渠　清，夏云敏，王茁然，金　禮，張　玫，李王強，李　雪，楊艷彬，吳彩蘭，姬　華

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子　832000；2.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護系，新疆石河子　832000）

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多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌在羊肉中生長動力學(xué)模型的建立

渠清1，夏云敏1，王茁然1，金禮1，張玫1，李王強1，李雪1，楊艷彬1，*吳彩蘭2，*姬華1

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護系，新疆石河子832000）

摘要：為探討食源性大腸桿菌的生長特性，通過建立多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌（Escherichia coli）在羊肉中的生長動力學(xué)模型，在10，15，20，25，35，37℃不同貯藏溫度下研究了多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌的生長模型。采用修正的Logistic方程擬合大腸桿菌的一級生長模型，在一級方程的基礎(chǔ)上建立了大腸桿菌的二級平方根方程，分析了大腸桿菌的生長參數(shù)。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；羊肉；預(yù)測模型

姬華（1980—），女，博士，副教授，研究方向為食品質(zhì)量與安全。

大腸桿菌（Escherichia coli）是人和溫血動物腸道重要的兼性厭氧寄居菌群，也是水源和食品糞便污染指示菌。大腸菌群數(shù)量的多少可以反映出食品是否被污染以及污染程度的高低，大腸桿菌也是良好的耐藥指示菌，對大腸桿菌耐藥性的研究可以指示本地區(qū)細菌的耐藥狀況和食品的衛(wèi)生情況。預(yù)測微生物學(xué)（Predictive microbiology）是建立在計算機基礎(chǔ)上對食品中微生物生長、殘存和死亡進行的數(shù)量化預(yù)測方法。新疆是我國五大牧區(qū)之一，羊肉產(chǎn)量及消費量較高，研究大腸桿菌在羊肉中生長動力學(xué)模型有利于為延長羊肉貨架期提供理論支持。國外大腸桿菌預(yù)測模型的研究主要集中在出血性大腸桿菌[1]，也有報道在蔬菜、魚片中建立大腸桿菌預(yù)測模型[2-4]，以及醋酸、乳酸對大腸桿菌的殺滅作用[5-6]；培養(yǎng)基添加谷氨酸和精氨酸對致病型和非致病型大腸桿菌的影響[7]。本文探討多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌在羊肉中的生長動力學(xué)模型。

1材料和方法

1.1材料

優(yōu)質(zhì)新鮮瘦羊肉，分別購于石河子市愛家超市與石河子市友好超市。

菌株：試驗選取2株大腸桿菌，分別為多重耐藥菌13z與藥物敏感菌16z（食品學(xué)院食品微生物實驗室保存）。其中，菌株13z為8重耐藥菌，分別對氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素、復(fù)方新諾明、紅霉素、阿莫西林、鏈霉素、萘啶酮酸產(chǎn)生耐藥性；菌株16z為敏感菌株，僅對頭孢他啶顯示中介，對氨芐西林、頭孢噻肟、慶大霉素、亞胺培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素、氯霉素、阿米卡星、哌拉西林、復(fù)方新諾明、紅霉素、阿莫西林、多黏菌素B、鏈霉素、萘啶酮酸等16種藥物均顯示敏感。判斷參照《抗微生物藥物敏感性實驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》第16版信息增刊提供的紙片法標(biāo)準(zhǔn)。

1.2試驗儀器和設(shè)備

DZLX- 40Ⅱ型自動滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；SPX- 250B- Z型生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；SW- CJ型超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.3培養(yǎng)基和試劑

LB培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；0.85％生理鹽水，自制。

1.4原菌液的制備

2株菌均保藏在- 20℃的甘油管中，在超凈工作臺中將2株菌分別接種到LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)，活化3次，用無菌棉簽蘸取適量菌落到生理鹽水中，參照麥?zhǔn)媳葷嵋旱臐舛?，于波長520 nm下的分光光度計上進行測量，待菌液吸光度與麥?zhǔn)媳葷嵋海?.5）吸光度大致相同即可，菌液濃度約為1.5×108CFU/mL。

