王俊生， 胡利宗， 劉紅占， 王永立， 陳　龍

( 周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院， 河南 周口 466001 )

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番茄中Rpi-blb2同源基因的挖掘與鑒定

王俊生， 胡利宗， 劉紅占， 王永立， 陳龍

( 周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院， 河南 周口 466001 )

摘要：番茄晚疫病是番茄生產(chǎn)中的主要病害之一，經(jīng)常會(huì)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。晚疫病生理小種的變異和進(jìn)化常會(huì)導(dǎo)致番茄品種原有的遺傳抗性喪失，因此不斷挖掘新的抗性基因，改良番茄晚疫病抗性是番茄抗病育種的長(zhǎng)期任務(wù)。該研究采用BLAST同源比對(duì)的方法，以馬鈴薯野生近緣種的晚疫病抗性蛋白序列Rpi-blb2為種子序列，在NCBI蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到11條番茄蛋白質(zhì)序列，這些序列與種子序列相似性為78%～83%，屬于番茄疾病抗性蛋白家族，并對(duì)該家族成員進(jìn)行了基因結(jié)構(gòu)、基因定位、序列保守結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化關(guān)系等分析。結(jié)果表明：該家族中10條序列分布在第Ⅵ條染色體上，1條分布在第Ⅴ染色體上；6號(hào)染色體上的10序列呈現(xiàn)2個(gè)抗病基因簇分布，在染色體上分別占據(jù)2個(gè)和3個(gè)基因位點(diǎn)；10條同源蛋白是Rpi-blb2的共同垂直同源蛋白，但不具有平行同源關(guān)系，大多數(shù)成員定位于細(xì)胞質(zhì)。按照蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域和基因定位的不同可分為三類，第一類共4條系列，包含有DUF3542和NB-ARC兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域特征序列；第二類共6條序列，與馬鈴薯Rpi-blb2蛋白一樣，僅包含NB-ARC保守結(jié)構(gòu)域特征序列，在這2類蛋白序列的NB-ARC結(jié)構(gòu)域均位于序列中部；第三類(僅包含XP_004239406.1)雖然也具有與第一類蛋白相似的DUF3542和NB-ARC結(jié)構(gòu)域，但在結(jié)構(gòu)域兩端的非保守區(qū)序列較短，且位于5號(hào)染色體上，因此將其單獨(dú)歸為1類。前兩類蛋白成員相應(yīng)的基因具有1～2個(gè)內(nèi)含子，第3類蛋白不含內(nèi)含子。該研究結(jié)果為利用生物技術(shù)選育番茄抗性品種提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番茄， 晚疫病， 基因， 垂直同源， 進(jìn)化分析

番茄(Solanumlycopersicum)是在世界范圍內(nèi)廣泛種植的主要蔬菜之一，被各國(guó)人民所喜愛(ài)。番茄晚疫病(Phytophthora infestans)是番茄生產(chǎn)中的主要病害之一，可導(dǎo)致植株莖葉死亡和果實(shí)變褐甚至腐爛，每年在番茄主產(chǎn)區(qū)均造成較大的經(jīng)濟(jì)損失(Kamoun ，2001 )，已成為番茄生產(chǎn)的主要障礙之一。由于病源生理小種的不斷變異，導(dǎo)致生產(chǎn)上番茄品種的抗性逐漸喪失，加重了晚疫病病害的發(fā)生(趙統(tǒng)敏等，2006)。利用抗菌劑類藥物進(jìn)行防治不僅會(huì)造成環(huán)境污染，還會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗耐藥性，促進(jìn)生理小種變異(Daayf & Platt， 2012)，不利于晚疫病的控制，而選育抗性品種不僅可以從根本上克服番茄晚疫病的發(fā)生，而且經(jīng)濟(jì)有效。鑒定和克隆晚疫病抗性基因是選育抗性品種的基礎(chǔ)，尤其一些廣譜主效基因在育種上的應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生較好的效果。近年來(lái)，在番茄抗晚疫病基因克隆方面取得了較好的進(jìn)展，如Chunwongse et al(2002)、Moreau et al(1998)、Brouwer et al(2004)和Kole et al(2006)分別克隆了抗番茄晚疫病的幾個(gè)主效基因，如Ph-1、Ph-2、Ph-3和Ph-4，但隨后發(fā)現(xiàn)番茄中出現(xiàn)了能克服以上主效基因的晚疫病菌株(賈芝琪等，2009)；Zhang et al(2013)把野生醋栗番茄中獲得的抗性基因Ph-3轉(zhuǎn)入番茄栽培種中使其獲得了廣譜晚疫病菌抗性，并且對(duì)其進(jìn)行了染色體精細(xì)定位。然而目前已有的番茄野生資源中，尚沒(méi)有發(fā)現(xiàn)更好的其他抗性基因，尤其廣譜性晚疫病抗性基因。

