李　娜，羅學仕，葉碧華，李志文，吳　狄，李立華，李　紅，周長忍

(暨南大學 材料科學與工程系，人工器官與材料教育部工程中心，廣州 510632)

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“軟模板”法調(diào)控膠原的仿生礦化研究

李娜，羅學仕，葉碧華，李志文，吳狄，李立華，李紅，周長忍

(暨南大學 材料科學與工程系，人工器官與材料教育部工程中心，廣州 510632)

摘要：在模擬體內(nèi)pH值=7.4的膠原溶膠-凝膠體系中，加入β-甘油磷酸鈉(β-GP)作為礦化的磷源，并引入聚丙烯酸(PAA)和三聚磷酸鈉(TPP)作為“軟模板”模擬體內(nèi)非膠原蛋白DMP-1的N端和C端的隔離功能域，調(diào)控Ⅰ型膠原的礦化，構建了納米羥基磷灰石/膠原(n-HA/COL)復合支架材料。并以人臍帶間充質(zhì)干細胞hUMSCs作為種子細胞，探究了其對細胞的粘附、增殖、分化的影響。結果表明，膠原纖維組織與礦化同步進行，陳化處理有利于羥基磷灰石(HAp)晶體的結晶。自組裝HAp納米微粒不僅在膠原纖維外部沉積，也可以在原膠原分子上及膠原微纖維的末端被發(fā)現(xiàn)，同時納米磷酸鈣鹽沿著膠原微纖維的圓柱形表面分布。細胞培養(yǎng)表明n-HA/COL并沒有明顯促進hUMSCs細胞的增殖，但能夠誘導hUMSCs向成骨細胞分化，促進成骨細胞AKP的表達，并且n-HA/COL復合支架材料與成骨誘導液(OICM)聯(lián)用時誘導效果更加顯著。這種以“bottom-up”深度礦化方法為骨支架材料的制備提供了新思路，n-HAp/collagen復合材料有望用于骨組織填充修復。

關鍵詞：膠原；礦化；聚丙烯酸；三聚磷酸鈉

0引言

Ⅰ型膠原是結締組織中極其重要的結構蛋白質(zhì)，因而廣泛應用于生物材料領域。膠原蛋白作為“硬模板”有機基底礦化生成羥基磷灰石的過程并不是簡單的物理沉積。礦化過程中確實存在著—COO…Ca的配位螯合作用，膠原纖維上的—COOH是形成HAp主要的成核位點[1]。最近的研究表明，膠原纖維的礦化過程首先是形成納米級液相的無定形磷酸鈣(ACP)前驅(qū)體并進入膠原纖維的內(nèi)部[2]，然后ACP前驅(qū)體在膠原纖維內(nèi)部均相成核轉變成HAp[3]，但膠原纖維自身并不能克服均相成核中的熱力學壁壘障礙[4]以誘導成核。磷蛋白如DMP-1、骨涎蛋白等酸性非膠原蛋白可以通過動力學驅(qū)動均相成核，一方面可以作為隔離基元使ACP形成穩(wěn)定的納米前驅(qū)體；另一方面也可以作為模板基元來啟動HAp的成核及分自組裝[5-6]。但這些非膠原體外活性低，價格昂貴，無法廣泛應用于骨組織工程。

聚陰離子電解質(zhì)可以在膠原的仿生礦化中用來模擬這些非膠原蛋白的功能基元，多元羧酸如聚丙烯酸和聚天冬氨酸等常被用作模仿這些基質(zhì)蛋白的隔離基元功能的仿生類似物[7]。比如，低分子量的聚丙烯酸可以用來模擬DMP-1蛋白的N端片段的隔離基元。這些聚陰離子電介質(zhì)可以包裹Ca2+、PO43-形成穩(wěn)定的納米級液相ACP前驅(qū)體，并通過毛細管作用滲入膠原纖維的孔區(qū)和原纖維縫隙間，進而在膠原纖維內(nèi)部結晶形成Hap，整個礦化過程符合聚合物誘導液相前驅(qū)體機理(PILP)[6，8]。無機小分子的聚磷酸鹽如三偏磷酸鈉(STMP)和三聚磷酸鈉(TPP)等在仿生礦化中起到重要作用。它們可以模擬DMP-1蛋白帶負電荷的C端片段的模板功能基元，在膠原纖維內(nèi)部為Ca2+提供負電荷螯合位點[9]。

