萬(wàn)亞菲（江蘇省連云港市中醫(yī)院　連云港　222000）

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紅花多糖對(duì)H22荷瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化功能的影響

萬(wàn)亞菲（江蘇省連云港市中醫(yī)院連云港222000）

摘要：目的：探討紅花多糖的抗腫瘤作用及其機(jī)制。方法：采用移植H22荷瘤小鼠模型，分別設(shè)置陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和紅花多糖低、中、高三個(gè)劑量組（15mg/kg、45mg/kg和135mg/kg），對(duì)模型小鼠進(jìn)行效果處理，觀察各組的抑瘤效果、碳廓清能力、耳腫脹度，并對(duì)血清GR、GSH-PX、CAT、SOD和MDA含量等進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：紅花多糖高劑量可明顯抑制小鼠H22實(shí)體瘤生長(zhǎng)（P＜0.05），抑瘤率為66.8%；高劑量組小鼠血清MDA水平明顯降低（P＜0.05），GR、GSH-PX、CAT、SOD活性較陰性對(duì)照組明顯升高，還可降低腫瘤細(xì)胞中ROS水平（P＜0.05）。結(jié)論：紅花多糖可明顯增強(qiáng)H22荷瘤小鼠的免疫功能，清除自由基、減輕活性氧造成的損傷，從而起到抗腫瘤的作用。

關(guān)鍵詞：紅花多糖H22荷瘤免疫調(diào)節(jié)抗氧化

紅花又稱為草紅花、紅藍(lán)花，為菊科植物紅花（Carthamus tinctorius L）的干燥花。紅花性溫、味辛，具有活血通經(jīng)和散瘀止痛之效，其藥用始載于《開寶本草》，至今各版藥典均有收載[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[2～3]，紅花中的主要成分包括紅花多糖、紅花黃色素、紅花苷、黃酮類、有機(jī)酸以及紅花紅色素等，具有抗氧化、抗凝血、降血壓以及抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性。另外，紅花在我國(guó)各省市、自治區(qū)均有種植，資源豐富，具有藥理毒性低、易于工業(yè)化制備和生產(chǎn)等特點(diǎn)。近年來人們對(duì)于紅花的藥用價(jià)值尤其是在抗腫瘤等方面的作用的研究越來越深入。在本文中，我們從分子藥理學(xué)角度對(duì)紅花多糖對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及可能的機(jī)制進(jìn)行研究，現(xiàn)將相關(guān)結(jié)果總結(jié)和報(bào)道如下：

1　材料和儀器

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)昆明種小鼠50只，雌雄各半，體重18～22g，購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境，恒溫22℃～25℃，（恒濕55±5）%，所有食物與水經(jīng)滅菌處理后使用。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料和儀器：H22荷瘤細(xì)胞由江蘇省中醫(yī)院臨床研究所提供；環(huán)磷酰胺購(gòu)自浙江海正藥業(yè)有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛試劑盒以及2’，7’-一二氯氫化熒光素二脂探針均購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)儀、培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.1.3藥物：紅花多糖為本單位通過水提醇沉法粗提并經(jīng)凍融除雜，再經(jīng)無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚脫化后精制所得，為淡黃色粉末，純度為76.8%，批號(hào)為20140301。

1.2實(shí)驗(yàn)方法：將50只小鼠隨機(jī)分為5組，分別為：陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，紅花多糖低、中、高劑量組，每組10只。在無(wú)菌環(huán)境下，取H22荷瘤細(xì)胞，以D-Hanks液稀釋成107/mL濃度的瘤細(xì)胞液，于每只小鼠右前肢腋部皮下注射0.1mL瘤細(xì)胞液。陰性對(duì)照組灌服0.9% Nacl溶液，10mL/kg；陽(yáng)性對(duì)照組以環(huán)磷酰胺25mg/kg腹腔注射；紅花多糖給藥組，分別以低、中、高劑量（15mg/kg、45mg/kg和135mg/kg）灌服，給藥頻次均為1次/d。

1.2.1抑瘤作用：荷瘤細(xì)胞接種成功的標(biāo)志為接種5d后，陰性對(duì)照組80%的小鼠于腋下長(zhǎng)出腫瘤，各組于接種d16后處死動(dòng)物，對(duì)動(dòng)物體重及腫瘤進(jìn)行稱重，腫瘤的抑制率=（C-T）/C× 100%，其中C味陰性組腫瘤的平均重量，T為各給藥組腫瘤的平均重量。

