張宇 何海霞 王萌 潘敏 李曉娜 鄭服叢

摘 要 Mlo基因是植物體內(nèi)具有負(fù)向調(diào)控功能的一類基因。為揭示HbMlo8基因在橡膠樹中的功能，分析了該基因在巴西橡膠樹不同組織中的表達(dá)情況，在機(jī)械損傷、干旱、白粉菌侵染、ABA、ETH、JA和H2O2處理下的表達(dá)模式。結(jié)果表明：HbMlo8基因在橡膠樹的樹皮、膠乳、花和葉中均有表達(dá)，主要在樹皮和花中表達(dá)。機(jī)械損傷、干旱、白粉菌侵染均會(huì)使HbMlo8在橡膠樹葉片中的表達(dá)量顯著上調(diào)。橡膠樹葉片中HbMlo8基因在ETH處理早期下調(diào)表達(dá)，處理10 h后開始顯著上調(diào)。在ABA、H2O2和JA處理下，HbMlo8基因均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)現(xiàn)象。說(shuō)明HbMlo8可能參與橡膠樹對(duì)白粉菌和非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程以及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，為闡明HbMlo8基因在橡膠樹生長(zhǎng)和逆境響應(yīng)機(jī)制中的功能研究打下良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；HbMlo8；表達(dá)分析；激素；逆境

中圖分類號(hào) S432.1；S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Mlo gene is a kind of gene with the function of negative regulation in plants. In order to reveal the function of HbMlo8 gene in rubber tree， this study analyzed the expression level of HbMlo8 in different tissues of rubber tree， and the expression profiles of HbMlo8 under the treatment of the leaves with wounding， drought， powdery mildew infection， ABA， ETH， JA and H2O2， respectively. The results showed that HbMlo8 gene expressed in bark， latex， flower and leaf， mainly in bark and flower. Wounding， drought and powdery mildew infection treatment positively induced the expression level of HbMlo8 significantly. The gene downregulated at early stages under ETH treatment， then began uncommonly upregulated at ten hours of treatment. ABA， H2O2 and JA could negatively induce HbMlo8 significantly. The study suggested that HbMlo8 had nothing to do with the resistance to powdery mildew， but involved in response mechanisms of stress resistance and signal transduction pathway of plant hormones. The study lays a good foundation for research the function of HbMlo8 in the growth and response mechanisms of stress in rubber tree.

Key words Hevea brasiliensis； HbMlo8； Expression analysis； Hormone； Stress environment

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.011

Mlo（Mildew resistance locus o）基因是植物中特有的一類基因家族[1]，最早是在大麥中發(fā)現(xiàn)[2]。大麥HvMlo編碼的蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，具有典型的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，含有7個(gè)跨膜螺旋區(qū)、一個(gè)核定位信號(hào)（K-K-K-V-R）和兩個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ位點(diǎn)（S/T-X-X-D/E）[2]。目前，該基因在植物中得到了普遍的研究?，F(xiàn)已鑒定出的Mlo基因有137個(gè)左右，存在于絕大多數(shù)的被子植物中[3-10]。對(duì)其功能的研究主要集中在大麥、擬南芥等植物中，研究表明HvMlo基因是大麥抗白粉菌的負(fù)向調(diào)控因子，具有負(fù)向調(diào)控植物防衛(wèi)機(jī)制的功能[11-12]。擬南芥中的AtMlo2、AtMlo4、AtMlo6、AtMlo7、AtMlo11、AtMlo12[13]、水稻中的OsMlo2[14]和小麥中的TaMlo1、TaMlo2、TaMlo3[15]等不僅具有類似HvMlo基因的感病功能，同時(shí)也參與了不同生物和非生物脅迫的調(diào)控作用，以及對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）作為世界上大規(guī)模種植的產(chǎn)膠樹種，其植株生長(zhǎng)和膠乳產(chǎn)量受白粉病害的嚴(yán)重制約[16]。干旱可導(dǎo)致巴西橡膠樹病蟲害發(fā)生率、死皮率增加，還增加災(zāi)害預(yù)報(bào)和管理成本[17-18]，降低膠乳產(chǎn)量[19]，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植株死亡[20]。因此，研究具有負(fù)向調(diào)控植物防衛(wèi)功能的Mlo基因在橡膠樹中的作用，有助于在分子水平上解決橡膠樹的生長(zhǎng)和膠乳產(chǎn)量受影響的問(wèn)題。筆者在巴西橡膠樹中已克隆出1個(gè)HbMlo基因，其ORF序列由1668個(gè)堿基組成，編碼555個(gè)氨基酸序列。HbMlo基因推導(dǎo)的蛋白具有1個(gè)Mlo保守結(jié)構(gòu)域，含有8次跨膜結(jié)構(gòu)，被命名為HbMlo8[21]。根據(jù)結(jié)構(gòu)分析推測(cè)其參與橡膠樹抗逆反應(yīng)。本研究使用熒光定量PCR技術(shù)，分析橡膠樹葉片中HbMlo8基因在干旱、機(jī)械損傷、白粉菌和植物激素[脫落酸（ABA）、乙烯利（ETH）、茉莉酸（JA）和過(guò)氧化氫（H2O2）]處理下的表達(dá)情況，以及在橡膠樹不同組織中該基因的表達(dá)水平，為探究HbMlo8基因在橡膠樹中的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HbMlo8基因?yàn)楣P者克隆基因[21]，以甘油菌保存于-80 ℃。

