宋曉朋，王宇娟，武炳瑾，馬文潔，張德強，周麗敏，孫道杰

(1.西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100；2.楊凌區(qū)種子站，陜西楊凌 712100)

?

黃淮麥區(qū)部分小麥和國外引進小麥GS2等位基因的檢測及其與農藝性狀的關聯(lián)分析

宋曉朋1，王宇娟2，武炳瑾1，馬文潔1，張德強1，周麗敏1，孫道杰1

(1.西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100；2.楊凌區(qū)種子站，陜西楊凌 712100)

摘要：為明確黃淮麥區(qū) TaGS2等位基因的分布狀況及其與主要農藝性狀的關系，對黃淮麥區(qū)2008年之前育成的種質材料、新育成的品種(系)及國外引進材料，用 TaGS2-A1、 TaGS2-B1和 TaGS2-D1等功能標記鑒定對應的基因，并結合相關農藝性狀發(fā)掘優(yōu)勢單倍型。結果表明，黃淮麥區(qū)2008年之前育成的種質材料和新育成品種(系)中 TaGS2等位基因分布頻率存在一定的差異； TaGS2-A1b、 TaGS2-B1b和 TaGS2-D1a是優(yōu)勢 TaGS2等位基因， TaGS2-A1b在小麥抽穗期、株高和小穗數(shù)的改良上是優(yōu)勢單倍型，但在新育成的品種(系)中有下降的趨勢， TaGS2-D1a能夠顯著增加小穗數(shù)、穗粒數(shù)和穗粒重，在各類材料中的比例都較高； TaGS2-B1b是提高千粒重的優(yōu)勢單倍型。因此，在黃淮麥區(qū)小麥穗部性狀改良中 TaGS2-B1b和 TaGS2-D1a的作用顯著，尤其是 TaGS2-D1a，同時黃淮麥區(qū)種植小麥遺傳多樣性在減少，一些優(yōu)勢單倍型未受到重視，應對地方品種和一些國外引進材料加以利用。

關鍵詞：小麥； TaGS2；功能標記；單倍型；關聯(lián)分析

氮是維持小麥高產穩(wěn)產需求量的重要元素。多年來，氮肥的過量施用在滿足小麥生長發(fā)育獲得高產的同時也造成了嚴重環(huán)境污染。因此，在保障小麥高產優(yōu)質的同時，如何提高氮素利用效率就顯得非常重要。發(fā)掘和利用與小麥高產和氮素利用相關的基因是促進氮素高效利用的重要途徑。谷氨酰胺合成酶(GS)是高等植物氮代謝的關鍵酶[1]，對氨基酸的初步合成和來自光呼吸過程中氮的再動員起著關鍵作用[2]。GS有兩種同工酶，分別是胞液型GS1和質體型GS2，兩者具有不同的生理功能[3-4]。GS基因對小麥氮素利用效率和農藝性狀的影響已經有很多學者進行了研究。在小麥中過量表達GS1基因可使小麥籽粒產量提高了20%[5]；在后來的研究中Habash[6]發(fā)現(xiàn)，GS活性與小麥葉片可溶性蛋白和氮含量呈正相關，并且通過構建中國春與SQ1的QTL作圖群體發(fā)現(xiàn)控制小麥葉片可溶性蛋白、氮含量和產量性狀的QTLs與2AS上GS2的QTL位點重合；Gadaleta等[7]通過對硬粒小麥GS2基因的研究發(fā)現(xiàn)，位于2A和2B上的兩個GS2基因與小麥籽粒蛋白質含量相關的QTLs處于同一區(qū)域。這些研究雖然從不同方面反映出GS2是一個與小麥氮素利用相關的基因，但是很少有學者對GS2基因在不同小麥種質資源中的分布進行探究。Li等[8]從中國春和小偃54基因組DNA序列中鑒定出3種TaGS2序列，通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)了多個單倍型，并通過對一些小麥材料和性狀的關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)TaGS2-A1b、TaGS2-B1a、TaGS2-B1b和TaGS2-D1a對小麥產量和氮素利用效率的提高具有顯著作用。但TaGS2基因在黃淮麥區(qū)小麥品種(系)中的分布如何、與TaGS2有關的功能標記能否對該區(qū)的種質材料進行檢測以及與哪些農藝性狀存在關聯(lián)，這些問題目前都尚不清楚。基于此，本研究通過搜集黃淮麥區(qū)小麥骨干親本和優(yōu)異的種質資源對TaGS2等位基因進行鑒定，發(fā)掘優(yōu)異的等位變異，以期為黃淮麥區(qū)小麥高產和氮高效育種提供檢測依據(jù)和一定的技術支撐。