從植物野生近緣種中挖掘鑒定抗性基因并導(dǎo)入栽培物種中，選育抗性植物品種是常用育種策略之一。近年來(lái)，從馬鈴薯野生種中克隆鑒定出了20多個(gè)抗性基因(周軍會(huì)，2008)。其中，Rpi-blb1和Rpi-blb2是從馬鈴薯野生種(Solanumbulbocastanum)中分離出的晚疫病廣譜抗性基因(Van der Vossen et al，2003，2005)，并且Rpi-blb2基因被轉(zhuǎn)入番茄中獲得了抗馬鈴薯晚疫病菌株的番茄植株(Van der Vossen et al， 2005)，證明了這種抗性可以在番茄和馬鈴薯之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，但是否可以抵抗番茄晚疫病生理小種尚未可知。馬鈴薯和番茄同屬茄科植物二倍體物種，均具有12對(duì)染色體，是比較基因組學(xué)研究的理想材料。因此，本研究以野生馬鈴薯抗病基因Rpi-blb2的蛋白序列為種子序列，基于番茄蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)、基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、遺傳圖譜和物理圖譜等生物信息資源，利用生物信息學(xué)方法挖掘番茄中與馬鈴薯Rpi-blb2基因同源的抗性蛋白(或基因)家族，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)信息、定位信息、序列進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行了較為全面的分析，為揭示該家族蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，并利用相關(guān)信息進(jìn)行番茄抗晚疫病的分子育種奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 番茄抗性蛋白家族序列來(lái)源

以馬鈴薯抗晚疫病基因Rpi-blb2(核酸序列Accession number DQ122125.1：7967bp)相應(yīng)蛋白序列(Accession number為AAZ95005.1，1267個(gè)氨基酸)作為種子序列，在NCBI(http://www.cbi.nlm.nih.gov/) 番茄非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源搜索，蛋白序列相似性設(shè)定為≥40%，相應(yīng)的核酸序列從蛋白質(zhì)序列檢索結(jié)果中超鏈接進(jìn)入。

1.2 蛋白基本信息和基因結(jié)構(gòu)、基因定位信息獲取

通過(guò)在蛋白比對(duì)結(jié)果網(wǎng)頁(yè)中，獲得比對(duì)序列之間的相似性和蛋白序列基本信息，鏈接目標(biāo)蛋白序列，可以獲得其相應(yīng)的核酸序列信息；通過(guò)相應(yīng)的GeneID超鏈接或者利用序列網(wǎng)頁(yè)中提供的Map Viewer超鏈接可以獲得相應(yīng)基因的定位信息和基因結(jié)構(gòu)信息、基因符號(hào)和基因功能描述等；也可以從相應(yīng)的mRNA序列(XM004245875.1)注釋信息中獲得基因定位識(shí)別號(hào)進(jìn)行超鏈接，從而獲得相應(yīng)基因定位信息和基因結(jié)構(gòu)信息。

1.3 蛋白分子量、等電點(diǎn)和保守結(jié)構(gòu)域分析和亞細(xì)胞定位

利用ExPASy網(wǎng)站提供的在線Prot-Param軟件(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)(pI)等分析；利用CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 在線軟件分析蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域；利用Plant-mPloc 軟件(http://www.csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.4 蛋白質(zhì)序列進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)Conserved Domain(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線工具，搜索蛋白質(zhì)序列保守域；在BLAST-protein結(jié)果頁(yè)，選擇所有同源目標(biāo)序列后，利用Tree View功能顯示比對(duì)序列與同源序列的距離進(jìn)化樹(shù)(采用Neighbor Joining法，kimura protein 距離，序列最大差異值設(shè)定為0.7，有根樹(shù)顯示)；下載比對(duì)結(jié)果中的目標(biāo)序列到本地硬盤，采用DNAman軟件進(jìn)行多序列比對(duì)(采用缺省參數(shù))，分析番茄SLy-Rpi-blb2蛋白家族成員之間進(jìn)化關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1 番茄Sly-Rpi-blb2蛋白家族與馬鈴薯Rpi-blb2蛋白是垂直同源關(guān)系

