黃　通，溫　琪，王長義，彭曉琳，張春惠，劉盛元，李克深

(1.深圳市南山區(qū)慢性病防治院，廣東 深圳　518054；2.廣東省衰老相關疾病重點實驗室，廣東 湛江　524001)

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臨床醫(yī)學研究

RAGE基因多態(tài)性與阿爾茨海默病在中國漢族人群中的相關性研究

黃通1，溫琪1，王長義1，彭曉琳1，張春惠1，劉盛元1，李克深2

(1.深圳市南山區(qū)慢性病防治院，廣東 深圳518054；2.廣東省衰老相關疾病重點實驗室，廣東 湛江524001)

[摘要]目的 探討在中國漢族人群中晚期糖基化終末產(chǎn)物受體基因多態(tài)性與阿爾茨海默病發(fā)生的關系。方法 采用病例-對照設計，確定70例AD患者和67例對照進行研究，對受試者外周靜脈血提取全血DNA，通過PSTAR-II plus(IDN01-M-P2)高通量測序的方法檢測兩組樣本RAGE基因多態(tài)性，比較其基因型的分布情況。結果 rs1800624位點的多態(tài)性差異具有統(tǒng)計學意義，AD組AA基因型頻率(50%)和A等位基因頻率(61.43%)分別明顯高于對照組的(1.49%)和(13.43%)，AA基因型患AD的風險是AT基因型的34.994倍(OR=34.994，95%CI：4.264～287.179)；AA和AT基因型患AD的風險分別是TT基因型的92.089倍(OR=92.089，95%CI：11.777～720.070)和2.632倍(OR=2.632，95%CI：1.101～6.290)；有A等位基因能夠明顯增加AD的發(fā)病風險(OR=7.895，95%CI：3.686～16.911)；rs1800625位點的多態(tài)性差異無統(tǒng)計學意義。結論 在中國漢族人群中，rs1800624位點與AD的發(fā)生相關，A等位基因可能是AD發(fā)生的危險因素。

[關鍵詞]阿爾茨海默病；晚期糖基化終末產(chǎn)物受體；單核甘酸多態(tài)性

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以進行性認知功能障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為漸進性記憶障礙和認知功能障礙，并伴有各種神經(jīng)精神癥狀和行為能力減退，是癡呆最常見的類型[1]。2010年全球約有AD患者3500萬，到2050年將達到1.15億[2]。AD發(fā)病率高、患病率高、致殘率高的特點是其成為全球關注的公共衛(wèi)生問題[3]。探討AD發(fā)病機理和影響因素，對早期發(fā)現(xiàn)易患人群給予重點防治，提高老年人生活質量，減輕社會負擔具有重要意義。

晚期糖基化終末產(chǎn)物(Receptor for advanced glycation end products，RAGE)受體屬于免疫球蛋白家族。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，RAGE主要在神經(jīng)元、小膠質細胞以及血管內(nèi)皮細胞上表達，同時RAGE可以與多種與AD有關的分子(β-淀粉樣蛋白、晚期糖基化終末產(chǎn)物和S100/鈣粒蛋白)結合[4-5]，說明RAGE在AD的病理發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用，但是目前沒有研究報道從分子流行病學角度闡述RAGE基因rs1800624和rs1800625位點多態(tài)性與AD的關系，因此本文探討了其與AD的關聯(lián)性，為臨床診斷和治療AD提供理論依據(jù)。

1對象與方法

1.1研究對象納入與排除標準AD患者均經(jīng)過標準檢查，包括詳細的病史采集、全面體格檢查以及神經(jīng)系統(tǒng)檢查、實驗室篩查實驗、認知功能評估、頭部核磁共振成像或CT檢查，從深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院和石巖敬老院選取符合精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊(DSM-IV)和美國國立神經(jīng)病、語言交流障礙和卒中研究所—老年性癡呆及相關疾病學會(NINCDS-ADRDA)標準[6]的單純AD病例。

