楊祎琦，　程　佳，　王永吉

(陜西理工學(xué)院 維生素D生理與應(yīng)用研究所， 陜西 漢中 723000)

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維生素D受體免疫組織熒光染色方法建立

楊祎琦，程佳，王永吉

(陜西理工學(xué)院 維生素D生理與應(yīng)用研究所， 陜西 漢中 723000)

[摘要]建立維生素D受體(Vitamin D Receptor，VDR)特異性免疫熒光染色方法，對(duì)人十二指腸組織中VDR進(jìn)行測(cè)定。采用石蠟包埋的方法對(duì)組織進(jìn)行永久性固定、并制作組織石蠟切片，利用蘇木精-伊紅(Hematoxylin & Eosin，H&E)方法鑒定組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，利用免疫熒光(Immunofluorescence，IF)染色方法對(duì)組織中VDR進(jìn)行免疫熒光染色，確定抗體使用最佳濃度范圍并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果表明：人十二指腸VDR在絨毛上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中高表達(dá)，一抗D-6的最佳稀釋比率為1∶100，二抗A594的最佳稀釋比率為1∶250，抗原最佳復(fù)性條件為0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸緩沖液中850 W功率微波煮沸20 min。按照此方法制作的石蠟切片組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，VDR染色特異性高，重復(fù)性好。

[關(guān)鍵詞]十二指腸；維生素D受體；免疫熒光染色

維生素D受體(Vitamin D Receptor，VDR)屬于核受體(類固醇激素/甲狀腺激素受體)超家族成員[1]，以核受體(Nuclear VDR，nVDR)和膜受體(Membranae VDR，mVDR)兩種形式存在，nVDR分子量大約50 kDa左右，mVDR分子量大約60 kDa左右[2]，在體內(nèi)主要介導(dǎo)維生素D的細(xì)胞作用，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷平衡、骨鹽沉積、細(xì)胞的增殖分化及免疫系統(tǒng)功能等[3]。國(guó)內(nèi)關(guān)于VDR的研究從1975年開(kāi)始，相關(guān)研究論文逐年增加，根據(jù)中國(guó)知網(wǎng)等網(wǎng)站的檢索數(shù)據(jù)，2014年達(dá)到峰值(1 309篇)。許多研究已證實(shí)VDR與乳腺癌、肺癌、糖尿病、高血壓、肥胖癥、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、骨質(zhì)疏松癥等多種癌癥及世界高危疾病之間關(guān)系密切。如VDR在乳腺癌細(xì)胞核中高表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達(dá)，并隨癌細(xì)胞分化程度的增加而增加[4]，但在乳腺上皮和肌上皮細(xì)胞為VDR陰性[5]；VDR在宮頸癌細(xì)胞核中隨癌癥臨床分期的增加呈表達(dá)上升的趨勢(shì)[6-7]；另外，維生素D可作用于腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin Angiotensin System，RAS)達(dá)到降血壓的功效，但其是否通過(guò)表達(dá)在分泌腎素的球旁器某種細(xì)胞中的VDR而起作用則不得而知[8]。

由于VDR在體內(nèi)的廣泛分布，目前明確VDR在不同組織的何種細(xì)胞表達(dá)，以及準(zhǔn)確識(shí)別組織或細(xì)胞中的VDR，對(duì)于研究維生素D介導(dǎo)的藥物治療方法至關(guān)重要。隨著生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，VDR的檢測(cè)研究使用了同位素標(biāo)記、放射自顯影及免疫組織化學(xué)等方法，特別是國(guó)外已建立了一種特異性和靈敏性的免疫組織熒光染色法，用于研究VDR的組織檢測(cè)。國(guó)內(nèi)有使用SABC(鏈霉素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物技術(shù))免疫組織化學(xué)技術(shù)測(cè)定組織細(xì)胞中VDR表達(dá)的報(bào)告，然而SABC的特異性和靈敏性等有待進(jìn)一步研究。

本研究參考國(guó)內(nèi)外對(duì)VDR檢測(cè)研究的結(jié)果，結(jié)合現(xiàn)有條件，建立一種特異性VDR免疫熒光染色技術(shù)，為后續(xù)研究VDR的功能及作用機(jī)制打好基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1組織