2.1.1 番茄同源抗性蛋白序列基本信息以野生馬鈴薯抗晚疫病基因Rpi-blb2(核酸序列Accession number 為DQ122125.1：7967 bp)相應(yīng)蛋白序列(Accession number為AAZ95005.1，1 267個(gè)氨基酸)作為種子序列，在番茄非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTp同源搜索，獲得了18條相似性在40%以上的同源序列，其中與11條序列的相似性為78%～83%，11條序列之間的相似性為85%～100%。進(jìn)一步比對(duì)查詢這11條序列的相關(guān)信息(表1)，發(fā)現(xiàn)這些序列長(zhǎng)度不等，最長(zhǎng)為1 257 個(gè)氨基酸，最短566 個(gè)氨基酸，其中有10條定位于第6號(hào)染色體，1條定位于5號(hào)染色體，均與番茄抗病性(晚疫病和根結(jié)線蟲病抗性)密切相關(guān)；位于6號(hào)染色體上的10條序列分子量接近，等電點(diǎn)分布在4.85～5.19之間，非常接近，表明這些蛋白質(zhì)以酸性氨基酸為主，作用環(huán)境偏酸性。因此，推測(cè)這些蛋白序列可能與野生馬鈴薯Rpi-blb2蛋白互為共同垂直同源蛋白(Coorthologs)，他們之間互為平行同源蛋白。位于5號(hào)染色體上的XP_004239406.1序列長(zhǎng)度僅566個(gè)氨基酸，推測(cè)該蛋白的祖先基因序列可能發(fā)生了部分復(fù)制、轉(zhuǎn)移和插入等進(jìn)化事件。因此，把這11條蛋白質(zhì)序列暫命名為SLy-Rpi-blb2蛋白亞家族。

2.1.2 番茄SLy-Rpi-blb2蛋白家族基因定位和亞細(xì)胞定位基因定位結(jié)果(表2，圖1)表明，該蛋白家族分布在6號(hào)染色體上的10個(gè)成員定位在2.3 M～2.75 M之間，其中8個(gè)成員分布在5個(gè)基因位點(diǎn)，并且集中分布在2個(gè)區(qū)段，成簇分布，其中第一族包括3條序列(XP_004240499.1、NP_001234063.1和XP_004240498.1)，并且XP_004240499.1和NP_001234063.1占據(jù)基因組上相同位點(diǎn)，這與兩條序列來(lái)自不同抗性品種相關(guān)；第二簇包括5條序列，分別為ABI96216.1、XP_004240523.1、AAC97933.1、NP-001234622.1和ABI96218.1，其中后3條序列位于基因組上同一位點(diǎn)；另外2個(gè)成員(AAC32253.1和AAC32252.1)未能定位于染色體具體位置。該蛋白家族中的各成員在基因組成上比較簡(jiǎn)單(表2)，僅有1～3個(gè)外顯子數(shù)。采用Plant-mPloc在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，11條蛋白序列均定位于細(xì)胞質(zhì)中，這與野生馬鈴薯Rpi-blb2蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果相同。

2.1.3 番茄SLy-Rpi-blb2蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域分析 對(duì)11條同源蛋白序列通過(guò)Conserved Domain在線工具，搜索其保守域，結(jié)果表明這些蛋白的精確保守域共有3類，第一類共4條系列，包括XP_004240523.1、AAC97933.1、NP_001234063.1和AAC32252.1，同時(shí)包含有DUF3542和NB-ARC兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域特征序列，第二類包括XP_004240499.1、NP_001234622.1、AAC32253.1、ABI96218.1、ABI96216.1和XP_004240498.1，僅包含NB-ARC保守結(jié)構(gòu)域特征序列，并且與馬鈴薯Rpi-blb2蛋白保守結(jié)構(gòu)一致(圖1：B)，因此推測(cè)第二類蛋白與馬鈴薯Rpi-blb2蛋白(AAZ95005.1)的進(jìn)化距離最近，與這類蛋白的祖先序列最為接近，分化較早，在這2類蛋白序列中，NB-ARC結(jié)構(gòu)域均位于序列中段；第三類(僅包含一條序列XP_004239406.1)雖然也具有DUF3542和NB-ARC結(jié)構(gòu)域，并且2個(gè)結(jié)構(gòu)域間距與第一類非常接近，但在結(jié)構(gòu)域兩端的其他序列非常短，并且該序列位于5號(hào)染色體上，因此將其單獨(dú)歸為1類。

表 1　馬鈴薯Rpi-blb2蛋白在番茄中的同源蛋白序列信息

表 2　番茄SLy-Rpi-blb2蛋白家族基因定位與結(jié)構(gòu)信息

注： “—”表示未能獲得相關(guān)信息。

Note: “—”indicates failed to get relevant information.

圖 1　番茄SLy-Rpi-blb2蛋白家族成員在基因組上的分布位置Fig. 1　Location for members of SLy-Rpi-blb2 protein family in tomato genome

2.2 番茄SLy-Rpi-blb2蛋白家族成員的序列比對(duì)、基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化