排除標準：有血管性和“混合”老年癡呆癥、神經(jīng)性疾病、癌癥、糖尿病、高血壓和心腦血管疾病的對象均被排除在外。同時，在深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院和石巖敬老院中選取臨床、心理和神經(jīng)學評估均正常的人作為對照組，以上所有研究對象均為漢族。該項研究已得到倫理委員會批準，研究人員對每個入選對象都要進行詳細的研究說明并由入選對象簽署一份書面的知情同意書。

1.2實驗研究方法

1.2.1基因組DNA的提取將200 μL EDTA-K2抗凝全血于3 000 rpm離心20 min，棄去血漿，按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)試劑盒使用說明書提取基因組DNA，取5 μL提取產(chǎn)物進行0.7%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL溴化乙錠)電泳鑒定，以DNA Marker DL2000作為DNA分子量標準，在紫外燈下觀察產(chǎn)物電泳結果，其余置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2基因型的檢測RAGE基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點選擇標準：①公開發(fā)表文獻和數(shù)據(jù)庫中的SNPs位點；②在流行病學研究中報道過的與疾病相關的SNPs位點；③SNPs位點的次要等位基因頻率>0.1。根據(jù)以上標準，本文選擇了位于RAGE基因啟動子區(qū)域的rs1800624和rs1800625兩個SNP位點進行研究。應用Primer premier 5引物設計軟件在多態(tài)性位點附近100bp左右區(qū)域設計引物，將其序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，確定引物特異性，最后引物序列由深圳華因康公司合成。

PCR擴增反應體系：2 X Taq Unicorn Premix 10 μL，引物P1、P2各0.3 μL(10 μmol/L)，基因組DNA模板1 μL(25 ng/μL)，ddH2O 8.4 μL，共20 μL體系。PCR反應條件如下：94 ℃變性4 min，1個循環(huán)；94 ℃變性20 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，20個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸3 min，最后置于4 ℃終止反應。擴增完畢后，為了獲取大量目的片段取1 μL PCR擴增產(chǎn)物，稀釋10倍后作為反應模板，再行另一次PCR擴增，除模板PCR擴增反應體系同上。以上2次PCR產(chǎn)物取5μL加入上樣緩沖液1 μL，180 V電壓12%PAGE凝膠電泳20 min，紫外成像儀檢測電泳結果并拍照。對擴增的片段中的單核苷酸多態(tài)性采用PSTAR-II plus(IDN01-M-P2)高通量測序的方法檢測。

2結果

2.1一般情況AD組共有70例，其中男性42(60%)例，女性28(40%)例，年齡為75.5(68，78)歲；對照組共有67例，其中男性32(47.76%)例，女性35(52.24%)例，年齡為72(68，76)歲，年齡和性別構成在兩組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性(見表1)。

表1AD組和對照組的年齡和性別情況

組別例數(shù)年齡(歲)性別(男/女)AD組7075.5(68,78)42/28健康對照組6772.0(68,76)32/35P0.17150.1508

2.2rs1800624和rs1800625位點的HWE檢驗和連鎖不平衡分析rs1800624和rs1800625位點的HWE檢驗結果顯示，兩位點在對照組中的基因型頻率均符合HWE，只有rs1800624位點在AD組中的基因型頻率不符合HWE，表明AD組可能發(fā)生了明顯的rs1800624位點突變(見表2)。

兩位點的連鎖不平衡分析結果為χ2=3.579 0，P=0.058 5，表明兩位點之間不存在連鎖不平衡關系，彼此相對獨立。

表2rs1800624和rs1800625位點的HWE檢驗結果

分組SNPIDChi-SquareDFPAD組rs180062418.75781<0.0001rs18006252.234510.1350對照組rs18006240.048210.8262rs18006250.038910.8437

