李雪榕，何　勇，雷雨佳，覃西河，韋慶濤，潘新民，李立娟，張　林（.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都6004；.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng)47003）

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PTEN在冠心病心肌組織中的表達(dá)

李雪榕1，何勇1，雷雨佳1，覃西河1，韋慶濤1，潘新民2，李立娟1，張林1
（1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都610041；2.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003）

摘要：目的觀察冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┗颊咝募〗M織中人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）的表達(dá)，探討PTEN的表達(dá)與冠心病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。方法選取經(jīng)病理學(xué)確診為冠心病死亡案例16例作為冠心病組，非心肌病變死亡案例19例作為對(duì)照組，采用免疫組織化學(xué)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)心肌組織中PTEN蛋白及其mRNA的表達(dá)。結(jié)果冠心病組PTEN蛋白的表達(dá)量低于對(duì)照組（P<0.05）；與對(duì)照組相比，冠心病組PTEN mRNA表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論P(yáng)TEN可能與冠心病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)病理學(xué)；冠狀動(dòng)脈硬化；心??；人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源基因

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┲敢?yàn)楣跔顒?dòng)脈狹窄造成心肌供血供氧不足而導(dǎo)致的機(jī)能障礙和（或）器質(zhì)性病變，是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類健康重要的心血管疾病之一。冠心病常起病隱匿，表現(xiàn)為心絞痛或非典型癥狀，且易導(dǎo)致猝死。在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，因冠心病猝死的案例占心源性猝死案例的50%以上［1］。盡管目前關(guān)于冠心病的研究是一個(gè)熱點(diǎn)，然而關(guān)于冠心病發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制至今尚未完全明了。

人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一同時(shí)具有蛋白質(zhì)磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶活性的抑癌基因［2］，位于第10號(hào)染色體的10q23上，包括8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子，總長(zhǎng)200 kb，mRNA長(zhǎng)5 500 bp，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡調(diào)控有關(guān)［3］，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。近幾年關(guān)于PTEN的研究，逐漸由癌癥抑制領(lǐng)域轉(zhuǎn)向缺血預(yù)適應(yīng)、心肌肥大、心肌肥厚等非腫瘤領(lǐng)域。本研究采用免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法觀察冠心病心肌組織中PTEN蛋白及其mRNA的表達(dá)情況，以探討PTEN和（或）其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在冠心病發(fā)生發(fā)展中的作用，為冠心病猝死診斷提供新的靶點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1材料

選取2010—2012年在某法醫(yī)學(xué)鑒定中心經(jīng)尸體解剖確診為冠心病死亡的案例16例作為冠心病組，取左心室壁組織；非心肌病變死亡案例19例作為對(duì)照組，取左心室壁相同位置心肌組織。心肌組織均制作組織切片，備用。

冠心病組男性13例，女性3例，年齡最小34歲，最大75歲，平均年齡54歲；對(duì)照組均為男性，年齡最小11歲，最大58歲，平均年齡37歲。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器

PTEN多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），圖像采集使用Olympus BX51顯微圖像采集系統(tǒng)（英國(guó)Olympus Optical公司），圖像分析使用Image ProPlus 6.0軟件（美國(guó)Media Cybernetics公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Eppendorf公司），High Pure FFPET試劑盒（瑞士Roche公司），DU730紫外分光光度計(jì)（美國(guó)BECKMAN COULTER公司）。

1.2.2免疫組織化學(xué)方法

將心肌組織切片脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫封閉，95℃高壓蒸汽修復(fù)抗原，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，滴加一抗（PTEN多克隆抗體）、生物素標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，最后中性樹膠封固。PTEN蛋白呈現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性。每一張切片在顯微鏡放大400倍下，隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)定光密度，計(jì)算平均光密度值進(jìn)行半定量分析。

1.2.3RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄

樣品總RNA的提取采用High Pure FFPET試劑盒，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用紫外分光光度計(jì)，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm、280 nm的光密度（D），取D260/D280測(cè)定RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，樣品分裝保存于－80℃。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定心肌組織PTEN和內(nèi)參18S mRNA的表達(dá)。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中PTEN 和18S的基因序列，采用Primer 3設(shè)計(jì)引物。PTEN 的F：5′－ACCGCCAAATTTAATTGCAG－3′，R：5′－TAG GGCCTCTTGTGCCTTTA－3′；18S的F：5′－GCAATTAT TCCCCATGAACG－3′，R：5′－GGCCTCACTAAACCATC CAA－3′。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)采用SYBR Green法，反應(yīng)體系為10μL，含mix 5μL、上下游引物各1μL、cDNA 1μL和去RNA酶水2μL。實(shí)驗(yàn)采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，PTEN和內(nèi)參18S基因標(biāo)準(zhǔn)品10倍等比稀釋后實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為x，相應(yīng)的Ct值為y，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。反應(yīng)條件：95℃5min；95℃10 s，60℃30s，循環(huán)60次；95℃15s，60℃1min，95℃15s， 60℃15s；收集熒光信號(hào)進(jìn)行溶解曲線分析。以PTEN 與18S的比值作為每個(gè)樣本PTEN的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)　果

2.1心肌組織中PTEN蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組相比，冠心病組心肌細(xì)胞胞質(zhì)呈深淺不一的棕黃色（圖1A），而對(duì)照組多數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)PTEN表達(dá)陽(yáng)性，且少數(shù)細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性（圖1B）。對(duì)PTEN陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行光密度值測(cè)定，結(jié)果見表1～2。對(duì)照組PTEN蛋白平均光密度值為0.103±0.055，冠心病組為0.039±0.026，兩組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1　冠心病組和對(duì)照組心肌PTEN蛋白表達(dá)情況對(duì)比SP×400