為了進(jìn)一步確定SLy-Rpi-blb2蛋白家族成員之間以及與馬鈴薯Rpi-blb2的同源關(guān)系，利用馬鈴薯Rpi-blb2蛋白與番茄蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中相似性達(dá)到40%以上的18條抗性蛋白(包括晚疫病抗性蛋白)序列構(gòu)建拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)樹(shù)，結(jié)果(圖3)表明，野生馬鈴薯Rpi-blb2 蛋白(圖3中紅色箭頭所指)與表1中的11條番茄蛋白序列歸為一大類(圖3:A中蛋白家族I)，其他7條序列分為蛋白家族II和蛋白家族Ⅲ。表明這11條序列與馬鈴薯晚疫病抗性蛋白序列Rpi-blb2可能為共同垂直同源蛋白。將11條序列與種子序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析(圖4)，結(jié)果表明，有4條序列(分別為ABI96218.1(996 個(gè)氨基酸)、AAC32253.1(1204 個(gè)氨基酸)、AAC32252.1(1206 個(gè)氨基酸)和XP_004239406.1(566 個(gè)氨基酸)的長(zhǎng)度與種子序列差異較大，其他7條與番茄Rpi-blb2序列基本可以完全匹配，這7條序列與馬鈴薯Rpi-blb2蛋白序列相比，在N端存在2個(gè)明顯的較短缺失序列(圖4：Ⅰ，缺失3個(gè)氨基酸；圖4：Ⅱ，缺失6個(gè)氨基酸)；ABI96218.1與ABI96216.1相比，最大差異在于C端缺失了249個(gè)氨基酸序列，這可能是兩者的祖先基因因?yàn)椴糠秩旧w片段缺失造成的，也可能是堿基突變?cè)斐删幋a序列提前終止引起的?；蚪Y(jié)構(gòu)(圖3：B)表明，該家族成員有3種基因結(jié)構(gòu)類型，第一類含有2個(gè)內(nèi)含子(5條序列)，第二類含有一個(gè)較小的內(nèi)含子(2條序列)，第三類不具有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(XP_004239406)，比較這些基因內(nèi)含子序列發(fā)現(xiàn)，第一個(gè)內(nèi)含子序列相對(duì)較長(zhǎng)，且長(zhǎng)度差異較大(556～2 199 bp)，序列間相似性差異也較大；第二內(nèi)含子位于靠近蛋白質(zhì)N段的編碼區(qū)內(nèi)，所有同源蛋白相應(yīng)核酸序列的第二內(nèi)含子長(zhǎng)度均為75 bp，且序列高度保守，這表明第二內(nèi)含子是一個(gè)相當(dāng)保守的區(qū)域，可能對(duì)這類蛋白具有重要作用，因此進(jìn)化過(guò)程中不易發(fā)生改變。

3討論

通過(guò)對(duì)生物信息數(shù)據(jù)進(jìn)行加工獲取有用知識(shí)，指導(dǎo)科研方向，是生物信息學(xué)常用的方法。馬鈴薯和番茄同屬茄科，進(jìn)化關(guān)系密切，因此利用馬鈴薯晚疫病抗性基因Rpi-blb2序列，從番茄蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了一個(gè)包含11條蛋白序列的蛋白家族SLy-Rpi-blb2，通過(guò)鑒定該家族成員與Rpi-blb2的進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守域特性等，確定該家族與種子序列是垂直同源關(guān)系。隨后對(duì)家族成員之間的進(jìn)化事件進(jìn)行了分析，表明該家族的共同祖先基因在漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷史中發(fā)生了基因復(fù)制、重排、可變剪接以及水平轉(zhuǎn)移事件，從而形成了較為豐富的后代同源基因(蛋白)，但與祖先基因(蛋白)序列相比，可能由于保守域序列的改變，從而導(dǎo)致不同成員在抗病的能力上發(fā)生了改變。

3.1 番茄SLy-Rp-Blb2蛋白家族與Rpi-blb2可能是垂直同源關(guān)系

NBS是指核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，植物疾病抗性蛋白中的NBS是一個(gè)大約320個(gè)氨基酸的高度保守序列，具有這種保守序列的蛋白可能是利用蛋白質(zhì)構(gòu)象變化調(diào)節(jié)NTP的水解，從而通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使寄主對(duì)病原菌正確識(shí)別，促進(jìn)寄主抗性防御信號(hào)的啟動(dòng)(Belkhadir et al， 2004; Leipe et al， 2004)。在植物抗性蛋白質(zhì)中NB-ARC結(jié)構(gòu)域就是NBS-LRR保守結(jié)構(gòu)域(Stuart Seah et al， 2007)。本研究中的種子序列Rpi-blb2(Van der Vossen et al， 2005) 具有顯著的NB-ARC保守結(jié)構(gòu)域序列特征，屬于AAA-ATPase 超級(jí)家族(圖2)，可能與這類蛋白參與病毒產(chǎn)生的植物過(guò)敏反應(yīng)或程序性死亡有關(guān)(Van der Biezen1，1998)。DUF3542保守域序列的功能尚未可知，但具有DUF3542結(jié)構(gòu)域的蛋白序列長(zhǎng)度一般在516～1 284個(gè)氨基酸，并且這類蛋白多與NB-ARC結(jié)構(gòu)域有關(guān)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=XP_004240523.1)。在番茄SLy-Rp-Blb2蛋白家族中，有7條序列與馬鈴薯Rp-blb2蛋白具有相同的保守結(jié)構(gòu)域，僅具有NB-ARC結(jié)構(gòu)域序列特征，另4條序列同時(shí)具有NB-ARC和DUF3542結(jié)構(gòu)域序列特征。通過(guò)對(duì)馬鈴薯Rpi-blb2蛋白和番茄蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中相似性較高(40%以上)的同源蛋白構(gòu)建序列進(jìn)化樹(shù)(圖3)和亞細(xì)胞定位分析(表2)，進(jìn)一步證明番茄SLy-Rp-Blb2蛋白家族與野生馬鈴薯Rp-blb2蛋白可能是垂直同源關(guān)系，由共同祖先種通過(guò)物種分化形成的。