1.5樣品處理

在超凈工作臺內(nèi)用酒精棉球擦拭整塊鮮肉表面2次，再用紫外線殺菌25 min（紫外燈30 W，距離520 mm）。用無菌手術(shù)刀剔除表面的肉，將內(nèi)部的肉分割成10 g（大小約2 cm×2 cm×2 cm）的肉樣，放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，將肉樣的兩面再用紫外線各殺菌25 min，取原肉10 g，用0.85％生理鹽水分別稀釋10倍、100倍，平板計數(shù)檢測原肉中的微生物，未發(fā)現(xiàn)微生物生長。

1.6接種菌株

接種前將已制備好的2株大腸桿菌菌液充分搖勻，使用無菌生理鹽水分別進行梯度稀釋，制備成菌量為1×103～1×104CFU/mL的菌懸液，無菌操作將10 g無菌肉片懸浮于菌液15 s進行接種，然后將肉塊取出放到無菌均質(zhì)袋中，分別放置于10，15，20，25，35，37℃條件下恒溫培養(yǎng)貯藏，每隔適當(dāng)時間取出肉樣進行大腸桿菌計數(shù)。

1.7肉樣貯藏與微生物計數(shù)

將盛有接種肉樣的均質(zhì)袋袋口密封，分別貯藏在10，15，20，25，35，37℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)。按時取出肉樣，用無菌剪刀剪碎，放入裝有90 mL無菌生理鹽水的均質(zhì)袋內(nèi)，使用均質(zhì)機充分拍打90 s，連續(xù)10倍稀釋均質(zhì)液，選取3個合適濃度的菌液，各吸取菌液100 μL涂布LB平板，每個稀釋梯度涂布2個平板，37℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)。參照國標(biāo)GB/T 4789.2—2012食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗-菌落總數(shù)測定用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)[8]。

2數(shù)學(xué)模型與模型驗證

2.1微生物生長動力學(xué)預(yù)測模型

在10，15，20，25，35，37℃條件下得到的耐藥性及藥物敏感性大腸桿菌試驗數(shù)據(jù)，分別采用修正的Logistic模型擬合其生長動態(tài)。修正的Logistic模型公式及式中參數(shù)所代表的意義如下：

式中：t——時間，h；

N（t）——t時的菌數(shù)，CFU/g；

N0，Nmax——初始與最大菌數(shù)，CFU/g；

μ——在λ0時間點時微生物生長的相對最大比生長速率，h-1；

λ0——微生物生長達到最大生長速率所需要的時間。

最大比生長速率μmax和延滯時間λ通過以下公式求出：

試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用Origin 8.0統(tǒng)計分析軟件，選取數(shù)學(xué)模型進行回歸分析。

2.2微生物生長動力學(xué)預(yù)測模型的驗證

均方誤差（Mean square error，MSE）、偏差因子（Bias factor，Bf）和準(zhǔn)確因子（Accuracy factor，Af）用來評價模型的預(yù)測效果。將實測值和預(yù)測值進行比較，根據(jù)二者的殘差計算偏差因子和準(zhǔn)確因子，均方誤差、偏差因子和準(zhǔn)確因子的計算公式如下：

2.3溫度對微生物生長影響動力學(xué)模型

溫度對耐藥性及藥物敏感性大腸桿菌生長影響的動力學(xué)模型由平方根模型[9]（即Belehradek方程[10-11]）描述：

式中：b——方程的常數(shù)；

T——攝氏溫度，℃；

Tmin——微生物生長的最低溫度，即在此溫度時最大生長比率為零。

3結(jié)果與分析

3.1不同貯藏溫度下多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌的一級動力模型

利用修正的Logistic方程擬合在10，15，20，25，35，37℃條件下大腸桿菌的生長數(shù)據(jù)，根據(jù)修正Logistic方程對大腸桿菌的生長曲線進行回歸。

多重耐藥菌株13z一級動力模型和相關(guān)系數(shù)見表1，藥物敏感菌株16z一級動力模型和相關(guān)系數(shù)見表2。

表1　多重耐藥菌株13z一級動力模型和相關(guān)系數(shù)

表2　藥物敏感菌株16z一級動力模型和相關(guān)系數(shù)

