楊海旭，　鄧百萬，2，　陳文強(qiáng)，2，　虞小燕，　解修超，2

(1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心， 陜西 漢中 723000)

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秦巴山區(qū)蜜環(huán)菌酯酶同工酶的研究

楊海旭1，鄧百萬1，2，陳文強(qiáng)1，2，虞小燕1，解修超1，2

(1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心， 陜西 漢中 723000)

[摘要]通過垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)對18個(gè)蜜環(huán)菌菌株同工酶進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，18個(gè)蜜環(huán)菌菌株酯酶同工酶的活性不同，酶譜條帶數(shù)在1～7條之間。通過相似度指數(shù)確定不同蜜環(huán)菌種類之間的親緣關(guān)系，其中京234-1和京234-2，M-8、M-12和壽縣2號，京234-5和A-12，東北5號和東北4號，云南-1、云南-2、A-13的相似系數(shù)為1.000，說明它們之間的親緣關(guān)系非常近；M-15、東北5號、東北4號和京234-1、京234-2、京234-3、京234-4，城固與京234-3、京234-4，云南-1、云南-2、A-13和京234-3、京234-4的相似程度最低，相似系數(shù)僅為0。

[關(guān)鍵詞]蜜環(huán)菌；酯酶同工酶；電泳

蜜環(huán)菌(Armillariamellea)別名蜜環(huán)蕈、榛蘑、苞谷蕈、青岡蕈。真菌界(Eukaryota)，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，擔(dān)子菌綱(Basidiomycetae)，傘菌目(Hymenomycetes)白磨科(Tricholomataceae)蜜環(huán)菌屬(Armillariella)[1-2]。蜜環(huán)菌是蘭科天麻屬植物天麻的共生菌，它們二者形成菌根，促進(jìn)天麻的生長[3]，在長期使用過程中易發(fā)生退化[4]。同時(shí)，由于種植戶在菌種管理方面存在缺陷，出現(xiàn)同種菌種被冠以不同的名字、代號，不同菌株又命以同種名字，導(dǎo)致菌種混亂，使得蜜環(huán)菌在實(shí)際栽培及天麻生產(chǎn)中產(chǎn)生諸多問題。

同工酶是生物體內(nèi)催化相同反應(yīng)而分子結(jié)構(gòu)不同的酶，其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫性能等方面都存在明顯差異[5]。同工酶技術(shù)廣泛應(yīng)用在真菌分類學(xué)中，包括菌種鑒定和菌種關(guān)系的研究、誘變育種、雜交育種、種質(zhì)資源遺傳圖以及連鎖群識別等[6]。尤其是在鑒定食用菌上優(yōu)于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法，其操作簡便，準(zhǔn)確度高[7]。近年來，大量學(xué)者對真菌的酯酶同工酶進(jìn)行研究，如李守勉等[8]對杏鮑菇、鄭素月等[9]對平菇、胡先運(yùn)[10]對花臉香蘑、韋仕巖[11]對金福菇、彭浩等[12]對黑木耳等，充分說明了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。酯酶同工酶的研究發(fā)現(xiàn)，真菌同工酶分析容易受到取樣部位、培養(yǎng)條件、傳代次數(shù)等的影響[13]，導(dǎo)致結(jié)論不同甚至完全相反。本研究選取秦巴山區(qū)18個(gè)蜜環(huán)菌菌株，在培養(yǎng)條件、傳代次數(shù)相同的情況下對18個(gè)蜜環(huán)菌菌株酯酶同工酶進(jìn)行研究，以便于管理并建立秦巴山區(qū)蜜環(huán)菌種質(zhì)資源庫，并為資源保護(hù)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

京234-1，京234-2，京234-3，京234-4，京234-5，M-8，M-12，M-15，A-9，A-12，壽縣2號，城固，東北5號，東北4號，中原，云南-1，云南-2，A-13，依次編號為ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4、ZY-5、ZY-6、ZY-7、ZY-8、ZY-9、ZY-10、ZY-11、ZY-12、ZY-13、ZY-14、ZY-15、ZY-16、ZY-17、ZY-18。其中ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4、ZY-6、ZY-8、ZY-10、ZY-11、ZY-12、ZY-13、ZY-14、ZY-17、ZY-18由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供，ZY-5、ZY-7、ZY-9、ZY-15、ZY-16為自主分離。1.1.2主要儀器