1材料與方法

1.1材 料

供試材料有2008之前育成154份黃淮麥區(qū)種質材料、新育成的品種(系)(包括53份2014-2015年國家黃淮南片區(qū)試品系和71份2014-2015年度陜西省區(qū)試材料)及57份國外引進材料。

1.2方 法

1.2.1田間種植和農藝性狀調查

124份區(qū)試材料于2014年10月初種植于楊凌國家區(qū)試試驗站，按照小麥國家區(qū)試標準進行種植；154份黃淮麥區(qū)材料和57份國外引進材料于2013-2015種植于西北農林科技大學實驗基地，并按單因素隨機區(qū)組設置試驗，每個材料種植2行，行長2 m，行距0.25 m，株距2 cm，三個重復。154份黃淮麥區(qū)種質材料調查的主要農藝性狀有抽穗期(從播種到抽穗的天數(shù))、株高、小穗數(shù)、穗粒數(shù)、小穗密度、穗粒重、穗下節(jié)直徑和厚度、不育小穗數(shù)、粒重等。

1.2.2基因組DNA提取

在小麥苗期，選取幼嫩的葉片按照改良CTAB法[9-10]提取供試材料中小麥基因組DNA。將DNA溶于TE溶液中，利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，并用紫外分光光度計檢測其濃度。

1.2.3TaGS2功能標記的檢測

試驗所用的功能標記引物參照李新鵬等[8]所公布的引物序列(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系20 μL，包括2×Mix混合液10 μL，上下游引物各1 μL(5 μmol·L-1)，模板DNA 2 μL(200 ng·μL)，ddH2O 6 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，退火40 s(具體標記退火溫度見表1)，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。TaGS2-B1的兩個功能標記的PCR產物均由6%的變性聚丙酰胺凝膠電泳檢測，TaGS-A1和TaGS-D1功能標記擴增的產物用1.6%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并按序列間的多態(tài)性統(tǒng)計單倍型。

1.3數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理，用SPSS 20.0對基因型和表型性狀進行t測驗和關聯(lián)分析。

2結果與分析

2.1TaGS2-A1基因在供試小麥材料中的分布

在供試小麥材料中，沒有發(fā)現(xiàn)TaGS2-A1新的等位變異(圖1和表2)。在335份小麥材料中，151份材料擴增出與TaGS2-A1a帶型相同的片段，占供試材料的45%，而181份材料檢測出TaGS2-A1b，占供試材料的55%。在2008年之前黃淮麥區(qū)育成的種質材料(154份)中，66份(43%)材料含有TaGS2-A1a帶型，88份(57%)材料包含有TaGS2-A1b帶型；2014-2015年度國家黃淮麥區(qū)南片區(qū)試材料中，只有23份(43%)材料檢測出TaGS2-A1b，而檢測出TaGS2-A1a帶型的材料卻有30份(57%)，TaGS-A1等位變異在兩個不同時期的小麥材料中的分布存在很大的差異; 但是從2014-2015年度陜西省區(qū)試材料(71份)中仍能夠檢測出27份(38%)包含有TaGS2-A1a，44份(62%)攜帶有TaGS2-A1b，這與2008前黃淮麥區(qū)種質材料中TaGS2-A1基因型分布較為一致；從國外引進的種質資源(57份)中有28份材料檢測出TaGS2-A1a，29份材料檢測出TaGS2-A1b，TaGS2-A1兩種基因型在國外引進材料中的分布沒有明顯的差異。

M：DL2000；1：碧螞1號；2：偃展4110；3：周8425B；4：西農1376；5：鄭麥9023；6：小偃22；7：周麥22；8：鄭州3號；9：PH 82-2；10：鄭引1號；11鄭麥366；12：矮抗58

M:DL2000; 1:Bima 1; 2:Yanzhan 4110; 3:Zhou 8425B; 4:Xinong 1376; 5:Zhengmai 9023; 6:Xiaoyan 22; 7:Zhoumai 22; 8:Zhengzhou 3; 9:PH 82-2; 10:Zhengyin 1; 11:Zhengmai 366; 12:Aikang 58