2.3rs1800624和rs1800625位點的基因型和等位基因分布情況AD組與對照組rs1800624和rs1800625位點基因型和等位基因頻率分析結果顯示：rs1800624位點的多態(tài)性差異具有統(tǒng)計學意義，AD組AA基因型頻率(50%)和A等位基因頻率(61.43%)分別明顯高于對照組的(1.49%)和(13.43%)，與AD的發(fā)生相關；rs1800625位點的多態(tài)性差異無統(tǒng)計學意義，與AD的發(fā)生不存在相關性(見表3)。

表3rs1800624和rs1800625的基因型和等位基因分布情況

SNPID基因型/等位基因AD組對照組n(%)n(%)Chi-SquarePrs1800624AA35(50.00)1(1.49)44.53<0.0001AT16(22.86)16(23.88)TT19(27.14)50(74.63)A86(61.43)18(13.43)66.97<0.0001T54(38.57)116(86.57)rs1800625CC2(2.86)1(1.49)0.580.7482CT11(15.71)13(19.40)TT57(81.43)53(79.10)等位基因C15(10.71)15(11.19)0.020.8988T125(89.29)119(88.81)

2.4多因素logistic回歸分析以是否患AD為因變量，年齡、性別和rs1800624和rs1800625的位點多態(tài)性(設置啞變量)為自變量進行l(wèi)ogistic回歸，變量選入和剔除水平均為0.05，結果顯示最后納入方程的因素只有rs1800624位點多態(tài)性，rs1800624位點AA基因型患AD的風險是AT基因型的34.994倍(OR=34.994，95%CI：4.264～287.179)；AA和AT基因型患AD的風險分別是TT基因型的92.089倍(OR=92.089，95%CI：11.777～720.070)和2.632倍(OR=2.632，95%CI：1.101～6.290)；A等位基因能夠明顯增加AD的發(fā)病風險(OR=7.895，95%CI：3.686～16.911)。

3討論

隨著全球人口老齡化，AD發(fā)病率和患病率呈逐年顯著上升趨勢，但其確切發(fā)病機制目前還尚未闡明，臨床上亦無特效治療方法，尋找特異敏感的生物學標志，運用多種手段防治AD，具有深遠的意義[7]。一般認為AD是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結果，而遺傳因素在AD的發(fā)病中起重要作用[8]。Alberti KG等人研究表明載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是AD的主要遺傳風險因子[9]，但值得注意的是有50%散發(fā)AD患者并不攜帶ApoE，提示還存在其它遺傳危險因子。

β-淀粉樣蛋白形成淀粉樣斑塊和微管相關蛋白tau基因高度磷酸化后形成螺旋纖維絲是AD的主要病理學特征[10-11]。RAGE作為普遍存在于神經(jīng)系統(tǒng)的膜受體，可以介導β-淀粉樣蛋白透過血腦屏障，活化小膠質細胞，導致產(chǎn)生氧化應激、促進炎癥病理反應并進一步反饋上調(diào)自身表達，所造成的神經(jīng)損傷與AD發(fā)病直接相關[12]，可見，RAGE與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關，但是目前從分子流行病學角度闡述RAGE基因與AD關系的研究較少。

人類RAGE基因位于6號染色體6p21.3，含有11個外顯子和1個長約1.7kb的5′側域，位于主要組織相容性復合物Ⅱ型分子與Ⅲ型分子的基因之間。Li K等人研究發(fā)現(xiàn)在中國漢族人群中RAGE基因rs2070600(G82S)位點多態(tài)性與AD的易感性有關，S等位基因可能是AD發(fā)生的危險因素，且在正常人群中，中國漢族人群的S等位基因頻率高于高加索人、韓國人和日本人，表現(xiàn)出明顯的種族差異[13]。Daborg J等人研究的結果顯示在歐洲人群中RAGE基因rs2070600位點突變的S等位基因會增加AD的易感性[14]。Hudson BI等人研究發(fā)現(xiàn)位于RAGE基因啟動子可調(diào)節(jié)區(qū)域中的rs1800624(-374T/A)和rs1800625(-429T/C)位點能顯著增強RAGE基因的轉錄活性，且與2型糖尿病及其并發(fā)癥相關聯(lián)[15]。但是目前沒有rs1800624和rs1800625位點多態(tài)性與AD發(fā)生關系的研究報道，故本研究探討了其與AD發(fā)生的關聯(lián)性。