超凈工作臺(SW-CJ-IF，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，生化培養(yǎng)箱(5PX-250B5H-Ⅱ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)，恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZHWY-B2112B，上海志城分析儀器制造有限公司)，超低溫冷凍冰箱(MDF-U32V，日本三洋電器集團(tuán))，電子天平(BSA8201，北京賽多利科學(xué)儀器有限公司)，電泳儀(DYY-Ⅲ，北京百晶生物技術(shù)有限公司)，生物顯微電腦圖像分析系統(tǒng)(GEL-RAD)。

1.1.3主要藥品和試劑

葡萄糖，瓊脂，蛋白胨，玉米粉，75%酒精，KH2PO4，K2HPO4，MgSO4，VB1，丙酮，超純水，堅(jiān)牢藍(lán)，α-乙酸萘酯，β-乙酸萘酯，蔗糖，溴酚藍(lán)，過硫酸銨，TEMED，Tris，鹽酸，甘氨酸，丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺。

1.1.4培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(CPDA)：馬鈴薯(去皮)200.0 g，玉米粉50.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂12.0 g，KH2PO45.0 g，MgSO43.0 g，蛋白胨5.0 g，VB1 10.0 mg，pH自然，加水定容至1 000 mL；液體培養(yǎng)基：CPDA培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.2方法

1.2.1菌索培養(yǎng)

取固體培養(yǎng)基上活化的蜜環(huán)菌菌索加入到液體培養(yǎng)基中，24 ℃靜置培養(yǎng)18 d。過濾靜置培養(yǎng)的菌索，用蒸餾水沖洗2～3次，用無菌濾紙吸干水分，稱取5.0 g菌索加2.0 g石英砂和5.0 mL、pH 6.8的Tris-Hcl緩沖液，冰浴下研磨，分裝至2.5 mL離心管中，4 ℃下8 000 r/min冷凍離心15 min，吸取上清液，重復(fù)一次，置于4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳及染色

電泳體系：電極緩沖液采用Tris-Glycine系統(tǒng)，pH 8.3；凝膠采用10.0%的分離膠和5.0%的濃縮膠。上樣量20 μL，溴酚藍(lán)指示劑1滴，上層加10%的蔗糖5 μL，點(diǎn)樣完畢后4 ℃下進(jìn)行電泳。電泳初期電壓80 V，樣品進(jìn)入分離膠后穩(wěn)壓在120 V，電泳時(shí)間4 h左右。

染色和固定：酶染色液采用堅(jiān)牢藍(lán)染色系統(tǒng)。稱取100 mg堅(jiān)牢藍(lán)，溶于150 mL 0.1 mol/L pH 6.2的磷酸緩沖液中，過濾后使用；使用再稱取50 mg α-乙酸萘酯，50 mg β-乙酸萘酯溶于3 mL丙酮中，然后逐漸倒入上述溶液中，邊加邊攪使其均勻混合即可。

電泳完畢將凝膠轉(zhuǎn)移至染色液中，在37 ℃下染色，待看到褐色的酯酶同工酶區(qū)帶時(shí)，用水漂洗幾次，保存，照相。

1.2.3數(shù)據(jù)記錄和分析

測量相對遷移率(Rf)：Rf=X1/X2，其中X2為固定染色前凝膠中指示劑的遷移距離，X1為固定染色后凝膠中酶蛋白區(qū)帶的遷移距離，測量Rf時(shí)，用直尺測量，應(yīng)以酶帶的中部位置為準(zhǔn)。

繪制酯酶同工酶模式圖：依據(jù)酶譜中酶帶的差異以及Rf值繪制酯酶同工酶模式圖，由于菌株之間酶帶顏色和寬窄的不同，可將酶帶分為三級：一級酶帶(色深而寬)，二級酶帶(色較深而寬)，三級酶帶(色較淺而窄)。

