劉子記 詹園鳳 朱婕 賀滉

摘 要 建立快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的種子純度檢測(cè)技術(shù)是保證西瓜雜交種質(zhì)量的有效措施。利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)小型西瓜‘美月雜交種純度進(jìn)行鑒定。從均勻分布于不同西瓜染色體上的88對(duì)SSR引物中篩選出8對(duì)引物在‘美月親本間表現(xiàn)明顯的多態(tài)性，分別位于第1、2、3、6、8、9、10染色體上，多態(tài)性比率為9.09%，多態(tài)性標(biāo)記均為共顯性標(biāo)記。為了提高檢測(cè)效率，結(jié)合多態(tài)性片段大小，同時(shí)對(duì)標(biāo)記SSR48和SSR62進(jìn)行擴(kuò)增，可成功獲得221 bp和131 bp的兩組特異性條帶，成功建立了雙重PCR體系。為了提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，選用位于西瓜不同染色體上的4對(duì)共顯性標(biāo)記對(duì)‘美月進(jìn)行純度檢測(cè)，4對(duì)標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果高度一致，‘美月雜交種純度為99.44%。標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間表型鑒定結(jié)果比較分析表明，2種鑒定結(jié)果高度一致。研究結(jié)果可為西瓜雜交品種純度快速檢測(cè)和品種權(quán)保護(hù)提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 小型西瓜；雜交種；雙重PCR技術(shù)；純度鑒定

中圖分類號(hào) S651 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

＼ 西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. & Nakai]為葫蘆科（Cucurbitaceae）西瓜屬（Citrullus）一年生蔓性草本植物[1]，原產(chǎn)非洲南部[2]，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)[3]，包括3個(gè)亞種：C. lanatus subsp. lanatus L.，古老的栽培種群組，生長(zhǎng)于南非；C. lanatus subsp. mucosospermus L.，籽用型西瓜群組；C. lanatus subsp. vulgaris L.，果肉具有甜味的西瓜群組，現(xiàn)代栽培的優(yōu)良西瓜品種由此亞種衍生而來(lái)[4]。西瓜在中國(guó)已有上千年的栽培歷史，中國(guó)是西瓜最大的生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，平均年產(chǎn)量6 800萬(wàn)t[5]。其果實(shí)脆嫩，味甜多汁，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多種礦物質(zhì)和維生素。隨著人民生活水平的提高，飲食習(xí)慣的變化，種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，西瓜栽培面積逐漸擴(kuò)大，已成為增加農(nóng)民收人和促進(jìn)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要作物之一。選育適應(yīng)不同地區(qū)和栽培模式的西瓜新品種是當(dāng)今西瓜育種的主要任務(wù)。小型西瓜外形美觀，單瓜重為1.0～2.5 kg，含糖量可達(dá)13%～14%，肉質(zhì)多汁脆甜，生育期短。因其品質(zhì)優(yōu)良、早熟，市場(chǎng)價(jià)格較高，經(jīng)濟(jì)效益遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通西瓜，種植面積呈現(xiàn)穩(wěn)定增長(zhǎng)的趨勢(shì)。