本文擬采用pH值=7.4的溶膠-凝膠體系中，加入β-甘油磷酸鈉這種可促進礦化的活性小分子作為礦化的磷源，且引入低分子量的聚丙烯酸作為隔離功能基元，三聚磷酸鈉作為模板功能基元，兩者作為“軟模板”模擬非膠原蛋白的功能域來調(diào)控I型膠原的仿生礦化，制備新型的骨組織工程支架材料。

1實驗

1.1材料和儀器

β-甘油磷酸鈉(β-GP，Sigma-Aldrich)，三聚磷酸鈉(TPP，Sigma-Aldrich)和聚丙烯酸(PAA，MW為1 800 Da，Sigma-Aldrich)，氯化鈣(廣州化學試劑廠，AR)，鼠尾Ⅰ型膠原(鼠尾腱Ⅰ型膠原，暨南大學生物材料實驗室)。實驗中其它試劑均為分析純。X射線衍射儀(XRD，MSAL XD-2X，中國布萊格)超高分辨率場發(fā)射掃描電鏡(FESEM，Nova NanoSEM430，荷蘭FEI公司)，高分辨率透射電子顯微鏡(HRTEM，JEM-2100F，日本 JEOL)。

1.2實驗方法

1.2.1“軟模板”調(diào)控仿生礦化I型膠原纖維

將鼠尾I型膠原溶解于10 mmol/L HCl溶液中，待膠原完全溶解后，緩慢加入96 mmol/L CaCl2。待溶液完全澄清后，邊攪拌邊用氨氣熏蒸至略顯乳白色，此時測得溶液pH值約為7.0。 將與HCl等量的25 mmol/L Tris-HCl buffer分成兩份，一份加入TPP，待完全溶解后，加入膠原CaCl2溶液中，靜置5～10 min；另一份加入PAA和β-GP，完全溶解后，迅速加入膠原CaCl2-TPP混合溶液中，最終溶液中各組分濃度為膠原5 mg/mL，CaCl248 mmol/L，β-GP 28.8 mmol/L，TPP 0.5%(質(zhì)量分數(shù))，PA 1 mg/mL。此過程中制備4組不同的樣品相互對照。(1) 空白對照組：不加入TPP和PAA；(2) 模板功能調(diào)控組：加入TPP，不加入PAA；(3) 隔離功能調(diào)控組：加入PAA，不加入TPP；(4) 模板-隔離雙調(diào)控組：同時加入TPP和PAA。

攪拌2 min后，放入37 ℃恒溫水浴箱中陳化0.5～24 h。樣品呈乳白色凝膠狀，用三蒸水洗滌3次以上，-80 ℃預冷后冷凍干燥，得到磷酸鈣/膠原復合支架材料。

1.2.2無機晶相組成分析

取部分支架材料擠壓成膜后，用X射線衍射法(XRD)測定樣品的晶相組成，測試條件為電壓36 kV，管流20 mA，CuKα靶，掃描范圍(2θ)5～80°，掃描速度8°/min。

1.2.3FESEM微觀形貌觀察及能譜儀(EDS)元素分析

取經(jīng)冷凍干燥后的多孔支架材料樣品，經(jīng)噴金處理后，置于超高分辨率場發(fā)射掃描電鏡(FESEM，工作電壓3.0～5.0 kV)下觀察其顯微形貌，并用聯(lián)用的能譜儀對材料微區(qū)成分元素種類與含量進行分析。

1.2.4HRTEM微觀形貌觀察及選區(qū)電子衍射(SAED)晶相分析

將樣品用環(huán)氧樹脂固化包埋后，超薄切片，充分分散并沉積到銅網(wǎng)上，置于高分辨率透射電子顯微鏡(HRTEM，工作電壓100 kV)下觀察其顯微結構，并利用傅里葉變換選區(qū)電子衍射(SAED)對無機相進行晶相分析。

1.2.5細胞培養(yǎng)