基因組織表達(dá)分析使用海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院教學(xué)基地的巴西橡膠樹無(wú)性系CATAS7-33-97 15年生的成齡開割樹為材料。白粉菌侵染實(shí)驗(yàn)使用保存的白粉菌生理小種HO-73，在生長(zhǎng)到兩蓬葉的巴西橡膠樹GT1實(shí)生苗上進(jìn)行。在CATAS7-33-97芽接苗上進(jìn)行干旱、機(jī)械損傷、脫落酸（ABA）、乙烯利（ETH）、茉莉酸（JA）和過(guò)氧化氫（H2O2）處理。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集和cDNA的合成 采集15年生的成齡開割橡膠樹上的膠乳、花、葉和樹皮，-80 ℃保存待用。白粉菌處理采用Wang等[22]的方法，在生長(zhǎng)到兩蓬葉的巴西橡膠樹GT1實(shí)生苗葉片上接種白粉菌，采集接種后白粉菌盛發(fā)期和后期的葉片。干旱處理將橡膠樹芽接苗置于培養(yǎng)箱中，模擬室外環(huán)境，采用斷水處理，連續(xù)采集處理前1 d和斷水后10 d深綠期的葉片[23]；機(jī)械傷害處理采用Piffanellip等[24]的方法，使用解剖刀在芽接苗的葉片上割出橫切面，再將離體葉片置于水中，收集處理后0.5、1、2、6、12 h的葉片。在芽接苗上分別噴施200 μmol/L ABA、1.0%（V/V）ETH、200 mmol/L JA和2%（V/V）H2O2，在處理后0、0.5、2、6、10、24、48、72 h采集樣品。將不同處理下不同時(shí)間段采集到的葉片置于-80 ℃冷凍保存。

采用何鑫等[25]方法提取橡膠樹膠乳、葉片、樹皮和花的總RNA。用超微量核酸蛋白分析儀檢測(cè)所提RNA的濃度、純度，并用1%甲醛變性膠電泳檢測(cè)RNA的完整性[26]。再用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到各樣品的cDNA。

1.2.2 巴西橡膠樹HbMlo8基因表達(dá)分析 采用primer5.0軟件設(shè)計(jì)HbMlo8基因熒光定量表達(dá)分析的引物HbMlo8F（5′-GTTATGGCTGCAAGTAGTGAC-3′）和HbMlo8R（5′-GAAGACCCTTTTCCAAGAGA-3′）。使用橡膠樹HbACTIN（F： GATGTGGATATCAGGAAGGA和R： CATACTGCTTGGAGCAAGA）、Hb18s RNA（F： GCTCGAAGACGATCAGATACC和R： TTCAGCCTTGCGACCATAC）和HbUBC4基因（F： TCCTTATGAGGGCGGAGTC和R： CAAGAACCGCACTTGAGGAG）為內(nèi)參基因，使用NormFinder軟件分析3個(gè)內(nèi)參基因在各種處理下的穩(wěn)定性[27]，最終選定HbACTIN作為本研究的內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)[28]，基因的表達(dá)水平通過(guò)2-ΔΔT法進(jìn)行計(jì)算[29]，分析HbMlo8基因在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖

所有處理采用3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，采用SAS 9.1.3進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析和Duncan檢驗(yàn)分析。作圖使用Origin2015科技繪圖軟件。

2 結(jié)果與分析

對(duì)成齡橡膠樹的樹皮、膠乳、花和葉進(jìn)行HbMlo8基因的表達(dá)分析，結(jié)果表明（圖1），該基因在測(cè)定的4個(gè)組織中均有所表達(dá)，其中樹皮中的表達(dá)水平最高，在花中的表達(dá)量次之，膠乳和樹葉中表達(dá)量相對(duì)較低。說(shuō)明HbMlo8基因主要在樹皮和花中表達(dá)。

白粉菌侵染橡膠樹實(shí)生苗的葉片后，葉片中HbMlo8基因的表達(dá)情況如圖2所示：隨著白粉菌侵染的加重，HbMlo8基因的表達(dá)水平差異性顯著，呈現(xiàn)先上升后下降的規(guī)律。在5級(jí)病害時(shí)，基因的表達(dá)量達(dá)到處理前的1.6倍。7級(jí)病害時(shí)，HbMlo8表達(dá)水平顯著下降，但仍高于處理前水平。說(shuō)明在1～5級(jí)白粉病病害范圍內(nèi)，白粉菌侵染會(huì)誘導(dǎo)HbMlo8表達(dá)量的顯著增加。

機(jī)械傷害處理橡膠樹葉片后的表達(dá)情況見圖3，可見，機(jī)械傷害能夠誘導(dǎo)HbMlo8基因在橡膠樹葉片中的表達(dá)。在機(jī)械傷害處理葉片1 h后，HbMlo8基因在葉片中顯著性上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到最高峰，隨后又顯著下調(diào)。說(shuō)明HbMlo8在橡膠樹機(jī)械傷害的早期就起到調(diào)節(jié)作用。

干旱處理橡膠樹芽接苗10 d，采集葉片進(jìn)行基因表達(dá)分析結(jié)果見圖4，可見，在干旱脅迫處理下，葉片中HbMlo8基因的表達(dá)量隨著干旱處理天數(shù)的增加而增加，到干旱脅迫處理9 d時(shí)，基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，達(dá)到最高值，是處理0 d的6.5倍。說(shuō)明橡膠樹HbMlo8基因的表達(dá)水平受干旱脅迫影響。

ABA、ETH、JA 3種激素和H2O2處理橡膠樹葉片后，HbMlo8基因表達(dá)情況如圖5所示，ABA處理葉片后，HbMlo8基因顯著下調(diào)表達(dá)，基因表達(dá)量隨著處理時(shí)間的增加不斷下降。用ETH處理過(guò)的葉片，在處理后的2 h內(nèi)，葉片中HbMlo8基因的表達(dá)量逐漸上升。在處理后6 h，該基因顯著下調(diào)表達(dá)，處理10 h表達(dá)量達(dá)到最小值。隨后表達(dá)量開始顯著上升，至處理后72 h時(shí)，HbMlo8基因表達(dá)量達(dá)到表達(dá)最高值。用JA處理后，在處理0.5 h葉片中的HbMlo8基因表達(dá)量顯著上升，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，基因表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)。H2O2作用下的葉片中，HbMlo8基因的表達(dá)量在處理2 h顯著上升，達(dá)到表達(dá)水平最高峰，隨后隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)基因表達(dá)量持續(xù)下降。