圖 2　番茄SLy-Rpi-blb2蛋白家族成員結(jié)構(gòu)域Fig. 2　Conserved domain for tomato SLy-Rpi-blb2 protein family

圖 3　番茄SLy-Rpi-blb2的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(A)及SLy-Rpi-blb2家族成員基因結(jié)構(gòu)(B)　基因結(jié)構(gòu)圖中，上部粗線段表示mRNA序列，細(xì)線段表示基因組中內(nèi)含子序列，下部粗線表示蛋白編碼區(qū)。Fig. 3　Phylogenetic tree of tomato SLy-Rpi-blb2 protein family　Above blod lines indicate mRNA， slim lines indicate intron in genome， below blod lines indicate coding sequence.

圖 4　番茄SLy-Rpi-blb2蛋白家族成員序列比對(duì)Fig. 4　Aligned multi-sequence comparison for members of tomato SLy-Rpi-blb2 protein subfamily

在SLy-Rpi-blb2蛋白家族中，序列AAC97933.1(Mi-1)及其抗性蛋白同源序列(NP_001234063.1、NP_001234622.1、AAC32252.1和AAC32253.1)所在的染色體區(qū)段是利用胚胎挽救技術(shù)從茄科物種Solanumperuvianum中漸滲入番茄栽培種中的(Smith， 1944)，且導(dǎo)入的染色體片段位于番茄6號(hào)染色體短臂，而后通過(guò)育種實(shí)踐和長(zhǎng)期自然進(jìn)化，把滲入的染色體片斷減少到了約650 kb的區(qū)間，這一區(qū)間的抗性基因和不良性狀的緊密連鎖導(dǎo)致抗性基因與其它品種優(yōu)良基因重組率嚴(yán)重降低(Liharska et al， 1996；Kaloshian et al，1998；Schulte et al，2006)。但雜交和回交等技術(shù)的頻繁利用，使?jié)B入了攜帶Mi-1.1基因的染色體區(qū)段不斷發(fā)生染色體內(nèi)部重組、復(fù)制、重排以及染色體之間的交換，從而導(dǎo)致現(xiàn)在的抗性番茄品種(攜帶Mi-1.1基因區(qū)段)在這一區(qū)段與不具有Mi-1.1基因位點(diǎn)的易感根結(jié)線蟲品種相應(yīng)區(qū)段不完全一樣，這一點(diǎn)已得到證明(Kuang et al，2005; Stuart et al， 2007)。因此，番茄SLy-Rpi-blb2蛋白家族中的序列不再是簡(jiǎn)單的平行同源關(guān)系。從系統(tǒng)樹(shù)(圖3：A，有根樹(shù)，距離長(zhǎng)短表示進(jìn)化速率快慢)的末端節(jié)點(diǎn)到共同祖先節(jié)點(diǎn)距離來(lái)看，番茄11條序列的共同祖先序列為圖3中節(jié)點(diǎn)B代表的序列，從節(jié)點(diǎn)B到11條末端序列進(jìn)化中，只有序列XP_004240523.1進(jìn)化距離最短，并且沒(méi)有產(chǎn)生序列分化，其他10條序列到節(jié)點(diǎn)B之間存在相對(duì)復(fù)雜的進(jìn)化過(guò)程(存在較多的節(jié)點(diǎn))，因此推測(cè)XP_004240523.1是番茄中這類蛋白的祖先序列(或最原始序列)，其他序列可能是由該序列進(jìn)化而來(lái)。當(dāng)然這僅是根據(jù)構(gòu)建的距離進(jìn)化樹(shù)推斷，如果改變進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建方法或考慮基因結(jié)構(gòu)及相應(yīng)蛋白序列的保守域特性，可能會(huì)有不同的推斷結(jié)論。