相似性系數(shù)分析：將凝膠上出現(xiàn)的條帶分類，按照條帶有無分別賦值，有帶記為1，無帶記為0，計(jì)算酶譜之間的相似性系數(shù)(Sc)：Sc=2Nab/(Na+Nb)，式中Nab為Rf值相同的酶帶數(shù)，Na和Nb為菌株a和菌株b各自的酶帶數(shù)；當(dāng)所比菌株的酶帶數(shù)相同且全部為共有時(shí)S=1，當(dāng)所比物種沒有一條共有酶帶時(shí)S=0。

聚類分析：根據(jù)酯酶同工酶電泳結(jié)果，在凝膠的某個(gè)相同的遷移率位置上有條帶的記為1，無條帶的記為0，用NTSYS-pc軟件算出菌株間的遺傳相似系數(shù)，并進(jìn)行聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1蜜環(huán)菌酯酶同工酶酶譜分析

圖1　18株蜜環(huán)菌酯酶同工酶電泳譜圖

在分離膠濃度為10.0%，濃縮膠濃度為5.0%的電泳條件下對供試的18株蜜環(huán)菌酯酶同工酶電泳，得到酯酶同工酶酶譜圖(圖1)。依據(jù)酶譜圖中酶帶的差異繪制酯酶同工酶模式圖(圖2)，菌株的編號從左到右依次為ZY-1到ZY-18。

圖1結(jié)果顯示，供試18株蜜環(huán)菌酯酶均表現(xiàn)出較強(qiáng)的酯酶活性。18株蜜環(huán)菌共檢測到70條酯酶同工酶譜帶，各個(gè)菌株有1～7條不等的酶帶，多數(shù)為4～6條。其中，ZY-4出現(xiàn)7個(gè)酯酶同工酶譜帶，ZY-6、ZY-9、ZY-11號出現(xiàn)6個(gè)酯酶同工酶譜帶，ZY-1、ZY-2、ZY-13、ZY-14、ZY-15出現(xiàn)5個(gè)酯酶同工酶譜帶，ZY-3、ZY-5、ZY-7、ZY-10有3個(gè)同工酶譜帶，ZY-16、ZY-17、ZY-18有2個(gè)同工酶譜帶，ZY-8只有1個(gè)同工酶譜帶。供試的18個(gè)蜜環(huán)菌菌株得到了16個(gè)酶譜類型，其中ZY-1和ZY-2；ZY-5、ZY-7和ZY-10；ZY-6、ZY-9和ZY-11菌株的帶型基本相似。

圖2　18種蜜環(huán)菌酯酶同工酶模式圖

圖2結(jié)果顯示，ZY-6和ZY-11的一級酶帶最多有5條；ZY-9有4條一級酶帶；ZY-15有3條一級帶；ZY-1、ZY-2、ZY-7、ZY-10、ZY-13各有2條一級帶；ZY-3、ZY-4、ZY-5、ZY-8、ZY-14、ZY-16、ZY-17、ZY-18各有1條一級帶；ZY-12無一級帶。