人的十二指腸組織切片，由陜西省西安交通大學(xué)附屬3201醫(yī)院提供。

1.1.2試劑

二甲苯(Fisher)，無(wú)水乙醇，濃鹽酸，蘇木精染液，伊紅染液，D-6抗體(Stanta Cruz)，Alex Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG(H+L)(Invitrogen)，檸檬酸(Sigma)，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)(北京鼎國(guó)昌盛生物有限公司)，Triton X-100(Sigma)，牛血清白蛋白(BSA)(Genview)，硫酸鋁鉀和碘酸鈉(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司)，冰醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，甘油(Sigma)，DAPI(Invitrogen)，陽(yáng)離子防脫玻片(北京鼎國(guó)昌盛生物有限公司)，其它未標(biāo)明試劑均為實(shí)驗(yàn)室研究級(jí)。

1.1.3儀器

倒置熒光顯微鏡(Nikon Ti-S)，微波爐(格蘭仕G80F23YSL-X1)，培養(yǎng)箱(LRH-70，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，石蠟切片機(jī)(萊卡旋轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)2265)，智能恒溫磁力攪拌器(ZNCL-S，河南愛(ài)傅特儀器發(fā)展有限公司)，純水機(jī)(細(xì)胞型1810B，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司)，分析天平(TB-214，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，冷藏冷凍箱(海爾BCD-215 KS)，pH計(jì)(STARTER 3C，上海奧豪斯儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1石蠟組織包埋

固定：組織用10%福爾馬林溶液固定24～48 h，PBS洗滌。

脫水：用梯度乙醇逐級(jí)脫水，如70%乙醇，2 h；80%乙醇，2 h；90%乙醇，2 h；95%乙醇，2 h；100%乙醇，1 h；100%乙醇，30 min。

透明：分別用100%乙醇/二甲苯(1∶1)處理30 min，二甲苯處理20 min，再用二甲苯處理10 min。

浸蠟：用蠟I、蠟II、蠟III在65 ℃各浸埋40 min。

包埋：在自動(dòng)包埋機(jī)上包埋。

1.2.2組織蠟塊切片

切片：將包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)則的長(zhǎng)方形，再貼附于小木塊上，然后將小木塊固定在切片機(jī)的蠟塊鉗內(nèi)，使蠟塊切面垂直于水平面。固定切片刀，轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)手輪，切出片片相連的蠟帶。用毛筆將蠟帶放在紙上。

貼片：將潔凈的陽(yáng)離子防脫載玻片滴上無(wú)離子水后，放在加熱板上加熱至45 ℃左右，再將一定數(shù)量的蠟片轉(zhuǎn)放于溫水中，蠟片展開(kāi)鋪平后，用濾紙吸除多余水分，蠟片即貼在玻片上。

烤片：將載玻片放入37 ℃溫箱中干燥24 h后，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3H&E染色

脫蠟：石蠟切片需用二甲苯脫蠟(2次，各10 min)，再用無(wú)水乙醇洗去二甲苯(2次，各5 min)。

復(fù)水：脫蠟后的樣本用不同的乙醇溶液浸泡復(fù)水，如100%乙醇、75%乙醇、50%乙醇，每個(gè)溶液浸泡2次，各5 min，然后浸泡于蒸餾水中(2次，各5 min)。

染色：在蘇木精液中染色30 min(細(xì)胞核染色)，洗去蘇木精液(流水1 min，1%鹽酸乙醇5 s，再水洗10 s)，進(jìn)行胞質(zhì)脫色(70%乙醇，2 min；80%乙醇，2 min；90%乙醇，2 min)，隨后進(jìn)行伊紅液染色(6 min)，染色后進(jìn)行脫水(95%乙醇、100%乙醇、二甲苯，每個(gè)溶液浸泡2次，每次5 min)，脫水后蓋上蓋玻片，用中性樹(shù)膠封固，在顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4IF染色

脫蠟：用二甲苯脫蠟4次，每次8 min。

復(fù)水：在100%、90%、70%、50%、20%乙醇溶液中浸泡，每次5 min；然后水洗2次，每次5 min；再用1%Triton X-100浸洗30 min。