中國(guó)西瓜生產(chǎn)用種已100%實(shí)現(xiàn)雜種化。種子是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣直接影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和優(yōu)良品種的增產(chǎn)潛力，開展種子純度檢測(cè)對(duì)保證種子質(zhì)量和提高生產(chǎn)效益具有重要意義。雜交種純度檢驗(yàn)的常用方法包括形態(tài)鑒定、田間鑒定和同工酶電泳技術(shù)鑒定等[6]。種子形態(tài)鑒定準(zhǔn)確性較差；田間鑒定周期較長(zhǎng)，表型易受栽培措施和環(huán)境條件影響；同工酶鑒定多態(tài)性不夠豐富，且有組織和器官特異性[7]。西瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，傳統(tǒng)的鑒定方法難以滿足雜交種純度鑒定在精確度方面的要求。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，使得從基因組水平上檢測(cè)雜交種純度成為可能。分子標(biāo)記技術(shù)能夠從DNA水平上檢測(cè)子代與親本間的微小差異，不受時(shí)空限制，可以大大縮短檢驗(yàn)時(shí)間[8]。歐陽(yáng)新星等[9]利用RAPD標(biāo)記對(duì)‘無(wú)籽京欣一號(hào)西瓜種子純度進(jìn)行鑒定，多態(tài)性引物可有效區(qū)分母本與雜交種。劉澤發(fā)等[10]采用SRAP標(biāo)記開展了西瓜品種紅小玉雜交種純度鑒定，分子鑒定結(jié)果與大田鑒定結(jié)果高度吻合。周賢達(dá)等[11]以西瓜雜交一代品種黑寶、紅與黑、黑優(yōu)美及其親本為試驗(yàn)材料，利用EST-SSR標(biāo)記對(duì)西瓜雜交種純度進(jìn)行了快速鑒定，鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致。由于RAPD標(biāo)記重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，SRAP標(biāo)記多為顯性標(biāo)記，EST-SSR標(biāo)記多態(tài)性較低，利用RAPD、SRAP、EST-SSR標(biāo)記進(jìn)行純度鑒定具有一定的局限性。在真核生物基因組中SSR標(biāo)記具有數(shù)量豐富、分布均勻、共顯性遺傳、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行遺傳多樣性分析、雜交種純度鑒定及分子輔助育種的理想標(biāo)記類型[12]。SSR標(biāo)記在小型西瓜雜交種純度鑒定方面的研究鮮有報(bào)道。本研究以小型西瓜品種‘美月為研究對(duì)象，旨在利用SSR標(biāo)記建立小型西瓜雜交種純度鑒定技術(shù)，以期為小型西瓜育種、制種、良種的及時(shí)銷售及品種保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為小型西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.） Matsum. & Nakai]雜交種一代‘美月、母本材料MH-35-1和父本材料MH-9-1。‘美月為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所選育的早熟小型西瓜雜交品種，全生育期冬播75～80 d，夏播63～65 d，果實(shí)平均發(fā)育期為28 d，植株生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，第一雌花節(jié)位6～8節(jié)，雌花間隔4～5節(jié)。果實(shí)短橢圓形，果型指數(shù)為1.29，外觀清秀，深綠果皮覆墨綠細(xì)齒條帶14～15條，果肉鮮紅色，色澤均勻，中心含糖量為12.5%～13%，最高可達(dá)14%，邊緣含糖量為9%～10%，肉質(zhì)細(xì)膩無(wú)纖維，口感極佳，果皮薄，皮厚0.4～0.5 cm，抗病性強(qiáng)，適于保護(hù)地栽培。將供試材料播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，待植株長(zhǎng)至2片真葉時(shí)取材備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 待植株長(zhǎng)至2片真葉時(shí)，摘取1片真葉，利用Sharp等[13]的CTAB法提取MH-35-1、MH-9-1和‘美月單株的基因組DNA。

1.2.2 多態(tài)性標(biāo)記分析 參考已開發(fā)的西瓜SSR標(biāo)記和構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜[14]，選擇了均勻分布于西瓜11條染色體上的88對(duì)SSR標(biāo)記，其中11對(duì)位于1號(hào)染色體，9對(duì)位于2號(hào)染色體，7對(duì)位于3號(hào)染色體，8對(duì)位于4號(hào)染色體，9對(duì)位于5號(hào)染色體，7對(duì)位于6號(hào)染色體，7對(duì)位于7號(hào)染色體，5對(duì)位于8號(hào)染色體，8對(duì)位于9號(hào)染色體，8對(duì)位于10號(hào)染色體，9對(duì)位于11號(hào)染色體。以母本材料MH-35-1和父本材料MH-9-1基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，篩選在親本間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR標(biāo)記。

PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中包括9 mmol/L Tris-HCl（pH7.6），55 mmol/L KCl，1.2 mmol/L MgCl2，

0.20 mmol/L dNTPs，55 ng引物，0.80 U Taq DNA聚合酶，75 ng模板DNA。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。PCR產(chǎn)物保存于10 ℃。4 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2 μL上樣緩沖液混合經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=29 ∶ 1）于200 V電泳4 h，銀染顯色進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 雙重PCR技術(shù)建立 參考多態(tài)性標(biāo)記目的片段大小及引物之間的互補(bǔ)性，進(jìn)行引物組合，以母本材料MH-35-1和父本材料MH-9-1基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)合單引物擴(kuò)增結(jié)果，將多態(tài)性片段進(jìn)行分組，建立雙重PCR擴(kuò)增技術(shù)。