選取模板-隔離基元雙調(diào)控并陳化24 h的n-HA/COL復合支架作為種子細胞的支架材料。將經(jīng)過鈷60(輻照強度為5 kgy)滅菌的?10 mm×8 mm n-HA/COL復合支架置于24孔培養(yǎng)板中，無菌PBS沖洗3次，用含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液浸泡過夜。取傳至第5代的人臍帶干細胞(hUMSCs)，0.25%的胰酶消化3～5 min后用培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心5 min收集，培養(yǎng)液吹散成細胞懸液，倒置顯微鏡下血球計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整細胞密度為4.15×105個/mL，向每個支架及空白對照孔滴加100 μL細胞懸液。在CO2為0.5%，37 ℃條件下培養(yǎng)3 h細胞貼壁后，將支架孔及對照孔分為4組，分別為A組：對照組(加普通培養(yǎng)液培養(yǎng))；B組：成骨劑誘導組(加成骨誘導培養(yǎng)液(osteoblast inducing conditional media，OICM)培養(yǎng))；C組：支架材料組(加普通培養(yǎng)液培養(yǎng))；D組：聯(lián)合培養(yǎng)組(同時使用支架材料和成骨誘導液培養(yǎng))。向各孔小心加入1 mL 培養(yǎng)液，每兩天PBS清洗并換液1次。

1.2.6細胞粘附率統(tǒng)計

(1)1.2.7MTT法細胞活性檢測

在第1，3，5和7 d，每天各從A、B、C、D組中取3孔樣品作為測定孔，將原有培養(yǎng)液吸除后PBS吹洗3次，向測定孔及背景孔加入80 μL 5 mg/mL的MTT，再加入1 mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸除廢液，并向各孔加入400 μL 三聯(lián)液(10%SDS-5%異丙醇-12 mmol/L HCl)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后快速震蕩5 min后將各孔中的溶液分別轉移到96孔培養(yǎng)板中，每孔180 μL，用酶標儀在492 nm波長處測定其光吸收值(OD值)，計算相對細胞活性

1.2.8堿性磷酸酶活性測定

第7，14和21 d時，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入1%的Triton X-100 PBS溶液常溫下裂解30～40 min，將細胞裂解液轉移至96孔培養(yǎng)板中，根據(jù)AKP測定試劑盒的說明，定義每克蛋白37 ℃下與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位，并按照說明書的方法測定各孔液體在492 nm波長的吸光度值(OD)。同時按照BCA試劑盒說明繪制標準曲線并測定各孔細胞裂解液在570 nm波長的吸光度值(OD)，并計算出相應的蛋白質(zhì)濃度。最后計算出每單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中堿性磷酸酶的活性。

1.2.9統(tǒng)計學分析

對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)表示為mean±SD，采用SPSS16.0(SPSS，Chicago)分析軟件的獨立樣品方差分析進行分析。P≤0.05時認為有統(tǒng)計學差異，P≤0.01時認為有顯著性差異。

2結果與討論

2.1仿生礦化支架無機晶相組成分析

圖1為37 ℃陳化0.5h后各組樣品膠原纖維表面礦物的XRD譜圖。從圖1((b)-(e))衍射峰位置與標準的HAp衍射峰位置相比基本一致可知，體系在很短的時間內(nèi)就生成了磷酸鈣鹽的晶體，無論是否加入軟模板調(diào)控礦化，各樣品中無機鹽的組成都是基本相同的，呈現(xiàn)出非典型的HAp衍射峰，沒有出現(xiàn)其它磷酸鈣鹽或者非鈣磷鹽雜質(zhì)，說明膠原具有比較好的誘導HAp生成的能力。此外，圖1(b)-(e)與(a)標準的HAp衍射峰相對比，各自的HAp的三強主基衍射峰(約32°，對應HAp的(211)、(112)、(300)晶面)仍出現(xiàn)明顯的衍射峰銳化現(xiàn)象，同時在46°附近的衍射峰(對應HAp的(222)晶面)明顯尖銳，但在26°附近的HAp特征衍射峰(對應HAp的(002)晶面)不明顯，且(圖1(b)、(c)、(d))三者相比幾乎無明顯差異，說明HAp的晶體受“硬模板”膠原的影響主要沿(211)和(222)面生長[10]，生成的HAp處于一種非典型的結晶或者由無定形磷酸鈣(ACP)向HAp晶體過渡的狀態(tài)。

圖1　37 ℃陳化0.5 h后各組樣品XRD譜圖

Fig1XRDpatternsofthesamplesafterageingfor0.5hat37 ℃

2.2陳化時間對無機晶相的影響

由圖2((b)-(d))可知，在模板-隔離雙調(diào)控組中，隨著陳化時間的延長，26°附近的HAp特征衍射峰(對應HAp的(002)晶面)逐漸顯露出來，但更為明顯的是，三強主基峰及46°附近的衍射峰(對應HAp的(222)晶面)峰強明顯在增大，說明軟模板調(diào)控膠原礦化的過程中，HAp在自組裝過程中更傾向于在(211)和(222)上生長，表現(xiàn)出非典型的結晶途徑。