圖1功能標記TaGS2-A1擴增出的片段類型

Fig.1PCR fragments amplified with the

function markerTaGS2-A1

2.2TaGS2-B1基因在供試小麥材料中的分布

在供試材料中，有5種TaGS2-B1基因型存在，沒有發(fā)現(xiàn)其他新的等位變異(圖2和表2)。在供試材料TaGS2-B1等位變異中，TaGS2-B1a和TaGS2-B1b是主要的單倍型。TaGS2-B1a在2008年之前育成的黃淮麥區(qū)材料中檢測出54份(35%)，在2014-2015年陜西省區(qū)試材料和外國引進材料中分別檢測出17份(24%)和16份(28%)，而在2014-2015年黃淮南片區(qū)試材料中卻檢測出28份(53%)；在2008年之前育成的黃淮麥區(qū)材料中TaGS2-B1b單倍型的比例(55%)比2014-2015年度黃淮麥區(qū)南片區(qū)試材料中的比例(47%)要高；在供試材料中區(qū)TaGS2-B1d的比例(9%)也很大，但在2008年之前黃淮麥區(qū)材料中TaGS2-B1d只有4份(3%)，在2014-2015年度黃淮麥區(qū)南片區(qū)試材料中卻沒有檢測出，而在2014-2015年度陜西省小麥區(qū)試材料中TaGS2-B1d基因型有8份(14%)，在國外引進材料中則有更多的TaGS2-B1d基因型(18份，占國外引進材料的32%)。因此，在供試材料中TaGS2-B1a、TaGS2-B1b和TaGS2-B1d單倍型的分布呈現(xiàn)出很大變化。在TaGS2-B1等位變異中，TaGS2-B1e、TaGS2-B1f是2種稀有單倍型，在2014-2015年度黃淮麥區(qū)南片區(qū)試材料中卻未被檢測出。

表2　 TaGS2等位基因在供試材料中的分布

Ⅰ：黃淮麥區(qū)生產中正在應用的小麥種質(2008年之育成)；Ⅱ：2014-2015年度黃淮麥區(qū)南片區(qū)試材料；Ⅲ：2014-2015年度陜西省區(qū)試材料；Ⅳ:國外引進材料

I：Wheat varieties from Huang-Huai wheat region before 2008; Ⅱ：Wheat varieties from Huang-Huai southern wheat regional trial between 2014 and 2015; Ⅲ：Wheat varieties from Shaanxi province regional trial between 2014 and 2015; Ⅳ：Introduced varieties

2.3TaGS2-D1基因在供試小麥材料中的分布

在TaGS2-D1等位變異(圖3和表2)中，TaGS2-D1a不僅在供試材料中占據(jù)較高的比例(234份，占供試材料的70%)，而且在不同材料中的比例也較高；TaGS2-D1b在國外引進材料和2008年前黃淮麥區(qū)材料中分別檢測出22份(占39%)和52份(占34%)，但在2014-2015年度黃淮南片區(qū)試(12份，占23%)和陜西省區(qū)試材料(15份，占21%)的比例較低，表明TaGS2-D1a在小麥種質材料中是優(yōu)勢單倍型。從2014-2015年度黃淮南片區(qū)試、陜西省區(qū)試和2008年前黃淮麥區(qū)材料中TaGS2-D1a基因型分布可以看出，該基因型在黃淮麥區(qū)材料中的比例在增加。

