋中，用無菌水輕柔沖洗。在無菌操作臺上進(jìn)行接種，在病葉上選取典型單一病斑，用滅菌解剖刀從病健交界處切取約1 cm2的小塊，在75%乙醇中振蕩3～5 s，用0.01%升汞在表面輕輕擦拭晾干，最后放入無菌水中漂洗晾干。將病組織接種在PSA培養(yǎng)基上，每皿接種4片材料，在25 ℃恒溫箱中暗培養(yǎng)。待菌落長出，用滅菌接種針在菌落邊緣挑取小塊，接至PSA斜面培養(yǎng)基上，在25 ℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將分離得到的菌純化、繼續(xù)擴(kuò)繁，培養(yǎng)成熟后用0.9% NaCl溶液將斜面上的孢子洗下制成2×106個(gè)/mL菌絲懸浮液。在陰天，隨機(jī)選取10株葡萄，用噴霧器噴施菌懸液接種黑巴拉多幼葉，另設(shè)1噴施清水對照，套袋保濕并觀察，待癥狀穩(wěn)定后直接從病斑上刮取病原菌（沈國軍和徐祖榮，2010）。

1. 2. 3 葡萄痂囊腔菌DNA提取與rDNA-ITS區(qū)域核苷酸序列測定 使用生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（真菌）提取病原菌DNA，并略有改進(jìn)。取冷凍干燥菌絲約0.2 g，在研缽中預(yù)冷，然后研磨成粉末，迅速將干粉末轉(zhuǎn)移，置于滅菌2 mL離心管中，在離心管中加入500 μL抽提緩沖液，55 ℃恒溫水浴50 min，期間每隔10 min輕輕振蕩混勻離心管內(nèi)的緩沖液；待完成后，離心，輕輕吸取上清液至新離心管，加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），渦旋振蕩充分混勻，離心取上層水相；重復(fù)2次；離心后輕輕吸取上清液至新離心管，加1/10體積的3 mol/L NaAc（pH 5.2）和等體積異丙醇渦旋混勻，-20 ℃下靜置30 min；離心，棄上清液，用無水乙醇洗滌沉淀，將沉淀溶于30 μL TE緩沖液中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

擴(kuò)增所用引物為真菌ITS區(qū)通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）（林玲，2010；張劍俠等，2010）。PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）：10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌水10.3 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察并拍照。使用 DNA凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司，產(chǎn)品號DP209）回收目的DNA片段，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測得的ITS序列在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行同源性比對分析（雷百戰(zhàn)和李國英，2004；尚晶晶，2010）。

1. 2. 4 葡萄痂囊腔菌培養(yǎng)條件篩選

培養(yǎng)基篩選：將葡萄痂囊腔菌接種于PSA培養(yǎng)基上，待菌落生長至d=50 mm時(shí)用無菌打孔器取d=3 mm的菌絲塊，分別轉(zhuǎn)接至4種真菌培養(yǎng)基（CM、LB、YEB、PSA）上，接種后的培養(yǎng)基在25 ℃暗培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。每隔7 d測量其菌落直徑并用肉眼觀察菌落厚薄。

培養(yǎng)基含糖量篩選：以蔗糖配制成濃度分別為3.0、4.5、6.0和7.5 g/L的PSA培養(yǎng)基，按上述方法接菌，置于28 ℃下培養(yǎng)，定時(shí)測定菌落直徑并觀察菌落厚薄。

培養(yǎng)溫度篩選：在5～30 ℃范圍內(nèi)設(shè)置5種不同溫度（10、15、20、25、30）處理，按上述方法接菌，定時(shí)測定菌落直徑并觀察菌落厚薄。

光照條件篩選：分別在全光照、全黑暗、8 h光照/16 h黑暗和8 h黑暗/16 h光照條件下用PSA培養(yǎng)基在20 ℃下培養(yǎng)，接菌方法同上，定時(shí)測定菌落直徑并觀察菌落厚薄。

pH篩選：在PSA培養(yǎng)基上設(shè)置5種不同pH（4、6、8、10、12）處理，按上述方法接菌，定時(shí)測定菌落直徑并觀察菌落厚薄。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel 2007和DPS 9.50數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 葡萄痂囊腔菌DNA提取與ITS片段擴(kuò)增

使用真菌試劑盒提取葡萄黑痘病病原菌DNA，其帶型清楚可見（圖2-A），擴(kuò)增得到長度為451 bp的ITS片段（圖2-B），擴(kuò)增片段經(jīng)回收，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，結(jié)果在NCBI比對，序列片段與已公布的葡萄痂囊腔菌序列AY826763的相似度達(dá)99.9%，證實(shí)所分離病菌為葡萄痂囊腔菌（Elsinoe ampelina）。