相關(guān)系數(shù)R2可以評估回歸方程對樣本數(shù)據(jù)擬合效果的好壞。R2值越接近1，表明估計的回歸方程對樣本數(shù)據(jù)的擬合效果越好；R2值越接近于0，表明方程擬合效果越差[12]。由表1、表2可知，修正的Logistic模型適合擬合大腸桿菌在羊肉中的生長狀況；從擬合效果可知，相關(guān)系數(shù)R2都在0.936 3以上，說明修正的Logistic模型能夠充分地預(yù)測10～37℃溫度范圍內(nèi)大腸桿菌在羊肉中的生長規(guī)律。

10℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線見圖1，15℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線見圖2，20℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線見圖3，25℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線見圖4，35℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線見圖5，37℃下大腸桿菌13z 與16z的一級生長模型曲線見圖6。

圖1　10℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線

圖2　15℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線

圖3　20℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線

圖4　25℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線

偏差因子衡量預(yù)測值是否過高或過低估計了實測值，表示模型的結(jié)構(gòu)偏差。準(zhǔn)確因子衡量預(yù)測值與實測值的平均誤差，該值等于1表明預(yù)測值與實測值完全吻合，預(yù)測很準(zhǔn)確。Ross建議病原性細菌Bf的范圍在0.90～1.05為最好；0.70～0.90或1.06～1.15能夠接受[13]；Bf＜0.70或者＞1.15不能接受。Lebert認為Bf不能提供全面的模型準(zhǔn)確性預(yù)測，Af顯示預(yù)測值與觀測值的接近程度，Af越接近1，模型越好[14]。MSE的值越小，說明模型表達試驗數(shù)據(jù)較充分。

圖5　35℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線

圖6　37℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線

多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z一級動力模型驗證（Logistic）見表3。

表3　多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z一級動力模型驗證（Logistic）

由表3可知，在多重耐藥菌株13z的一級動力模型中，20℃的Bf略高于1.15，Af偏差較大，故不能接受。在藥物敏感菌株16z的一級動力模型中，10℃的Bf，Af都偏高，不能接受。其余溫度下建立的一級動力模型Bf，Af，MSE都較好，表明預(yù)測值與實際值相似，擬合效果好[15]。

3.2多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌生長速率二級模型

多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z的生長參數(shù)見表4。

表4　多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z的生長參數(shù)

表4反映了在修正Logistic模型的基礎(chǔ)上，計算出不同貯藏溫度條件下大腸桿菌的最大比生長速率。由表4可知，隨著貯藏溫度的升高，2株大腸桿菌生長速率總體呈上升趨勢；而當(dāng)貯藏溫度降到20℃以下時，生長速率較小，因此適當(dāng)降低貯藏溫度可以有效防止大腸桿菌的生長繁殖；當(dāng)貯藏溫度為37℃時，最大比生長速率最大，因此羊肉中大腸桿菌最適生長溫度為37℃。10℃和15℃，多重耐藥菌株13z的生長速率高于藥物敏感菌株16z生長速率。20～37℃，羊肉中藥物敏感菌株16z的生長速率更快。

貯藏溫度對微生物的生長動力學(xué)影響需要用二級方程平方根方程進行描述。

多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z的平方根二級方程及相關(guān)系數(shù)見表5，多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z平方根二級方程驗證見表6，多重耐藥菌株13z的平方根二級方程見圖7，藥物敏感菌株16z的平方根二級方程見圖8。

表5　多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z的平方根二級方程及相關(guān)系數(shù)

表6　多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z平方根二級方程驗證

圖7　多重耐藥菌株13z的平方根二級方程

圖8　藥物敏感菌株16z的平方根二級方程

觀察表6，多重耐藥菌株和藥物敏感菌株平方根二級方程的Bf在0.99～1.02，準(zhǔn)確因子較接近與1，表示誤差較低，說明建立的修正Logistic模型和平方根模型能夠很好地預(yù)測大腸桿菌10～37℃下在羊肉中的生長動態(tài)。

4結(jié)論與討論

利用修正的Logistic方程，建立了10，15，20，25，35，37℃條件下多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌在羊肉中的生長曲線。結(jié)果表明，隨著貯藏溫度的升高，生長速率總體呈上升趨勢。在10～20℃時，2株大腸桿菌生長較緩慢，μmax值較低；隨著貯藏溫度升高，μmax逐漸增大，在37℃時羊肉中大腸桿菌生長速率最高。試驗中計算的準(zhǔn)確因子和偏差因子接近1，修正Logistic模型能夠較好地預(yù)測10～37℃貯藏溫度下多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌在羊肉中的生長動態(tài)。