抗原復(fù)性：樣本在900 mL 0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中微波(850 W微波爐)煮沸20 min，然后冷卻大于3 h。

封閉非特異性抗原：PBS+Tween 20溶液(PBS-T)洗滌2次，各5 min；用3% BSA-PBS溶液室溫溫育封閉20 min。

一抗孵育：VDR抗體D-6(1∶250稀釋)溶液，在37 ℃下溫育2 h；PBS-T洗4次，各5 min。

二抗孵育：二抗A549抗體(1∶500稀釋)溶液，在37 ℃下溫育1 h；PBS-T洗4次，各5 min；50%甘油封片，倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1H&E染色結(jié)果

由于細(xì)胞核為嗜堿性物質(zhì)，可被蘇木精染成藍(lán)色，胞漿主要為嗜酸性物質(zhì)，可被伊紅染成不同程度的紅色，從而與細(xì)胞核區(qū)分開(kāi)來(lái)，因此可對(duì)該組織切片進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

從圖1中可以看出，十二指腸微絨毛由數(shù)量較多的柱狀細(xì)胞和少量杯狀細(xì)胞組成，并且形態(tài)完整。絨毛上皮游離面是紋狀緣。絨毛內(nèi)中軸為結(jié)締組織固有層，絨毛根部的上皮向固有層內(nèi)凹陷，形成密集、管狀的小腸腺。十二指腸由小腸腺向外依次是結(jié)締組織和粘膜平滑肌。

圖1　人十二指腸組織H&E染色

2.2IF染色結(jié)果

VDR作為抗原，可與特異性強(qiáng)、靈敏度高的第一抗體(D-6)結(jié)合；第一抗體與VDR形成復(fù)合物作為另一抗原，可特異地與帶熒光物質(zhì)標(biāo)記的第二抗體(A594)結(jié)合，從而精確地對(duì)VDR進(jìn)行組織亞細(xì)胞定位。

圖2的結(jié)果顯示，未加VDR抗體D-6，僅用二抗進(jìn)行人十二指腸組織熒光染色，無(wú)特異的二抗染色，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所選用的二抗與人十二指腸組織無(wú)或僅有很弱的相互作用。而細(xì)胞核染色特異清晰。

(a) 組織本底吸收色　　　　(b) 細(xì)胞核DAPI染色　　　　(c) VDR與DAPI疊加圖2　人十二指腸維生素D受體陰性對(duì)照免疫熒光染色

與圖2比較，圖3的結(jié)果顯示，用VDR抗體D-6進(jìn)行人十二指腸組織熒光染色，一抗給出非常特異的VDR染色，而且VDR染色主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。分析發(fā)現(xiàn)，人的十二指腸VDR均勻分布在絨毛上皮細(xì)胞中，是僅有的VDR樣性細(xì)胞。杯狀細(xì)胞、結(jié)締組織和平滑肌組織等均未見(jiàn)特異的VDR染色。

(a) VDR染色　　　　　　(b)細(xì)胞核DAPI染色　　　　(c) VDR與DAPI疊加圖3　人十二指腸維生素D受體免疫熒光染色

3討論

H.F.Deluca等[10]于1975年在雞的胚腸黏膜中發(fā)現(xiàn)有VDR的存在后，人們用了不同的方法來(lái)定位組織或細(xì)胞中的VDR，歷史上先后使用了如同位素標(biāo)記、原位雜交和免疫組化等方法，現(xiàn)在已確定在小腸柱狀細(xì)胞中存在VDR，并有重要的調(diào)節(jié)鈣磷吸收的功能，但小腸的其他組織有無(wú)VDR仍有爭(zhēng)論[11]。

近來(lái)，一種特異而靈敏的VDR免疫熒光染色方法被用來(lái)分析VDR在多種組織細(xì)胞中的存在和相對(duì)表達(dá)量[12]。該染色方法重復(fù)性好，適于石蠟包埋的組織切片，其核心是使用VDR D-6抗體[13]。本研究在現(xiàn)有的設(shè)備、試劑及實(shí)驗(yàn)條件下，使用D-6抗體建立了VDR免疫熒光染色方法，成功地分析了VDR在正常人體的十二指腸組織中的表達(dá)，絨毛上皮細(xì)胞是僅有的VDR樣細(xì)胞。杯狀細(xì)胞、結(jié)締組織和平滑肌組織等均未見(jiàn)特異的VDR染色。這與以前在小鼠中的研究結(jié)果一致[13]。