2.4TaGS2基因等位變異與小麥農藝性狀的關系

通過對154份黃淮麥區(qū)小麥材料農藝性狀與TaGS2基因關聯(lián)分析，TaGS2-A1a和TaGS2-A1b基因型間、TaGS2-D1a和TaGS2-D1b基因型間抽穗期差異顯著或極顯著；TaGS2-A1a和TaGS2-A1b基因型間株高、小穗數(shù)和穗下節(jié)直徑差異顯著，而小穗密度、穗粒重、穗粒數(shù)等性狀不存在顯著差異。對TaGS2-D1兩種等位變異關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，TaGS2-D1a和TaGS2-D1b兩種基因型間小穗數(shù)、小穗密度、穗粒數(shù)、穗粒重等穗部性狀存在顯著差異，而株高和穗下節(jié)直徑差異不顯著。此外，TaGS2-B1兩種主要的基因型TaGS2-B1a和TaGS2-B1b間千粒重差異顯著，而其他農藝性狀沒有顯著性差異(表3)?？梢?，在黃淮麥區(qū)中，TaGS2-A1b和TaGS2-D1a基因型的材料能夠提前抽穗，TaGS2-A1b單倍型能夠降低株高和增加穗下節(jié)直徑，TaGS2-D1a能夠增加小穗數(shù)、穗粒數(shù)和穗粒重，在這些性狀上TaGS2-A1b和TaGS2-D1a是優(yōu)勢的基因型，而TaGS2-B1b單倍型對千粒重的提高具有顯著作用，是優(yōu)勢等位變異。

3討 論

小麥是一個異源六倍體作物，基因組大，重復序列高，對單個基因位點的檢測難度較大，但小麥不僅A、B和D三個基因組之間有著非常好的共線性[11]，而且與水稻、短柄草等存在一定共線性[12-13]，這就使得小麥基因研究結果能夠得到驗證，可以提高結果的可信度。本研究中，經表型性狀的關聯(lián)分析，TaGS2-A1和TaGS2-D1基因型間抽穗期存在顯著差異，表明在兩個基因附近存在著控制抽穗期的基因或QTL。在水稻中也發(fā)現(xiàn)GS2位點附近有葉片衰老[14]、抽穗時間[15]等性狀的QTL位點與GS2連鎖。株高和千粒重是小麥育種中兩個重要農藝性狀。本研究表明，TaGS2-A1b能夠顯著降低株高，盡管現(xiàn)在還沒有相關的文獻來驗證這一結果，但是我們推測在TaGS2-A1基因附近可能存在與株高相關的QTL位點；僅在TaGS2-B1基因型之間檢測到千粒重存在顯著差異，這與Li等[15]的研究結果有所不同，這可能與試驗材料不同有關；在TaGS2-D1和TaGS2-A1基因型之間也檢測到了小穗數(shù)差異顯著，這與Ma等[16]利用“南大2419×望水白”分離群體發(fā)現(xiàn)一個與控制小穗數(shù)QTL連鎖的標記的研究結果較為一致。小穗數(shù)、小穗密度和穗粒重在不同TaGS2基因型之間存在顯著差異，而Peng等[17]也在這一區(qū)間內發(fā)現(xiàn)小穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重等性狀相關的標記，表明這一區(qū)段在小麥遺傳改良中具有重要的研究價值，應該給予重視。

1：周麥31；2：碧螞1號；3：中麥895；4豫麥47；5：豫麥50；6：鄭麥9023；7：鄭麥366；8：內鄉(xiāng)188；9：周麥30；10：偃展4110；11：豫麥34；12：小偃81

1：Zhouma 31; 2:Bima 1; 3:Zhongmai 895; 4:Yumai 47; 5:Yumai 50; 6:Zhengmai 9023; 7:Zhengmai 366; 8:Neixiang 188; 9:Zhoumai 30; 10:Yanzhan 4110; 11:Yumai 34; 12:Xiaoyan 81

圖2功能標記TaGS2-B1擴增

出片段的部分類型

Fig.2PCR fragments amplified with the

function markerTaGS2-B1

M：DL2000；1：陜麥509；2：中麥895；3：小偃54；4：西農1376；5：碧螞1號；6：豫麥34；7：周8425B；8：小偃81；9；周麥22；10鄭引1號；11：矮抗58；12：PH 82-2

M：DL2000; 1:Shaanmai 509; 2:Zhongmai 895; 3:Xiaoyan 54; 4:Xinong 1376; 5:Bima 1; 6:Yumai 34; 7:Zhou 8425B; 8:Xiaoyan 81; 9:Zhoumai 22; 10:Zhengyin 1; 11:Aikang 58; 12:PH 82-2

圖3　功能標記 TaGS2-D1擴增出的片段類型

表型值中，不同大寫和小寫字母分別表示不同單倍型在0.01和0.05水平下差異顯著；*：品種數(shù)目

In phenotype values,capital and small letters designate significance between different haplotypes at 0.01 and 0.05 level,respectively; *：Number of accession