圖2雙調(diào)控組37℃陳化不同時間后樣品XRD譜圖

Fig 2 XRD patterns of templating-sequestration samples after aging for different time at 37 ℃

2.3FESEM微觀結構觀察及EDS元素分析

圖3為37 ℃陳化0.5 h后4組樣品的膠原支架內(nèi)橫截面掃描電鏡圖片。4組樣品膠原纖維表面均沉積了大量的尺寸在100～200 nm之間的磷酸鈣鹽，多為無定形態(tài)、不規(guī)則的片狀或者球狀晶體，這與XRD結果相吻合，晶體相互交疊堆垛，呈現(xiàn)出不完全結晶的形態(tài)。圖3(a)表明，當體系中不存在具有隔離和模板功能的軟模板調(diào)控礦化時，生成的磷酸鈣鹽形貌雜亂無章，有些部分已經(jīng)開始融合。圖3(b)顯示，只加入TPP調(diào)控而無聚丙烯酸時，大量片狀或球狀晶體附著在膠原纖維外表面。這是因為在礦化初始階段，由于缺乏隔離功能基元來調(diào)控穩(wěn)定納米ACP前驅(qū)體，導致反應溶液中已經(jīng)形成了尺寸較大的無定形磷酸鈣，大于膠原纖維的周期橫紋間距約為67 nm，無法進入膠原纖維內(nèi)部從而在膠原纖維外表面無規(guī)隨機的吸附沉積成球晶[11]。膠原纖維外表面被這些球晶覆蓋，因此無法觀察到膠原內(nèi)部的礦化情況。圖3(c)表明，當只加入聚丙烯酸調(diào)控礦化而沒有加入TPP時，除了在膠原纖維外部有大量弱結晶的磷酸鈣鹽以外，更為重要的是，發(fā)現(xiàn)膠原纖維內(nèi)部也有發(fā)生類似礦化過程的傾向，如圖3(c)兩黑線間所示，根據(jù)材料表面特征推測，膠原纖維內(nèi)部很有可能被大量的磷酸鈣鹽填充，由此推斷，在聚丙烯酸的隔離功能基元作用下，Ca2+和PO43-形成穩(wěn)定的納米無定形前驅(qū)體小液滴，能夠順利進入膠原纖維的孔區(qū)并進一步結晶生成HAp。但接下來的礦化過程由于缺乏模板調(diào)控限制了HAp的分級自組裝，從而導致產(chǎn)生了相互交疊，以致于掩蓋了膠原纖維的周期性結構[6]。圖3(d)顯示出，當加入聚丙烯酸作為隔離調(diào)控基元，TPP作為模板調(diào)控基元，在膠原纖維外部發(fā)生了可控的礦化過程，此外，兩黑線間為明亮區(qū)域，相距大約60 nm，應為HAp在膠原纖維的孔區(qū)形成，由此推測出，在聚丙烯酸的隔離調(diào)控下，納米無定形前驅(qū)體小液滴通過孔區(qū)進入了膠原纖維內(nèi)，并在TPP的模板調(diào)控下進一步發(fā)生了HAp的分級自組裝，從而形成了周期性的礦化膠原纖維結構。從圖3(c)、(d)發(fā)現(xiàn)膠原纖維束的長度>1 μm，直徑約為300 nm左右。整個調(diào)控礦化過程符合PILP理論。

圖3　37 ℃陳化0.5 h后各組樣品FESEM譜圖

從圖4(a)模板-隔離雙調(diào)控組37 ℃陳化0.5 h后SEM照片的黑色方框區(qū)域的選區(qū)能譜散射分析(EDS)可知，Ca/P=1.19，而標準HAp的Ca/P=1.67，可以認為膠原纖維外表面上除了生成大量的HAp晶體外，還存在ACP和很少量其它的鈣磷鹽[12]。

圖4雙調(diào)控組37 ℃陳化不同時間后樣品SEM & EDS照片

Fig 4 SEM & EDS images of the templating-sequestration samples after aged for different time at 37 ℃