在國(guó)內(nèi)，對(duì)組織細(xì)胞中VDR表達(dá)的測(cè)定通常使用ELISA[14]、Western blot、RT-PCR[15]和免疫組織化學(xué)法[16]，其中免疫組織化學(xué)法多以鏈霉素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(SABC)為主。在SABC法中，二抗采用的是生物素標(biāo)記，底物為DAB顯色，細(xì)胞核采用蘇木精染色。王少華等[9]報(bào)告了直腸癌及癌旁黏膜組織中VDR表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果，與之相比，本研究使用了特異性核靈敏度的免疫組織染色法，而且二抗用熒光標(biāo)記技術(shù)，更有利于VDR細(xì)胞內(nèi)的定位研究。

本研究經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，對(duì)人十二指腸組織的VDR和細(xì)胞核進(jìn)行染色，確定出了VDR染色的最佳抗體濃度，組織脫落最佳烘烤溫度和時(shí)間。在染色過(guò)程中，在抗原復(fù)性步驟常會(huì)因組織貼附不牢固而出現(xiàn)組織脫落現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行脫蠟步驟之前將切片于72 ℃烘烤2 h后立即實(shí)驗(yàn)，組織脫落效果明顯降低，且脫蠟效果較好。VDR染色中，一抗D-6濃度為1∶100，二抗A594濃度為1∶250，如進(jìn)行細(xì)胞核染色，則在稀釋的二抗中加入0.1%的DAPI，效果最佳。在二抗孵育之前，需要對(duì)其進(jìn)行12 000 r/min離心2 min，以去除非特異性抗體熒光。該方法的建立為研究VDR的科學(xué)工作者提供技術(shù)參考。

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[責(zé)任編輯：魏 強(qiáng)]

Method establishment of vitamin D receptor immunohistochemical staining

YANG Yi-qi,CHENG Jia,WANG Yong-ji

(Vitamin D Research Institute, Shaanxi University of Technology,Hanzhong 72300, China)

Abstract:A highly specific and sensitive vitamin D receptor (VDR) immunohistochemical staining was established and was successfully applied to determine VDR cellular expression in human duodenal tissue using paraffin-embedded tissue sections. The H&E staining was used to identify the integrity of the tissue structure while the immunofluorescence(IF) was used for the in situ determination of VDR in the tissue. The experimental conditions were optimized as the following: the dilution for the primary VDR antibody(D-6) was 1∶100, the dilution for the second antibody(A594) was 1∶250, the antigen retrieval procedure included: boiling the tissue sections in 0.01 mol/L pH 6.0 citrate buffer with 850 W microwave for 20 min and cooling down at the room temperature for 3 h. Using this IF method, VDR was selectively found in human duodenal epithelial cells, indicating high specificity and sensitivity of the method.

Key words:duodenum;vitamin D receptor;immunofluorescence staining

[中圖分類號(hào)]Q291

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

作者簡(jiǎn)介：楊祎琦(1990—)，女，陜西省西安市人，陜西理工學(xué)院碩士研究生，主要研究方向?yàn)榫S生素D受體在大鼠原代脂肪細(xì)胞中的作用；[通信作者]程佳(1983—)，女，內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市人，陜西理工學(xué)院講師，碩士生導(dǎo)師，博士，主要研究方向?yàn)榫S生素D受體與脂肪細(xì)胞分化研究；王永吉(1965—)，男，陜西省漢中市人，陜西理工學(xué)院教授，碩士生導(dǎo)師，博士，主要研究方向?yàn)榫S生素D生理學(xué)。

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2012KCT-29)；漢中市科技局項(xiàng)目(2014ZKC47-07)；陜西理工學(xué)院研究生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(SLGYCX1522)

收稿日期：2015-07-22修回日期：2015-12-07

[文章編號(hào)]1673-2944(2016)02-0045-06