1.2.2碳廓清能力測(cè)定：于末次給藥后，給小鼠尾靜脈注射印度墨汁（0.1mL/10g），注射后即刻開始計(jì)時(shí)，分別于注射后2min和10min于眼底靜脈叢取血，迅速以0.1%碳酸鈉溶液稀釋并搖勻，以酶標(biāo)儀測(cè)定各組樣品的OD值。碳廓清指數(shù)K=（logOD1-logOD2）/（T10-T2），OD1和OD2分別為注射印度墨汁后2min 和10min的OD值。

1.2.3遲發(fā)型超敏反應(yīng)耳腫脹度的測(cè)定：每只小鼠腹部以硫酸鋇溶液去毛后，以含二硝基氯苯的丙酮橄欖油溶液涂抹腹部致敏，致敏后d7，于右耳內(nèi)外兩面均勻涂抹10μL溶液進(jìn)行攻擊，24h后將小鼠處死，以打孔器分別于左右耳取直徑7mm的耳片，左右耳片的重量差即為耳腫脹度。

1.2.4抗氧化酶的測(cè)定：小鼠于末次給藥后眼球取血，血樣靜置1h后于室溫下以3000rpm離心5min，將血清分離后按照試劑盒中的操作步驟對(duì)GR、GSH-PX、CAT、SOD和MDA等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)；腫瘤細(xì)胞中活性氧（ROS）采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525nm。

2　結(jié)果

2.1抑瘤作用：研究結(jié)果顯示，紅花多糖高劑量（135mg/kg）可明顯抑制小鼠H22實(shí)體瘤生長(zhǎng)，抑瘤率為66.8%，與環(huán)磷酰胺作用相當(dāng)，與其余各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

表1　紅花多糖對(duì)H22實(shí)體瘤的抑制作用（n=10，±s）

表1　紅花多糖對(duì)H22實(shí)體瘤的抑制作用（n=10，±s）

*表示與高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

組別　　劑量（mg/kg）　　腫瘤重量（g）　　抑瘤率（%）陰性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組低劑量中劑量高劑量-2.23±0.64*0.69±0.31 1.73±0.24*1.30±0.53*0.74±0.47 -25 15 45 135 69.1 22.4*41.7*66.8

2.2免疫調(diào)節(jié)作用及對(duì)腫瘤細(xì)胞ROS的影響：高劑量組小鼠腫瘤細(xì)胞中ROS的含量明顯低于陰性對(duì)照組和其余劑量組，碳廓清能力以及對(duì)耳廓腫脹的抑制明顯優(yōu)于其余各劑量組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表2。

表2　紅花多糖的免疫調(diào)節(jié)作用及對(duì)腫瘤細(xì)胞ROS的影響（n=10，±s）

表2　紅花多糖的免疫調(diào)節(jié)作用及對(duì)腫瘤細(xì)胞ROS的影響（n=10，±s）

*表示與高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

組別　　劑量（mg/kg）耳腫脹度（mg）碳廓清率　ROS（%）陰性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組低劑量中劑量高劑量-25 15 45 135 5.38±0.86*4.07±0.64 5.42±0.77*5.37±1.03*4.22±0.78 2.51±0.47*2.63±0.55 2.67±0.73*3.12±0.68*4.97±1.12 49.17±5.61*28.52±5.13 37.68±6.12*30.14±4.78*24.77±4.38

2.3對(duì)抗氧化酶的影響：紅花多糖高劑量可明顯升高GR、GSHPX、CAT、SOD活性，降低MDA水平，與陰性對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表3。

表3　紅花多糖對(duì)抗氧化酶的影響（n=10，±s）

表3　紅花多糖對(duì)抗氧化酶的影響（n=10，±s）

*表示與高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

MDA （nmol/ml）陰性對(duì)照組　-　 534.2±113.6*631.5±138.7*41.2±3.8*286.3±47.5*5.38±1.12*陽(yáng)性對(duì)照組　25　 476.5±117.4 638.3±112.4 29.4±3.5 268.9±50.4 6.48±0.45低劑量　15　 518.7±99.3*663.8±168.7*40.3±4.1*295.7±40.8*4.63±0.87*中劑量　45　 543.8±133.1*674.1±126.8*48.6±5.3*308.5±50.1*4.28±0.76*高劑量　135　 637.5±124.7 775.2±201.4 61.2±7.1 351.7±46.2 3.58±0.41組別　　劑量（mg/kg）GR （mU/mg）GSH-PX （mU/mg）CAT （u/ml）SOD （u/ml）