各貯藏溫度下多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z生長曲線對比圖可知，在貯藏溫度為15℃時，多重耐藥菌株13z的平均生長速率大于藥物敏感菌株16z；20℃下2種菌株的平均生長速率基本持平；而在溫度為25～37℃時，藥物敏感菌株16z的生長曲線較多重耐藥菌株13z更趨向于S型。

本文應(yīng)用平方根方程建立了羊肉中多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌隨貯藏溫度變化的動力學(xué)模型——最大比生長速率的預(yù)測模型，得出2種菌株在羊肉中的最大比生長速率都隨貯藏溫度的上升逐漸增大、貯藏溫度與最大比生長速率的平方根線性相關(guān)的結(jié)論。

國外有大量在食品或營養(yǎng)肉湯中建立大腸桿菌生長模型的試驗。Jun Wang等人[16]研究生菜中大腸桿菌O157 : H7對比不同相對濕度與溫度的生長情況，發(fā)現(xiàn)溫度的升高比相對濕度的變化對大腸桿菌O157 : H7在生菜中的生長更有影響力。Lindqvist R等人[17]研究香腸中大腸桿菌的生長情況，發(fā)現(xiàn)在適宜條件下菌株之間的差異可以忽略不計；而在不利條件下，不同產(chǎn)毒菌株增長速率差異較大。在本研究中，羊肉中多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌的生長速率大致相同。

除研究大腸桿菌在羊肉中的生長預(yù)測模型外，為探究同一菌種不同菌株生長預(yù)測模型在同種培養(yǎng)介質(zhì)中的差別，本文利用了實驗室篩選的多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z進行了對比試驗。微生物預(yù)測模型已有報道，但大多都是單一類型菌種預(yù)測模型的研究。隨著抗生素使用量的增大，研究多重耐藥菌株和藥物敏感菌株的生長特性，具有一定的研究價值[18]。

食品中不可能只存在單一類型的微生物拓展，除研究單一菌種生長預(yù)測模型外應(yīng)考慮到食品中微生物的多樣性、各菌種間相互作用，研究2種或多種微生物共同在某類食品中的生長預(yù)測模型，大腸桿菌與其他微生物的相互作用有待進一步研究。

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Study on the Growth Predictive Models of Multidrug- resistant and Drug- sensitive Escherichia coli in Mutton

QU Qing1，XIA Yunmin1，WANG Zhuoran1，JIN Li1，ZHANG Mei1，LI Wangqiang1，LI Xue1，YANG Yanbin1，*WU Cailan2，*JI Hua1
（1. College of Food Science and Technology，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000，China；2. Department of Plant Protection，Agricultural College of Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000，China）

Abstract：The growth characteristics of foodborne Escherichina coli is studied in this paper. The growth kinetic model of drug resistance and sensitivity E.coli in mutton are established in this research. The growth model of multiple drug resistance and sensitivity strains are studied at 10，15，20，25，35，37℃. The Escherichina coli primary growth equation is fitted by the modified Logistic equation，then the secondary square root equation is established on the basis of primary growth equation. The growth parameters of Escherichina coli are also analyzed.

Key words：Escherichina coli；mutton；predictive model

*通訊作者：吳彩蘭（1979—），女，在讀博士，講師，研究方向為微生物學(xué)教學(xué)科研。

作者簡介：渠清（1994—），女，本科，研究方向為食品質(zhì)量與安全。

基金項目：石河子大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練計劃（SRP2014187）；國家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（201510759029）；國家自然科學(xué)基金項目（31301469）；石河子大學(xué)高層次人才啟動項目（RCZX201225）；石河子大學(xué)“3152”青年骨干教師項目（3152SPXY02033）；石河子大學(xué)教育教學(xué)改革項目（KG- 2013- 32）。

收稿日期：2015- 12- 02

文章編號：1671- 9646（2016）03a- 0001- 05

中圖分類號：R155.5

文獻標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.001