從不同年份供試材料TaGS2等位變異分布看，三個TaGS2基因單倍型的頻率均出現(xiàn)不同程度的變化。TaGS2-D1a單倍型在不同年份材料中的比例在增加，而TaGS2-A1b和TaGS2-B1b單倍型在黃淮南片區(qū)試材料中的比例卻在減少，但是在陜西省區(qū)試中卻呈現(xiàn)增長的趨勢，TaGS2-B1e和TaGS2-B1f是稀有的單倍型，其比例也在降低。對于TaGS2單倍型頻率的變化，推測可能有幾種原因：一是在試驗材料選擇中，2008年之前黃淮麥區(qū)的材料154份，而2014-2015年度的黃淮南片區(qū)試材料只有53份，材料人為選擇可能導致基因型比例不同的一個重要原因；二是單倍型決定了性狀，在育種過程中對性狀的選擇直接導致了單倍型頻率的改變；三是選擇牽連效應[18-19]，由于單倍型并不導致性狀的改變，但是與決定性狀的基因存在連鎖關系，育種中在選擇決定性狀基因的同時也選擇了單倍型。從2014-2015年度陜西省區(qū)試和黃淮南片區(qū)試材料中，TaGS2等位基因型的分布并沒有呈現(xiàn)一致性趨勢，因此第二和三種推測出現(xiàn)的可能性較小，具體什么原因造成TaGS2基因型頻率的改變，需要更深入的研究。從TaGS2等位變異頻率看，各單倍型在國外引進材料和國內材料中的頻率幾乎有很大差異，尤其是TaGS2-B1d的頻率，這樣很可能是在小麥種質資源改良中，只關注國外材料中的一些個別性狀如豐產性、抗病性等造成的。從供試材料TaGS2等位基因變異頻率變化上來看，我國黃淮麥區(qū)小麥遺傳多樣正在逐步減少，因此有必要對地方品種和國外引進材料進行重視和加以利用。

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Allelic Variations ofTaGS2Genes and Their Association with Agronomic Traits in Whaet Cultivars from Huang-Huai Wheat Region in China and Overseas

SONG Xiaopeng1,WANG Yujuan2,WU Bingjin1,MA Wenjie1,ZHANG Deqiang1,ZHOU Limin1,SUN Daojie1

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;2.Yangling Seed Station,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Abstract:Glutamine synthetase (GS) plays a key role in the nitrogen (N) use and yield potential of bread wheat. Investigating the haplotypes in TaGS2 genes and their associations with agronomic traits may be a useful approach for improving wheat yield and N-use efficiency. In this study,278 elite wheat varieties from Huang-Huai winter wheat region and 57 introduced varieties were used to discover the frequencies of TaGS2 haplotypes and the association between TaGS2 and agronomic traits,in addition,corresponding allelic variants were also identified using the function markers of TaGS2 genes. The results indicated that the frequency of allelic variation of TaGS2 genes detected were different between those wheat varieties,three favorable TaGS2 haplotypes ( TaGS2-A1b, TaGS2-B1b and TaGS2-D1a) were revealed,but the frequencies of TaGS2-A1b and TaGS2-B1b among varieties in different years presented a downward trend. TaGS2-A1b was considered as a potential haplotype for improving heading date,plant height and spikelet number per ear, TaGS2-D1a was associated with significantly higher values in spikelet number per ear,grain number per ear and grain weight per ear,while TaGS2-B1b was a potential superior haplotype for increasing 1 000-grain weight,nevertheless, TaGS2-D1a for improving spike traits may be more valued by many breeders. In the Huang-Huai wheat region,the genetic diversity of wheat varieties was reducing,so we should pay more attention to landrace and some introduced varieties.

Key words:Wheat; TaGS2; Function marker; Haplotype; Association analysis

中圖分類號：S512.1；S330

文獻標識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)03-0281-06

通訊作者：孫道杰(E-mail:chinawheat@hotmail.com)

基金項目：國家重點基礎研究計劃項目(2014CB138100)；陜西省自然科學基金項目(2015JM3094)；陜西省重點科技創(chuàng)新團隊資助項目(2014KCT-25)

收稿日期：2015-09-14修回日期：2015-11-07

網(wǎng)絡出版時間：2016-03-01

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160301.1338.008.html

第一作者E-mail:171302897@qq.com