1.2.4 分子標(biāo)記種子純度鑒定 以‘美月小型西瓜單株DNA為模板，利用在親本材料間表現(xiàn)為共顯性的SSR標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)特異譜帶的有無(wú)檢測(cè)雜交種的純度。品種純度=（1-a/A）×100%，其中A為待測(cè)‘美月種子數(shù)目，a為單獨(dú)具有母本譜帶特征或單獨(dú)具有父本譜帶特征或既不同于‘美月譜帶特征也不同于父母本譜帶特征的植株數(shù)目。

1.2.5 田間純度鑒定 將取材后的西瓜幼苗按照原順序移栽到地勢(shì)平坦、土質(zhì)肥沃的試驗(yàn)基地，試驗(yàn)地的管理參照小型西瓜栽培措施，在果實(shí)成熟期依據(jù)品種的特征特性逐株進(jìn)行鑒定，將標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性標(biāo)記篩選

以‘美月母本材料MH-35-1和父本材料MH-9-1為模板篩選88對(duì)均衡分布于西瓜11條染色上的SSR引物，其中8對(duì)引物在親本間能擴(kuò)增出明顯的多態(tài)性，多態(tài)性比率為9.09%，多態(tài)性標(biāo)記均為共顯性標(biāo)記，擴(kuò)增出互補(bǔ)的特異譜帶能將雜交種與親本材料區(qū)分開來(lái)，多態(tài)性片段大小127～228 bp，分別位于西瓜第1、2、3、6、8、9、10染色體上（表1、圖1）。

2.2 雙重PCR技術(shù)建立

結(jié)合多態(tài)性引物擴(kuò)增模式及多態(tài)性片段大小，將多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行組合。SSR48多態(tài)性片段大小為221 bp，SSR62多態(tài)性片段大小為131 bp，比較兩對(duì)標(biāo)記多態(tài)性片段對(duì)應(yīng)區(qū)域發(fā)現(xiàn)，多態(tài)性片段區(qū)域雜帶較少。分別以母本材料MH-35-1、父本材料MH-9-1和‘美月單株基因組DNA為模板，同時(shí)對(duì)引物SSR48和SSR62進(jìn)行擴(kuò)增，多態(tài)性片段分布在兩個(gè)區(qū)域，第1個(gè)區(qū)段為引物SSR48多態(tài)性片段分布區(qū)域，第2個(gè)區(qū)段為引物SSR62多態(tài)性片段分布區(qū)域。從擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19號(hào)單株僅具有母本特異譜帶，不具有父本特異譜帶，為母本自交株（圖2）。其余單株均同時(shí)具有母本特異譜帶和父本特異譜帶，為真實(shí)雜交種。兩對(duì)標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果一致。

2.3 結(jié)合多對(duì)標(biāo)記鑒定雜交種純度

為了確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用另外2對(duì)位于西瓜不同染色體上的共顯性標(biāo)記SSR21和SSR71對(duì)180株‘美月小型西瓜進(jìn)行純度鑒定，從標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，179個(gè)單株既具有母本特異譜帶也具有父本特異譜帶，屬于真實(shí)的雜交種，19號(hào)單株缺少父本特異帶，與母本擴(kuò)增譜帶一致，說(shuō)明19號(hào)單株為母本自交株，與標(biāo)記SSR48和SSR62檢測(cè)結(jié)果一致（圖3），‘美月小型西瓜品種的純度為99.44%。

2.4 田間種子純度鑒定

果實(shí)成熟期田間調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母本MH-35-1植株生長(zhǎng)勢(shì)中等，主蔓第6～7節(jié)出現(xiàn)第1雌花，果實(shí)外形美觀，果實(shí)圓球形，瓤肉鮮紅色，皮厚0.45 cm左右，較韌。父本MH-9-1果實(shí)長(zhǎng)橢圓形，花皮覆墨綠寬鋸齒條帶，瓤肉紅色，皮厚0.5 cm左右，較脆，植株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)?！涝轮仓晟L(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，果實(shí)整齊、外觀漂亮，短橢圓形，深綠果皮覆墨綠細(xì)齒條帶，瓤肉紅色，果肉組織細(xì)膩，無(wú)纖維，口感極佳，抗病能力強(qiáng)，皮厚0.4～0.5 cm，較脆。19號(hào)植株與母本性狀一樣，易座果，果實(shí)圓形，皮較韌，植株長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)。其余植株均具有‘美月小型西瓜品種的典型特征，生長(zhǎng)一致，果實(shí)外觀漂亮，短橢圓形，深綠果皮覆墨綠細(xì)齒條帶，果皮較脆。田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與分子標(biāo)記鑒定結(jié)果高度一致，試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明利用SSR標(biāo)記進(jìn)行小型西瓜雜交種純度鑒定是可行的。