3　討論

腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病機(jī)制及防治研究一直是我國(guó)腫瘤研究的重點(diǎn)，尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物及抗腫瘤輔助藥物是當(dāng)前腫瘤研究的重要內(nèi)容之一。研究資料顯示[4～5]，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與人體的機(jī)體免疫機(jī)能密切相關(guān)，免疫機(jī)能下降有利于腫瘤微環(huán)境的發(fā)展，大部分腫瘤患者的免疫力低下；傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為腫瘤的侵襲與患者臟腑功能衰退以及陰陽(yáng)氣血失調(diào)有關(guān)。中藥多糖作為抗腫瘤的熱門藥物近年來得到越來越廣泛的研究，抗腫瘤作用可通過免疫增強(qiáng)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡以及直接殺傷腫瘤細(xì)胞等多種途徑和環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)。

在本研究中我們以H22荷瘤小鼠模型，研究紅花多糖對(duì)腫瘤的抑制作用，并對(duì)可能涉及的機(jī)制進(jìn)行探討。結(jié)果顯示，紅花多糖高劑量可明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率與環(huán)磷酰胺相當(dāng)。紅花多糖高劑量組可明顯升高荷瘤小鼠的碳廓清指數(shù)。碳廓清指數(shù)是體現(xiàn)體內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬能力的重要標(biāo)志，巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答中最早對(duì)抗原產(chǎn)生反應(yīng)的細(xì)胞之一。由此可見，紅花多糖可促進(jìn)小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，提高非特異性免疫功能。

自由基可參與體內(nèi)的能量產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞及部分內(nèi)源性復(fù)合物的形成。有研究顯示[6～7]，若體內(nèi)自由基累積到一定程度，可通過損傷細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，從而破壞組織的正常形態(tài)和功能的完整性；ROS可加速機(jī)體的氧化損傷，從而促進(jìn)細(xì)胞的衰老，降低免疫力，是體內(nèi)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。本研究的結(jié)果顯示，小鼠灌服高劑量紅花多糖后，血清中GR、GSH-PX、CAT和SOD的活性水平較陰性對(duì)照組明顯升高，ROS和MDA水平明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明，紅花多糖可在一定程度上抑制ROS產(chǎn)生，減緩機(jī)體內(nèi)的SOD消耗，從而起到抗脂質(zhì)過氧化作用。

總之，紅花多糖可明顯增強(qiáng)H22荷瘤小鼠的免疫功能，清除自由基、減輕活性氧造成的損傷，從而起到抗腫瘤的作用。

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Effects of Carthamus tinctorius polysaccharides on the immunity function and antioxidant function of H22 tumor-bearing mice

Abstract：Objective：To observe the effects of Carthamus tinctorius polysaccharides on the immunity function and antioxidant function of H22 tumor-bearing mice. Method：50 H22 tumor-bearing mice were selected and divided into five groups as negative control group，positive group，Carthamus tinctorius polysaccharides groups（15 mg/kg，45 mg/kg and 135 mg/kg）. The model animals were treated and the effects were observed and compared. Results：The high dose of Carthamus tinctorius polysaccharides can obviously inhibit the growth of tumor（P＜0.05），the inhibitory rate was 66.8%. The MDA level of high dose group was significantly decreased（P＜0.05）and the GR，GSH-PX，CAT，SOD activities were increased significantly. Also，ROS in high dose group was decreased（P＜0.05）. Conclusion：Carthamus tinctorius polysaccharides can obviously increase the immunity function of H22 tumor -bearing mice scavenging ROS，alleviate the damage caused by reactive oxygen species which are all benefit for anti-tumor.

Key words：Carthamus tinctorius polysaccharides H22 tumor-bearing mice Immunity function Antioxidation

中圖分類號(hào)：R285

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1672-8351（2016）04-0111-02