表1　冠心病組PTEN陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值結(jié)果（n=5）

2.2心肌組織中PTEN mRNA的表達(dá)

從標(biāo)準(zhǔn)曲線（yPTEN=－3.422 x+1.24，y18S=－3.191 x+ 1.06）看，PTEN和18S的斜率分別為3.42和3.20，擴(kuò)增效率均在90%～110%。兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R2分別為0.99和0.98，說(shuō)明所得直線擬合優(yōu)度好。冠心病組PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.002 5±0.003 2，對(duì)照組為0.002 4±0.003 5，兩組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3　討　論

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）是最常見的猝死。1996年，Kuller報(bào)道猝死病因中冠心病占61%［4］。僅在2006年美國(guó)SCD案例就達(dá)到450000例［5］。SCD的發(fā)生具有自發(fā)性、突然性和不可預(yù)測(cè)性［6］。死亡多發(fā)生在發(fā)病后1～2h內(nèi)，常規(guī)病理學(xué)檢驗(yàn)多只見心肌肥大、嗜酸性變等改變［4］，缺乏典型的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，加之死后組織腐敗、自溶等的影響，都給冠心病猝死的診斷和鑒定增加了難度［3］，使冠心病猝死的診斷成為法醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前，關(guān)于冠心病猝死的輔助性診斷指標(biāo)研究主要集中在心肌蛋白，如肌鈣蛋白［7］、肌動(dòng)蛋白［8］、肌紅蛋白［9］、纖維粘連蛋白［8，10－11］、內(nèi)皮素［12］、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子［13－15］、熱休克蛋白70［1］等。

PTEN不僅在胚胎的發(fā)育，細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和遷移等方面的調(diào)控中發(fā)揮重要作用［16－17］，而且在心肌細(xì)胞MAPK/PKC信號(hào)通路、PI3K/AKT去磷酸化、缺血預(yù)適應(yīng)、心肌缺血/再灌注損傷、心肌肥大、心肌肥厚等病理生理過(guò)程方面發(fā)揮著一定的作用［18－19］。在冠心病的狀態(tài)下，由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，局部心肌組織發(fā)生供血障礙，從而引起心肌細(xì)胞對(duì)于缺血缺氧這一刺激的反應(yīng)和適應(yīng)。PTEN作用于心臟的方式不同于其對(duì)癌癥細(xì)胞的抑制作用，其表達(dá)量會(huì)發(fā)生一定的改變［20］，從而使心臟對(duì)所處的這種缺血缺氧狀態(tài)進(jìn)行適應(yīng)性反應(yīng)。

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)方法測(cè)定PTEN蛋白在冠心病患者心肌組織中的表達(dá)情況，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)冠心病患者心肌組織中PTEN mRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白的表達(dá)在正常心肌細(xì)胞中較冠心病心肌細(xì)胞高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在冠心病發(fā)生時(shí)，PTEN的轉(zhuǎn)錄量減小，從而使PTEN蛋白的總作用量同比減小，使其作用于心肌細(xì)胞所產(chǎn)生的效應(yīng)亦隨之減小。但PTEN mRNA在正常心肌細(xì)胞和冠心病心肌細(xì)胞中的表達(dá)量并未發(fā)現(xiàn)明顯差異。此研究結(jié)果與楊大春等［3］報(bào)道的PTEN在心肌重構(gòu)病理過(guò)程中起負(fù)性調(diào)節(jié)的生物學(xué)作用的結(jié)論相一致。本研究結(jié)果表明，PTEN蛋白的表達(dá)差異可能不是由于其轉(zhuǎn)錄水平的量變，而是由于轉(zhuǎn)錄后的修飾作用，提示PTEN可能參與冠心病的發(fā)生與發(fā)展［21］。

本研究旨在通過(guò)檢測(cè)冠心病心肌組織中PTEN蛋白及mRNA的表達(dá)量，分析PTEN與冠心病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為后續(xù)PTEN相關(guān)信號(hào)通路在冠心病發(fā)生和發(fā)展中的作用以及冠心病的防治等相關(guān)研究提供新的靶點(diǎn)。

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（本文編輯：張建華）

Expression of PTEN in Myocardial Tissue in Coronary Heart Disease

LI Xue－rong1，HE Yong1，LEIYu－jia1，QIN Xi－h(huán)e1，WEIQing－tao1，PAN Xin－min2，LILi－juan1，ZHANG Lin1
（1.West China School of Preclinical and Forensic Medicine，Sichuan University，Chengdu 610041，China；2.School of Forensic Medicine，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

Abstract：Objective To observe the expression of phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten（PTEN）in myocardial tissue in patients w ith coronary heart disease，and explore the relevance between the expression of PTEN and the occurrence and development of coronary heart disease.M ethods A total of 16 death cases w ith pathological diagnosis of coronary heart disease were collected as experimental group，and 19 cases w ithoutmyocardial lesions were selected as control group.The expression of PTEN protein and its mRNA were detected by immunohistochemistry and real－time fluorescence quantitative PCR respectively.The correlation between the expression of PTEN and the pathogenesis of coronary heart disease was analyzed.Results The expression of PTEN protein in myocardium in cases w ith coronary heart disease was significantly lower compared w ith the control group（P<0.05）.There was no statistical difference of the expression of PTEN mRNA between experimental and control group（P>0.05）. Conclusion PTEN may be involved in the occurrence and development of coronary heart disease.

Key words：forensic pathology；coronary arteriosclerosis；myocardium；phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten

收稿日期：（2014－11－04）

通信作者：張林，男，教授，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究；E－mail：zhanglin＠scu.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：李雪榕（1991—），女，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E－mail：spiderbox＠hotmail.com

文章編號(hào)：1004－5619（2016）02－0094－03

中圖分類號(hào)：DF795.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004－5619.2016.02.004