從圖4(b)可知，隨著陳化時間的延長，ACP和其它鈣磷鹽向HAp晶體轉變并長大，陳化24 h后，形成尺寸在1 μm左右的不規(guī)則片晶或球晶，這與XRD顯示的晶體優(yōu)先沿(211)和(222)生長的結果相一致。從圖4(b)中黑色方框區(qū)域內(nèi)的EDS可知，Ca/P=1.30，接近于HAp的Ca/P=1.67。

2.4HRTEM與SAED分析

HRTEM可以更加直接地研究膠原纖維與形成的晶體間的相互關系。必須要說明的是制樣過程中破壞了膠原纖維的結構，僅可以觀察到原膠原分子及膠原微纖維。圖5(a)顯示出膠原纖維的外表面沉積著幾十納米尺寸的HA晶粒。圖5(c)為(b)圖中方框區(qū)域內(nèi)的放大圖像。在圖5(b)中，黑色長箭頭線表示出膠原微纖維的縱向[13]。自組裝HA納米微粒不僅在膠原纖維外部沉積，也可以在原膠原分子上及膠原微纖維的末端被發(fā)現(xiàn)[10](如圖5(b)、(c)黑色短箭頭線所示)，同時納米ACP也沿著膠原微纖維的圓柱形表面分布[14](如圖5(b)、(c)黑色短箭頭線所示)。圖5(c)黑色長箭頭線顯示的是原膠原纖維的縱向，之間的距離約為1.3 nm，這與報道的膠原分子直徑數(shù)據(jù)相一致。圖5(d)為(c)區(qū)域的傅利葉變換選區(qū)電子衍射圖像。電子衍射圖像呈不連續(xù)的圓弧狀，說明生成的HA為多晶體，同時也存在無定形態(tài)。根據(jù)計算由內(nèi)向外，各圓弧分別對應HA的(002)、(211)和(222)晶面，此結果與XRD的結果互相吻合。根據(jù)Kikuchi等[15]的研究結果，HA及膠原纖維自組裝的程度可以根據(jù)膠原纖維的長度及HA(002)晶面對應的電子衍射弧的弧長來判斷， 本文中自組裝的程度比較好。

圖5　雙調(diào)控組37 ℃陳化24 h后樣品HRTEM & SAED照片

2.5細胞粘附率

如表1所示，hUMSCs細胞在n-HA/COL復合支架組和聯(lián)合培養(yǎng)組支架上的粘附率分別為(89.64±1.21)%，(93.73±1.69)%。兩種支架的粘附率都非常高，這是因為材料的吸水性較好，細胞懸液迅速被支架吸收，同時復合支架材料上連通的拓撲孔洞較為規(guī)整，更加有利于細胞的粘附和伸展，在一定程度上提高了細胞的粘附率。

表1hUMSCs在n-HA/COL復合支架上的粘附率

Table 1 The adherence ration of hUMSCs on the n-HA/COL composite scaffolds

SampleSeededcells/×104Unattachedcells/×103Celladhesionrate/%支架材料組4.154.3±0.589.64±1.21聯(lián)合培養(yǎng)組4.152.6±0.793.73±1.69

2.6MTT法相對細胞活性統(tǒng)計分析

圖6顯示的是MTT法檢測相對細胞活性統(tǒng)計分析結果。與對照組相較，第1 d時，C、D組的相對細胞活性在78%～84%之間，這是因為支架孔里的細胞有一些沒有貼壁以及濕態(tài)的支架降低了MTT的濃度導致反應不完全等原因造成的。根據(jù)柱形圖的趨勢可以發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，不論是成骨劑誘導組(B組)，支架材料組(C組)還是聯(lián)合培養(yǎng)組(D組)，各組的相對細胞活性與對照組相比均沒有明顯提高，表明細胞增殖速度也沒有明顯的提高，說明n-HA/COL復合支架及成骨誘導液并沒有明顯促進hUMSCs細胞的增殖，但也沒有抑制細胞的生長。本文結果具有顯著的統(tǒng)計學意義。在圖6中B、C和D與A組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖6MTT法檢測n-HA/COL及成骨誘導劑培養(yǎng)細胞的相對細胞活性

Fig 6 The relative cell viability of the cells on the n-HA/COL scaffolds and OICM with MTT