3.2 番茄SLy-Rpi-blb2蛋白在基因組上成簇分布

植物基因組中抗性基因一般具有成簇存在的特點(diǎn)(Hulbert et al， 2001; Cannon et al， 2002)，這類基因編碼的蛋白的一個(gè)主要功能就是作為檢測(cè)分子可以偵測(cè)到特定病原物和害蟲的感染。Van der Vossen et al(2003)研究表明，在野生馬鈴薯Rpi-blb1基因(RGA2-blb)座位兩側(cè)分布有RGA3-blb、RGA1-blb和RGA4-blb同源基因(互為平行同源基因)，這些基因編碼的平行同源蛋白的序列相似性很高(70%～81%)，并且Rpi-blb1基因是祖先基因RGA1-blb和RGA3-blb通過(guò)重組事件進(jìn)化而來(lái)。已有證據(jù)表明(Aaron & Barbara， 2007)抗性基因簇可以通過(guò)重組過(guò)程中的錯(cuò)配，產(chǎn)生新的抗性基因序列，改變抗性特異性(抵抗新的病毒生理小種)或改變抗性基因的表達(dá)模式，而這一特性促進(jìn)了抗性基因的進(jìn)化；另外，抗性基因成簇分布，利于這些平行基因之間的序列交流，從而促進(jìn)和加速了抗性基因的進(jìn)化。

在茄科植物不同物種的6號(hào)染色體短臂區(qū)均分布著抗性基因集合，執(zhí)行對(duì)不同病原菌的抗性(Stuart et al，2007)。本研究獲得的番茄SLy-Rpi-blb2蛋白家族共11條序列，10條成簇分布在6號(hào)染色體的短臂序列 (2 327 335～2 750 696 bp，總長(zhǎng)624 kb)中，在染色體上的位置較靠近，執(zhí)行不同的抗性功能(表1)。其中第一簇有3條序列，占2個(gè)基因位點(diǎn)(圖1，Cluster 1p)，在Mi-1B基因上游的基因位點(diǎn)LOC101265033長(zhǎng)度為3 191 bp，是一個(gè)假定的晚疫病抗性蛋白同源序列，但不具有編碼蛋白功能，屬于假基因；第二簇有5條序列(Cluster 2p)，占3個(gè)基因位點(diǎn)，這一簇中，還分布兩個(gè)基因位點(diǎn)，分別是LOC1012267122和LOC101267412，其相應(yīng)的蛋白序列均與運(yùn)輸抑制響應(yīng)蛋白高度相似，這可能與該簇基因?qū)膊】剐缘捻憫?yīng)密切相關(guān)。另外2條AAC32252.1和AAC32253.1未能定位到具體的位置，但這2條序列來(lái)源于抗根結(jié)線蟲栽培品種Motelle，這一品種中的抗性基因均來(lái)源于茄科物種Solanumperuvianum中(Smith， 1944)，這一結(jié)論與Stuart et al(2007)基本一致。

番茄SLy-Rpi-blb2蛋白家族中11個(gè)成員間的序列相似性在85%以上，來(lái)自于抗性品種(Motelle或VFNT Cherry)的成員有5個(gè)，包括AAC97933.1、NP_001234063.1、NP_001234622.1、AAC32253.1和AAC32252.1，其他6個(gè)成員來(lái)自于易感根結(jié)線蟲品種(Heinz 1706)，因此部分成員在基因組被定位在相同位置(圖1)，如NP_001234063.1和XP_004240499.1分享同一基因位點(diǎn)，AAC97933.1、NP_001234622.1和ABI96218.1分享同一基因位點(diǎn)。這些蛋白在番茄抗病反應(yīng)中的功能目前并不完全清楚。Mi-1蛋白序列(AAC97933.1)與馬鈴薯Rpi-blb2具有82%的相似性(van der Vossen et al， 2005)，近來(lái)被證明是在ETR3蛋白參與下，通過(guò)感知荷爾蒙來(lái)介導(dǎo)番茄植株對(duì)根結(jié)線蟲的抗性(Mantelin et al，2013)，其同源序列Mi-1.2被證明具有根結(jié)線蟲抗性的功能(Nombela et al， 2003)，其他同源蛋白由于沒(méi)有相應(yīng)的獨(dú)立表現(xiàn)型，因此對(duì)其功能的鑒定比較困難(Stuart et al， 2007)。但由于可變剪接產(chǎn)生的較短的抗性蛋白質(zhì)同源序列，如本研究中的ABI96218.1(Mi-1G)編碼996 個(gè)氨基酸，具有完整N段區(qū)域，能反向調(diào)節(jié)Mi-1.2(Stuart et al， 2007)，從而調(diào)節(jié)番茄抗病性。定位于5號(hào)染色體上的蛋白質(zhì)序列XP_004239406.1(566 個(gè)氨基酸)，與其他10條序列相比，該序列在N段和C段分別缺失了大約500 個(gè)氨基酸和100個(gè)氨基酸的片段(圖2和圖4)，但該序列仍保留了2個(gè)保守域的序列特征(圖2)，從這一點(diǎn)來(lái)看，該序列與圖2中第一類序列應(yīng)歸為同一類；該基因編碼區(qū)序列是完整的，這意味著該基因(蛋白)可能具有新的功能，在后續(xù)功能研究中應(yīng)作為重點(diǎn)研究之一，然而該基因與其他同源基因的進(jìn)化關(guān)系目前尚不能完全確定。

本研究獲得的同源蛋白序列(基因)，大多數(shù)功能尚未被鑒定，因此在后續(xù)研究中可以重點(diǎn)鑒定其表達(dá)模式和性狀表現(xiàn)，以分析和鑒定其功能，為番茄抗病分子輔助育種提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn):

AARON RF，BARBARA JB， 2007. The evolution of resistance genes in multi-protein plant resistance systems [J]. Curr Opin Genet & Dev，17:493-499.