3 討論與結(jié)論

3.1 分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為高效、準(zhǔn)確檢測(cè)西瓜品種純度提供技術(shù)支撐

我國(guó)西瓜的栽培面積及產(chǎn)量均居世界首位，自20世紀(jì)80年代以來(lái)，西瓜雜交品種在我國(guó)迅速普及推廣，栽培面積逐年擴(kuò)大，在人工制種過(guò)程中，常因生物混雜、母本自交和機(jī)械混雜導(dǎo)致種子不純，給生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[15]。雜交種純度檢驗(yàn)的常用方法主要包括形態(tài)鑒定、田間鑒定和同工酶電泳技術(shù)鑒定等。種子形態(tài)鑒定很難將母本相同父本不同的西瓜品種區(qū)別開[16]。西瓜田間純度鑒定周期長(zhǎng)，占地多，費(fèi)用高[17]。黃永紅等[18]利用過(guò)氧化物同工酶對(duì)6個(gè)西瓜雜交組合進(jìn)行了純度鑒定研究，但同工酶具有組織和器官特異性，難以發(fā)掘統(tǒng)一的特征譜帶來(lái)檢測(cè)不同西瓜雜交種的純度[19]。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展能夠從基因組水平檢測(cè)微小遺傳差異，能夠?qū)⑦z傳差異較小的品種區(qū)分開來(lái)，為雜交種純度精確鑒定帶來(lái)契機(jī)。AFLP、RAPD、SRAP標(biāo)記相繼應(yīng)用于西瓜品種純度鑒定[9-10，20]，但這幾種標(biāo)記在應(yīng)用的過(guò)程中存在一定的局限性，如操作復(fù)雜、顯性遺傳、穩(wěn)定性較差等。與前幾種標(biāo)記相比，采用SSR標(biāo)記進(jìn)行小型西瓜雜交種純度鑒定具有無(wú)可比擬的優(yōu)越性。本試驗(yàn)采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定小型西瓜‘美月品種純度，能夠準(zhǔn)確地將母本自交種與雜交種區(qū)分開來(lái)，與田間純度鑒定結(jié)果高度一致。

3.2 雙重PCR技術(shù)構(gòu)建可以顯著提高檢測(cè)效率

雙重PCR技術(shù)與單一PCR相比，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏和可靠的優(yōu)點(diǎn)。韓廣濤等[21]建立了雙重PCR技術(shù)，能夠同時(shí)對(duì)馬鈴薯環(huán)腐病和黑脛病進(jìn)行檢測(cè)，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間和費(fèi)用。截止目前，采用雙重PCR技術(shù)檢測(cè)西瓜品種純度的研究鮮有報(bào)道，本研究利用在‘美月親本間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR引物，在充分考慮多態(tài)性片段大小和多態(tài)性區(qū)域雜帶存在與否的情況下進(jìn)行組合，成功建立雙重PCR技術(shù)，單次PCR過(guò)程可同時(shí)采用2對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)小型西瓜雜交種進(jìn)行純度鑒定，不僅能夠節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，而且能夠提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。該技術(shù)的建立能夠?qū)τ酌缙诘奈鞴现仓赀M(jìn)行快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)，對(duì)保證小型西瓜品種‘美月雜交種純度和良種的及時(shí)銷售具有重要意義。

3.3 多引物結(jié)合可以顯著提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性

采用單一引物進(jìn)行雜交種純度檢測(cè)雖然可以有效區(qū)分混入雜交種中的親本自交種，但對(duì)于混雜其中的其他品種很難區(qū)分開來(lái)，然而選取多對(duì)位于不同染色體上的標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，恰恰可以實(shí)現(xiàn)這一目的[22]。為確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，進(jìn)一步排除生物混雜和機(jī)械混雜，本研究選取4對(duì)位于西瓜不同染色體上的共顯性SSR標(biāo)記檢測(cè)‘美月雜交種純度，4對(duì)標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果完全一致，‘美月雜交種中僅混雜了母本自交種，這可能是由于同株雄花花粉被昆蟲傳到雌蕊柱頭所致。分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間形態(tài)鑒定結(jié)果完全一致，該研究結(jié)果表明利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)‘美月雜交種純度是切實(shí)可行的。

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