3 討論

Mlo基因是一類具有保守性的多基因家族。本研究中，橡膠樹HbMlo8在樹皮、膠乳、花和葉中均有表達(dá)，但主要在樹皮和花中表達(dá)。擬南芥AtMlo7和AtMlo8在絕大多數(shù)組織中都有所表達(dá)[30]，甜瓜CmMlo1、CmMlo2、CmMlo3基因同樣在測(cè)定的組織中均有表達(dá)。其中，CmMlo1主要在子葉和花中表達(dá)，CmMlo2主要在真葉中表達(dá)，CmMlo3則主要在幼果、根和花中表達(dá)[31-32]。野薔薇RmMlo在野薔薇的根中不表達(dá)[33]。說(shuō)明Mlo基因在大多數(shù)植物的不同組織中均有所表達(dá)，在同一植物中，不同的Mlo基因表達(dá)的主要部位不同。在白粉菌誘導(dǎo)下，從侵染初期到5級(jí)病害時(shí)，橡膠樹葉片中HbMlo8基因的表達(dá)量持續(xù)顯著上升，隨后顯著下降。在葡萄VvMlo7、VvMlo13[34]、甜瓜葉片中CmMLO2[31]、月季RhMLO1和RhMLO2基因[35]等大多數(shù)植物中，隨著白粉菌侵染的加重，Mlo基因表達(dá)差異性顯著，呈現(xiàn)先上升后下降的規(guī)律。符合大麥HvMlo正向調(diào)控感白粉病作用機(jī)制[36]。

本研究中，在機(jī)械傷害處理下，橡膠樹葉片中HbMlo8基因的表達(dá)水平在處理后1 h顯著升高，達(dá)到最大值。橡膠樹HbMlo8隨著干旱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量顯著上升。說(shuō)明葉片中HbMlo8基因受機(jī)械傷害和干旱誘導(dǎo)。目前，已在辣椒CaMlo2基因的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因參與干旱反應(yīng)[37]。推測(cè)HbMlo8基因可能正向調(diào)控橡膠樹對(duì)干旱和機(jī)械傷害的脅迫作用，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。橡膠樹作為熱帶經(jīng)濟(jì)作物，干旱會(huì)使橡膠樹病蟲害加重、死皮率增加[17-18]，影響膠乳產(chǎn)量[19]。HbMlo8基因在此脅迫下的研究對(duì)提高橡膠樹膠乳產(chǎn)量具有重要意義。Mlo基因不僅與植物的抗白粉病過(guò)程[38]、植物的逆境脅迫響應(yīng)[24]有關(guān)，還與植物的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)[13]。本研究中，在JA處理橡膠樹芽接苗0.5 h后，基因表達(dá)量顯著下調(diào)。ETH會(huì)誘導(dǎo)HbMlo8基因表達(dá)水平在處理初期顯著上升，隨后顯著下調(diào)再顯著上調(diào)。說(shuō)明JA和ETH在處理的早期便誘導(dǎo)HbMlo8基因表達(dá)量發(fā)生變化。HbMlo8基因在ABA處理的全過(guò)程中其表達(dá)量均處于下降趨勢(shì)。HbMlo8基因在H2O2誘導(dǎo)下，其表達(dá)水平在處理后2 h顯著上升，緊接著顯著下降。表明HbMlo8基因的表達(dá)水平受ABA和H2O2調(diào)節(jié)。在辣椒CaMlo2基因的研究中，采用基因沉默發(fā)現(xiàn)CaMlo2基因是ABA信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子[38]，由此推測(cè)HbMlo8基因也參與橡膠樹體內(nèi)JA、ETH、ABA和H2O2的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)JA能夠誘導(dǎo)橡膠樹的乳管分化，促進(jìn)橡膠生物合成[35，39]，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育[40]，ETH能夠刺激膠乳的產(chǎn)生[38]。ABA在植物干旱和病蟲害等逆境脅迫中起到重要作用[41]，H2O2在應(yīng)對(duì)逆境產(chǎn)生的抗病防御反應(yīng)和調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育等諸多生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[42]。本研究為進(jìn)一步探究HbMlo8基因在橡膠樹逆境中的作用機(jī)制以及膠乳的高量生產(chǎn)打下良好基礎(chǔ)。

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