BELKHADIR Y，SUBRAMANIAM R，DANGL JL， 2004. Plant disease resistance protein signaling: NBS-LRR proteins and their partners [J]. Curr Opin Plant Biol(4)，7:391-399.BROUWER DJ，JONES ES，CLAIR DAS， 2004. QTL analysis of quantitative resistance toPhytophthorainfestans(late blight) in tomato and comparisons with potato [J]. Genome，47(3): 475-492.

CANNON SB，ZHU HY，BAUMGARTEN AM，et al， 2002. Diversity，distribution and ancient taxanomic relationships within the TIR and non-TIR NBS-LRR resistance gene subfamilies [J]. J Mol Evol，54(4):548-562.

Chunwongse J，Chunwongse C，Black L，et al， 1998. Molecular mapping of thePh-3 gene forlatebligh resistance in tomato [J]. J Hortic Sci Biotechnol，77(3): 281-286.

DAAYF F，PLATT HW， 2012. Changes in metalaxyl resistance among glucose phosphate isomerase genotypes ofPhytophthorainfestansin Canada during 1997 and 1998 [J]. Am J Potato Res，77(5): 311-318.

HULBERT SH，WEBB CA，SMITH SM，et al， 2001. Resistance gene: complexes: evolution and utilization [J]. Ann Rev Phytopathol，39:285-312.

JIA ZQ，CUI YH，LI Y，et al， 2009. Expression the potato late blight resistant geneR3a，R1 andRBin tomato [J]. Acta Hortic Sin，36(8):1 153-1 160. [賈芝琪，崔艷紅，李穎，等， 2009. 馬鈴薯抗晚疫病基因R3a、R1和RB在番茄中的表達(dá) [J]. 園藝學(xué)報(bào)，36(8):1 153-1 160.]

KAMOUN S， 2001. Non-host resistance toPhytophthora: novel prospects for a classical problem [J]. Curr Opin Plant Biol，4(4): 295-300.

KOLE C，ASHRAFI H，LIN G，et al， 2006. Identification and molecular mapping of a new R gene，Ph-4，conferring resistance to late blight in tomato [C]. Solanaceae Conf，Univ of Wisconsin，Madison，Abstr44.

KALOSHIAN I，YAGHOOBI J，LIHARSKA T，et al， 1998. Genetic and physical localization of the root-knot nematode resistance locus Mi in tomato [J]. Mol Gen Genet，257(3):376-385.KUANG H，WEI F，MARANO MR，et al， 2005. The R1 resistance gene cluster contains three groups of independently evolving，type R1 homologues and shows substantial structural variation among haplotypes ofSolanumdemissum[J]. Plant J，44(1): 37-51.

LEIPE DD，KOONIN EV，ARAVIND L， 2004. STAND，a class of P-loop NTPases including animal and plant regulators of programmed cell death: multiple，complex domain architectures，unusual phyletic patterns，and evolution by horizontal gene transfer [J]. J Mol Biol，343(1):1-28.LIHARSKA TB，KOORNNEEF M，VAN WORDRAGEN M，et al， 1996. Tomato chromosome 6: effect of alien chromosomal segments on recombinant frequencies [J]. Genome，39(3):485-491.

MANTELIN S，BHATTARAI KK，JHAVERI TZ，et al， 2013. Mi-1-mediated resistance toMeloidogyneincognitain tomato may not rely on ethylene but hormone perception through ETR3 participates in limiting nematode infection in a susceptible host [J]. PLoS ONE，8(5):63 281.

MOREAU P，THOQUET P，OLIVER J，et al， 1998. Genetic mapping ofPh-2，a single locus controlling partial resistance toPhytophthorainfestansin tomato [J]. Mol Plant Micr Interact，11(4): 259-269.

NOMBELA G，WILLIAMSON VM，MUNIZ M， 2003. The root-knot nematode resistance geneMi-1.2 of tomato is responsible for resistance against Whitefly Bemisia tabaci [J]. Mol Plant Microl Interact，16(7):645-649.

SMITH PG， 1944. Embryo culture of a tomato species hybrid. Proc Am Soc Hortic Sci，44:413-416.

SCHULTE D，CAI DG，KLEINE M，et al， 2006. A complete physical map of a wild beet (Beta procumbens ) translocation in sugar beet [J]. Mol Gen Genom，275(5):504-511.

ZHANG C，LIU L，ZHENG Z，et al， 2013. Fine mapping of thePh-3 gene conferring resistance to late blight (Phytophthorainfestans) in tomato [J]. Theor Appl Gene，126(10):2 643-53.