本研究結果顯示在中國漢族人群中，rs1800624位點在AD組中的基因型頻率不符合HWE，突變的A等位基因型頻率(61.43%)高于野生的T等位基因型頻率，Salanti G等人研究認為病例組基因型頻率因為功能上受到選擇壓力(疾病也算是一種選擇壓力)可能不符合HWE[16]；RAGE基因rs1800624位點多態(tài)性與AD的發(fā)生有密切的關聯(lián)，A等位基因可能是AD發(fā)生的危險因素，這可能有助于評估個體的易感性，探索疾病預防控制的有效措施。

由于本研究只有137名研究對象，不能排除存在對結果的過高估計或者未能檢測出較弱的相關性現(xiàn)象(如rs1800625位點的多態(tài)性是否與AD的發(fā)生相關)，在后續(xù)的研究中，需要進行大樣本、多地區(qū)和多民族的研究，同時應納入更多的有功能意義的多態(tài)性位點，開展更為全面深入地探討。

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[收稿2016-03-02;修回2016-03-28]

(編輯：王福軍)

Correlation study between gene polymorphism of RAGE and Alzheimer's disease in a Chinese Han population

HuangTong1,WenQi1,WangChangyi1,PengXiaolin1,ZhangChunhui1,LiuShengyuan1,LiKeshen2

(1.Nanshan Center for Chronic Disease Control of Shenzhen, Shenzhen Guangdong 518054, China;2.Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac and Cerebral Diseases,Zhanjiang Guangdong 524001,China)

[Abstract]Objective To examine the relationship between the receptor for advanced glycation end-products (RAGE) gene polymorphism and Alzheimer's disease in a Chinese Han population.Methods This is a case-control study. A total of 70 patients with Alzheimer's disease and 67 control subjects were included in this study. DNA was extracted directly from peripheral venous blood samples. PSTAR-II plus (IDN01-M-P2) detection technologies were used to identify single nucleotide polymorphism (SNP) distribution of RAGE gene loci. Genotype and allele frequency differences were analyzed and compared between the two groups.Results There was a significant difference in genotype frequency distribution of the rs1800624 loci. The patients with Alzheimer's disease had an obviously higher frequency of AA genotype (50%) and A allele (61.43%) than control subjects (1.49% and 13.43%). Alzheimer’s disease risk in rs1800624 AA genotype carriers was 34.994 times (OR=34.994, 95%CI:4.264～287.179) more than that in AT genotype carriers and AA/AT genotype carriers was 92.089 times (OR=92.089, 95%CI:11.777～720.070) and 2.632 times (OR=2.632, 95%CI:1.101～6.290) more than that in TT genotype carriers, respectively. A allele significantly increased the risk of Alzheimer's disease (OR=7.895，95%CI：3.686～16.911). However, no significant difference was found in genotype frequency distribution of the rs1800625.Conclusion RAGE gene in rs1800624 shows a strong relationship with Alzheimer’s disease. A allele could be a risk factor for Alzheimer's disease in Chinese Han population.

[Key words]Alzhemer's disease; receptor for advanced glycation end products; single nucleotide polymorphism

[中圖法分類號]R592

[文獻標志碼]A

[文章編號]1000-2715(2016)02-0158-04

[通信作者]劉盛元，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：慢性非傳染性疾病預防與控制，E-mail:liushenglb@126.com。

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(NO：81302482)；廣東省自然科學基金資助項目(NO：2015A030313767)；廣東省醫(yī)學科研基金資助項目(NO：A2015387)。