2.7堿性磷酸酶活性

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)是分化成骨細胞過程中的早期標志物，也是細胞外基質(zhì)成熟的標志，是成骨細胞的催化劑，能促進骨基質(zhì)的礦化。從圖7可知，在第7，14，21 d時，n-HA/COL復合支架材料誘導組(C組)及與成骨誘導液聯(lián)用的聯(lián)合誘導組(D組)中，AKP活性明顯高于空白對照組。隨著培養(yǎng)時間的延長，各組中AKP活性都有不同程度的提高；更為明顯的是，隨時間延長，含有復合支架的實驗組(C和D組)中AKP活性的提高速度明顯加快，而且聯(lián)合誘導組(D組)更勝于復合支架誘導組(C組)，與空白對照組相比具有統(tǒng)計學顯著性差異。這說明n-HA/COL復合支架材料能夠誘導hUMSCs向成骨細胞分化，促進成骨細胞AKP的表達，并且n-HA/COL復合支架材料與成骨誘導液聯(lián)用時誘導效果更加顯著。在圖7中B、C和D與A組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖7n-HA/COL及成骨誘導劑培養(yǎng)細胞7，14，21 d后的堿性磷酸酶活性

Fig 7 The AKP activity of the cells on the n-HA/COL scaffolds and OICM after 7，14，21d

3結論

pH值=7.4的膠原溶膠-凝膠體系中，以TPP和PAA雙調(diào)控“軟模板”來調(diào)控I型膠原的仿生礦化。 PAA作為隔離功能基元可以在礦化的初始階段調(diào)控形成穩(wěn)定的納米ACP前驅(qū)體小液滴，從而進入膠原纖維內(nèi)部，此過程符合PILP理論；TPP作為模板功能基元可以調(diào)控膠原纖維內(nèi)部的HAp的自組裝，從而在纖維內(nèi)部形成納米晶粒，并使膠原纖維產(chǎn)生周期性的明暗條紋。細胞培養(yǎng)表明hUMSCs在n-HA/COL復合支架組和聯(lián)合培養(yǎng)組支架上的生長狀態(tài)良好且AKP活性明顯高于對照組和OICM組,顯示出了較為顯著的成骨誘導性。因此，這種以“bottom-up”方式仿生構建的n-HA/COL復合材料有望用于骨組織修復材料[16]。

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Biomimetic mineralization of collagen fibers regulated with “soft template”

LI Na，LUO Xueshi， YE Bihua， LI Zhiwen，WU Di, LI Lihua， LI Hong， ZHOU Changren

(Department of Material Science and Engineering, Engineering Research Center of Artificial Organs and Materials, Jinan University, Guangzhou 510632,China)

Abstract:In this paper, polyacrylic acid (PAA) and sodium tripolyphosphate (TPP) were applied as “soft template” which simulated respectively as the N- and C-terminal domains of the non-collageneous proteins DMP-1 in vivo to control the mineralization process of type Ⅰ collagen. Experimental pH was settled at 7.4 and β sodium glycerophospate was applied as the phosphorus scource. Nano-hydrixyapatite (HAp)/collagen scaffold (n-HA/COL) was fabricated in this experiment. In addition，human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUMSCs) were selected to study the effects of the materials on the cell adhesion, proliferation, and differentiation. Results showed that self-organization and minimization of the collagen fibers were simultaneous. The aging process contributed to the growth of HAp. Self-assembled HAp nanoparticles depositedboth on the external collagen fibres and the terminal of microfibrils. Nano-calcium phosphate crystals were distributed along the cylindrical surface of the collagen microfibrils. Cell culture showed that n-HA/COL did not significantly promote the proliferation of hUMSCs cells but can induce osteoblast differentiation and to promote AKP expression. Also, the osteogenic effect was more significant when n-HA/COL combined with OICM. This “bottom-up” method of deep mineralization provides a novel approach for preparation of bone compositescaffolds, and the n-HAp/collagen composite is expected to be used for bone repairing and regeneration.

Key words:collagen； mineralization； polyacrylic acid； tripolyphosphate

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.03.024

文獻標識碼：A

中圖分類號：Q81

作者簡介：李娜(1988-)，女，山東德州人，在讀碩士，師承李立華教授，從事生物材料研究。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31270021)；廣東省優(yōu)秀博士論文資助項目(sybzzxm201121)；廣東省醫(yī)學基金資助項目(A2013334)

文章編號：1001-9731(2016)03-03129-07

收到初稿日期：2015-03-24 收到修改稿日期：2015-10-27 通訊作者：李立華，E-mail: tlihuali@jnu.edu.cn