2.218個(gè)蜜環(huán)菌菌株酯酶同工酶Rf值比較

根據(jù)1.2.3的方法測量和計(jì)算出18株蜜環(huán)菌酯酶同工酶Rf值，見表1。

表1　18株蜜環(huán)菌酯酶(EST)同工酶Rf值比較

結(jié)果表明，遷移率不同的譜帶有16條，其遷移率在0.125～0.850之間，分別為0.125、0.250、0.313、0.375、0.400、0.438、0.463、0.513、0.538、0.575、0.638、0.663、0.700、0.775、0.800、0.850。V酶帶是ZY-15所特有，VII酶帶是ZY-12所特有，IV酶帶和IX是ZY-13、ZY-14特有，XII酶帶和XV酶帶是ZY-4所特有；I酶帶只有ZY-6、ZY-9、ZY-11譜圖中出現(xiàn)；VI帶只有ZY-4和ZY-15有；ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4不具有X酶帶；ZY-3、ZY-4、ZY-8、ZY-3、ZY-13、ZY-14不具有XI酶帶。這些差異性可作為18個(gè)菌株相互區(qū)別的鑒定依據(jù)。根據(jù)同工酶Rf值可以計(jì)算出不同酶帶分布頻率，I-XVI酶帶的分布頻率依次為：16.7%、33.3%、33.3%、11.1%、5.6%、11.1%、16.7%、5.6%、11.1%、77.8%、72.2%、5.6%、61.1%、16.7%、5.6%、22.2%。經(jīng)分析得出X酶帶分布頻率最高為77.8%，其次是XI酶帶分布頻率為72.2%，V、VIII、XII和XV酶帶分布頻率最小，只有5.6%，說明各個(gè)菌株具有一定的遺傳相似性。

2.318個(gè)蜜環(huán)菌菌株種間酶譜聚類分析

2.3.1酯酶同工酶酶譜相似系數(shù)(Sc)

根據(jù)1.2.3的方法統(tǒng)計(jì)計(jì)算18株蜜環(huán)菌酯酶同工酶譜相似性系數(shù)，見表2。結(jié)果表明，18個(gè)蜜環(huán)菌菌株間遺傳相似性系數(shù)(Sc)為0～1.000之間，相似系數(shù)越小，說明兩菌株之間的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。其中，ZY-8、ZY-13、ZY-14與ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4，ZY-12、ZY-16、ZY-17、ZY-18與ZY-3、ZY-4的相似系數(shù)僅為0，說明它們的無親緣關(guān)系，并與其它菌株的相似性系數(shù)大多數(shù)分布在0.200～0.400之間，親緣關(guān)系很遠(yuǎn)。ZY-1和ZY-2，ZY-6、ZY-9和ZY-11，ZY-5和ZY-10，ZY-13和ZY-14，ZY-16、ZY-17和ZY-18的相似系數(shù)為1.000說明它們可能是源于同一種，甚至是親緣關(guān)系很近的變異類型。

2.3.2聚類分析

根據(jù)酯酶同工酶電泳結(jié)果，在凝膠的某個(gè)相同的遷移率位置上有條帶的記為1，無條帶的記為0，用NTSYS-pc軟件算出菌株間的遺傳相似系數(shù)，并應(yīng)用其平均連鎖聚類分析方法進(jìn)行聚類分析(圖3)。聚類分析樹狀圖表明，ZY-10和ZY-5，ZY-1和ZY-2，ZY-6、ZY-9和ZY-11，ZY-16、ZY-17和ZY-18，ZY-13和ZY-14相似性系數(shù)為1，說明其親緣關(guān)系極其相似；ZY-10、ZY-5和ZY-7的相似性系數(shù)較大，說明兩個(gè)菌株之間親緣關(guān)系比較近；ZY-16、ZY-17、ZY-18和ZY-7的相似性系數(shù)較大，說明兩個(gè)菌株之間親緣關(guān)系比較近；ZY-1、ZY-2和ZY-6、ZY-9、ZY-11的相似性較大，說明兩菌株之間親緣關(guān)系比較近。ZY-13、ZY-14、ZY-8和ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4的相似性系數(shù)為0，說明ZY-13、ZY-14、ZY-8和ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4的親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)。

表2　18株蜜環(huán)菌酯酶同工酶酶譜的相似系數(shù)

圖3　18株蜜環(huán)菌的酯酶同工酶聚類分析樹狀圖

3討論

同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，也是分子水平的表現(xiàn)型。因此，利用同工酶進(jìn)行遺傳分析具有一定的可靠性與可行性。在酯酶同工酶電泳試驗(yàn)中，由于菌株的酯酶同工酶和其形態(tài)特征一樣，都是菌株的基因型和環(huán)境效應(yīng)互相互作用的綜合表現(xiàn)的結(jié)果。因此，在應(yīng)用其進(jìn)行物種品種鑒別、種質(zhì)鑒定等有關(guān)研究工作中，只有選擇一致的培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基等條件，采用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的測試程序進(jìn)行分析，建立食用菌菌株酯酶同工酶的標(biāo)準(zhǔn)酶譜，才能保證酯酶同工酶的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