2. 2 葡萄痂囊腔菌培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2. 2. 1 不同培養(yǎng)基對葡萄痂囊腔菌生長的影響 從表1可知，葡萄痂囊腔菌在4種培養(yǎng)基中均能生長，但生長速度不一致，在PSA和YEB培養(yǎng)基上病原菌生長比LB和CM培養(yǎng)基快，其中以在PSA培養(yǎng)基上的生長速度最快。差異顯著性分析結(jié)果表明，葡萄痂囊腔菌在PSA和YEB培養(yǎng)基上的生長速度顯著（P<0.05，下同）高于在LB和CM培養(yǎng)基上的生長速度，而在PSA與YEB培養(yǎng)基上的生長速度間無顯著差異（P>0.05，下同）。

2. 2. 2 不同蔗糖濃度對葡萄痂囊腔菌生長的影響

從表2可知，葡萄痂囊腔菌在蔗糖濃度3.0～7.5 g/L下均能生長，但生長速度不一致，其中在蔗糖濃度為4.5 g/L時(shí)生長最快，生長速度達(dá)0.03 cm/d。差異顯著性分析結(jié)果表明，蔗糖濃度4.5 g/L下的葡萄痂囊腔菌生長速度顯著高于在其他蔗糖濃度下的生長速度。

2. 2. 3 不同溫度對葡萄痂囊腔菌生長的影響 從表3可知，葡萄痂囊腔菌在10～30 ℃條件下均能生長，但生長速度不一致，其中在25 ℃下生長最快，平均生長速度達(dá)0.07 cm/d。差異顯著性分析結(jié)果表明，25 ℃條件下葡萄痂囊腔菌生長速度顯著高于在其他溫度條件下的生長速度。

2. 2. 4 不同光照條件對葡萄痂囊腔菌生長的影響

從表4可知，葡萄痂囊腔菌在不同光照條件下均能生長，且生長速度相近。差異顯著性分析結(jié)果表明，不同光照條件下病原菌生長速度差異不顯著。

2. 2. 5 不同pH對葡萄痂囊腔菌生長的影響 從表5可知，葡萄痂囊腔菌在pH 4時(shí)幾乎不生長，在pH 8時(shí)生長最快，平均生長速度為0.01 cm/d。差異顯著性分析結(jié)果表明，pH 8時(shí)葡萄痂囊腔菌生長速度顯著高于其他處理的菌落生長速度。

3 討論

本研究從感染黑痘病的黑巴拉多病葉片上分離、純化了病原菌并提取其DNA，PCR擴(kuò)增得到其ITS片段，片段測序后與NCBI已公布葡萄痂囊腔菌序列AY826763的相似度達(dá)99.9%，證實(shí)所分離病菌正是葡萄黑痘病菌E. ampelina，與肖歡等（2010）研究所得結(jié)果一致。

通過統(tǒng)計(jì)在不同培養(yǎng)條件下葡萄痂囊腔菌的生長情況，明確了蔗糖濃度和培養(yǎng)溫度是影響該菌生長的最大因素。本研究結(jié)果表明，葡萄痂囊腔菌在PSA、LB、YEB和CM培養(yǎng)基上均可生長，但在PSA和YEB上生長較快，尤其在PSA培養(yǎng)基上生長最快，在LB和CM培養(yǎng)基上只能緩慢生長；葡萄痂囊腔菌在10～30 ℃下均可生長，PSA培養(yǎng)基上的病菌在25 ℃下生長速度最快，達(dá)0.07 cm/d；病菌在3.0～7.5 g/L的蔗糖濃度下均能生長，尤其在4.5 g/L濃度下生長速度最快，達(dá)0.03 cm/d；光照時(shí)間長短對葡萄痂囊腔菌生長影響不明顯；葡萄痂囊腔菌在pH 4～12條件下均能生長，但在pH 6～10生長較快，最適pH為8，與前人的研究結(jié)果（王倩，2011）一致。在目前已有的研究報(bào)道中，葡萄痂圓孢菌多在PDA上培養(yǎng)，菌落直徑可達(dá)1 cm，但生長周期長達(dá)3個(gè)月，生長速度為0.03 cm/d（肖歡等，2010；王倩，2011；劉昆玉等，2013），如此漫長的培養(yǎng)周期嚴(yán)重影響了后續(xù)對黑痘病防治研究工作的開展。本研究通過對葡萄痂圓孢菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選和調(diào)優(yōu)，成功將其菌落生長至直徑1 cm的培養(yǎng)周期由3個(gè)月縮短至1個(gè)月，菌落生長速度提高了133%，極大縮短了黑痘病研究過程中獲取病原菌培養(yǎng)物的工作周期，為提高葡萄黑痘病研究的工作效率起到了推動作用。

4 結(jié)論

本研究從患黑痘病的黑巴拉多病葉上分離獲得黑痘病病原菌葡萄痂圓孢菌（E. ampelina）。葡萄痂圓孢菌生長受環(huán)境條件影響，其可在多種培養(yǎng)基上生長，其中對PSA培養(yǎng)基的利用最好；高濃度蔗糖對其生長有抑制作用；該菌生長不受光照的影響，在25 ℃下生長最好；其在pH 6～10下生長較好，生長環(huán)境偏堿性。可見，通過培養(yǎng)條件優(yōu)化能顯著加快其生長速度，提高培養(yǎng)效率。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）