ZHOU JH， 2008. Advancement of late blight resistance genes in potato [J]. Biotechnol Bull，5: 13-17. [周軍會(huì)，2008. 馬鈴薯晚疫病抗病基因研究進(jìn)展 [J]. 生物技術(shù)通報(bào)，5: 13-17.]

STUART S，ADAM C，TELLEEN，et al， 2007. Introgressed and endogenousMi-1 gene clusters in tomato diver by complex rearrangements in flanking sequences and show sequence exchange and diversifying selection among homologue [J]. Theor Appl Genet，114(7):1 289-1 302.

VAN DER VOSSEN EA，GROS J，SIKKEMA A，et al， 2005. TheRpi-blb2 gene from solanum bulbocastanum is anMi-1 gene homolog conferring broad-spectrum late blight resistance in potato [J]. Plant J，44(2): 208-222.

VAN DER BIEZEN1 EA，JONES JD， 1998. The NB-ARC domain: a novel signaling motif shared by plant resistance gene products and regulators of cell death in animals [J]. Curr Biol，8(7): 226-228.

VAN DER VOSSEN EA，SIKKEMA A，HEKKERT B，et al， 2003. An ancient R gene from the wild potato species solanum bulbocastanum confers broad-spectrum resistance to phytophthora infestans in cultivated potato and tomato [J]. Plant J，36(6): 867-882.ZHAO TM，ZHOU CY，YU WG，et al， 2006. Research progress on tomato late blight and resistance breeding [J]. Jiangsu J Agric Sci，4(2): 175-180. [趙統(tǒng)敏，鄒茶英，余文貴，等， 2006. 番茄晚疫病及其抗病育種研究 [J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，4(2): 175-180.]

Discovery and identification of homology gene toRpi-blb2 in tomato (Solanumlycopersicum)

WANG Jun-Sheng， HU Li-Zong， LIU Hong-Zhan， WANG Yong-Li， CHEN Long

(CollegeofLifeSciencesandAgriculture，ZhoukouNormalUniversity， Zhoukou 466001， China )

Abstract:Late blight is the most destructive disease in tomato (Solanum lycopersicum) cultivation worldwide and will result in large economic losses. As the variation and evolution of original races， mining new resisitance gene and improving the genetic resistance to late blight is a major issue in breeding new varieties of tomato ， because of the new races will overcome the resistance gene-mediated genetic resistance from commercial varieties. Rpi-blb2， a potato late blight resistance protein as seed sequence， has 11 homology sequences from tomato protein sequences databank in NCBI and has a similarity to seed sequence range from 78%-83%. The above data were obtained by blast-protein way in this study. Then the gene structure， gene location， conserved domain feature of 11 protein sequences， and homology sequences of Rpi-blb2 belong to disease resistance protein sup-family of tomato and their evolution relationship were revealed and discussed. The results showed that ten of eleven distributed in the sixth chromosome， one the fifth chromosome; ten sequences distributed the sixth chromosome showed two gene clusters， containing two and three gene locus in the sixth chromosome， respectively. They were co-orthologous for Rpi-blb2 protein， but not paralogous each other， the most of them located in cytoplasm. According to the difference in structure domain and gene location， they were divided into three categories. The first category， a total of four members， contains DUF3542 and NB-ARC conser domain; The second category， a total of six members， like potatoes Rpi-blb2 protein， containing only NB-ARC conserved domain， the NB-ARC domain is located in the middle of these two kinds of protein sequences; The third category (only contains XP_004239406. 1) also has DUF3542 and NB-ARC domain and located on chromosome 5， but the non-conserved sequence at the ends of the domain is shorter. The members of the first two categories have one or two introns in gene structure， the third category does not contain introns. The study provides theory basis for breeding tomato disease resistance cultivar by molecular biology techniques.

Key words:tomato (Solanum lycopersicum)， late blight， gene， orthologous， phylogenetic analysis

中圖分類號(hào)：Q943.2，S641.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142(2016)04-0462-09

作者簡(jiǎn)介：王俊生(1970-)，男，陜西蒲城人，博士，副教授，主要從事生物信息教學(xué)與植物分子育種，(E-mail)wjs0099@163.com。

基金項(xiàng)目：河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目 (122300410127)； 河南省教育廳項(xiàng)目 (14B210022) [Supported by the Basic and Forefront Technology Research from Henan Office of Science and Technology (122300410127); the Project of Henan Education Office (14B210022)]。

*收稿日期:2014-11-12修回日期： 2015-04-03

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201408016

王俊生，胡利宗，劉紅占，等. 番茄中Rpi-blb2同源基因的挖掘與鑒定[J]. 廣西植物， 2016， 36(4)：462-470

WANG JS，HU LZ，LIU HZ，et al. Discovery and identification of homology gene toRpi-blb2 in tomato (Solanumlycopersicum) [J]. Guihaia， 2016， 36(4)：462-470