由于酯酶同工酶的表現(xiàn)型差異反映了基因型的差異，從而可以從菌株基因型的差異程度就能顯示出種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。Vaughan在1968年提出中間親緣關(guān)系可以用酶譜相似度進(jìn)行預(yù)料，不同菌株之間的相似性系數(shù)越大，表明物種間有著較小的酶譜差異，親緣關(guān)系越近[14]。此次試驗(yàn)的18株蜜環(huán)菌均是秦巴地區(qū)出現(xiàn)或是當(dāng)?shù)貜氖路N植的蜜環(huán)菌品種，從18個(gè)蜜環(huán)菌菌株酯酶同工酶的酶譜分析表明，每種菌都具有各自的特征性酶帶，有些菌株的酶譜存在較大的差異性，例如ZY-8、ZY-13、ZY-14和ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4；ZY-12、ZY-16、ZY-17、ZY-18和ZY-3、ZY-4的相似系數(shù)最低，說明它們之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而ZY-1和ZY-2，ZY-6、ZY-9和ZY-11，ZY-10和ZY-5，ZY-13和ZY-14，ZY-16、ZY-17和ZY-18酶譜存在很大的相似性，說明這些菌株間的親緣關(guān)系較近，且部分菌株可能源于同一種或?yàn)橛H緣關(guān)系很近的變異類型。

通過對蜜環(huán)菌菌株酯酶同工酶的研究并構(gòu)建聚類分析樹狀圖。ZY-13、ZY-14和ZY-8與其它菌株的親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)，可作為原生質(zhì)體制備、融合及再生的優(yōu)勢菌株，為篩選優(yōu)良的蜜環(huán)菌品種的遺傳育種奠定理論基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯：謝 平]

Study on esterase isozyme ofArmillariamelleain Qinba mountainous area

YANG Hai-xu1,DENG Bai-wan1,2,CHEN Wen-qiang1,2,YU Xiao-yan1,XIE Xiu-chao1,2

(1.School of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China；2.Shaanxi Engoneering Research Center of Edible and Medicated Fung, Hanzhong 723000, China)

Abstract:Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was adopted to study esterase isoenzyme in 18 different Armillaria mellea strains. Ioenzyme bands between 1～7 were identified from each strain.Similarity coefficient values for the 18 strains range from 0 to 1.000, with the similarity index between Jing234-1 and Jing234-2,M-8,A-9 and Shouxian,Jing234-5 and A-12,Dongbei-5 and Dongbei-4,Yunnan-1, Yunnan-2 and A13 being 1.000, indicating that these kinds are of close relative relationship. The similarity index between M-15, Dongbei-5 and Dongbei-4 and Jing234-1, Jing234-2, Jing234-3, Jing234-4；Chenggu, Yunnan-1, Yunnan-2 and A13 and Jing234-3, Jing234-4 being only 0.

Key words:Armillaria mellea；esterase isoenzyme；electrophoresis

[中圖分類號]Q949.329+.81

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

作者簡介：楊海旭(1987—),男，陜西省寶雞市人，陜西理工學(xué)院碩士研究生，主要研究方向?yàn)槲⑸镔Y源開發(fā)利用；[通信作者]鄧百萬(1963—)，男，陜西省眉縣人，陜西理工學(xué)院教授，主要研究方向?yàn)槲⑸镔Y源保護(hù)與開發(fā)利用；陳文強(qiáng)(1956—)，男，陜西省洋縣人，陜西理工學(xué)院教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)槲⑸镔Y源的保護(hù)與利用。

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳科技統(tǒng)籌創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2012HBGC-20)；陜西理工學(xué)院人才引進(jìn)啟動(dòng)項(xiàng)目(SLGKYQD2-19)

收稿日期：2015-10-08修回日期：2015-12-24

[文章編號]1673-2944(2016)02-0051-06