吳桂玲，吳艷玲，楊再波，劉品禎（.貴州省黔南民族師范學(xué)院化學(xué)與化工系，貴州都勻558000；.信陽師范學(xué)院華銳學(xué)院，河南信陽464000）

?

麻竹葉總黃酮對(duì)毛尖茶葉脂氧合酶的抑制性

吳桂玲1，吳艷玲2，楊再波1，劉品禎1
（1.貴州省黔南民族師范學(xué)院化學(xué)與化工系，貴州都勻558000；2.信陽師范學(xué)院華銳學(xué)院，河南信陽464000）

摘要：采用正交試驗(yàn)法，以總黃酮含量為考察指標(biāo)，對(duì)麻竹葉的總黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時(shí)間為2h、料液比為1∶25（g/mL），提取效率較好。最佳工藝條件下黃酮提取率為1.39 %。并且研究了提取出的麻竹葉黃酮化合物對(duì)毛尖茶葉脂肪氧合酶LOX的抑制作用，并與人工合成抗氧化劑BHA、BHT和VC的抑制作用進(jìn)行比較。麻竹葉中黃酮化合物和BHA、BHT及VC對(duì)LOX都有抑制作用，IC(50)分別為29.478、10.938、9.049、9.04 μg/mL。麻竹葉中黃酮化合物對(duì)毛尖茶葉脂氧合酶有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞：麻竹葉；總黃酮；正交試驗(yàn)；毛尖茶葉；脂肪氧合酶；抑制作用

麻竹（Dendrocalamus latiflorus Munro）又名甜竹、大葉烏竹，屬禾本科竹亞科牡竹屬的大型叢生竹類，廣泛分布于中國(guó)福建、廣東、廣西、云南、貴州和四川等亞熱帶和熱帶地區(qū)。麻竹葉大，寬4 cm～7cm以上，內(nèi)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，很值得開發(fā)利用[1]。竹葉中含有大量的黃酮化合物和其他活性成分，其中黃酮化合物是天然的抗氧化劑[1-2]。竹葉黃酮安全無毒，但是竹葉基本上是作為廢棄物，任由其自然落葉、腐爛，尚未充分加以利用，是個(gè)相當(dāng)豐富的潛在資源[3-4]。

脂肪氧合酶（Lipoxygenase，EC1. 13. 11. 12）屬氧化還原酶，通稱脂氧酶（LOX），1932年在植物大豆中發(fā)現(xiàn)后，后來研究發(fā)現(xiàn)在藍(lán)藻細(xì)菌、真菌、藻類和很多脊椎動(dòng)物體中也存在脂氧合酶。它能夠選擇性催化具有順，順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)，生成具有共軛雙鍵的多不飽和脂肪酸氫過氧化物[5-6]，通過對(duì)其分子加氧，形成過氧化氫衍生物，是非常重要的藥物合成和化學(xué)合成的中間體。

茶樹葉片中LOX位于葉綠體的片層結(jié)構(gòu)中，茶葉的加工過程是塑造茶葉優(yōu)良品質(zhì)的關(guān)鍵，在此過程中，鮮葉中的多種酶類作用于鮮葉內(nèi)含物，LOX在綠茶加工過程中主要作用于鮮葉攤放過程和殺青初期對(duì)綠茶的香氣、滋味、湯色、外形等品質(zhì)均可產(chǎn)生重要的影響[7]，但是也應(yīng)該注意防止其較大量殘留引起的干茶變質(zhì)。茶葉中的脂肪氧合酶是茶葉產(chǎn)生陳味的主要原因[8]，因此，了解LOX的特性有助于在加工儲(chǔ)藏中盡可能的抑制其活性而達(dá)到有效保藏的目的。已有報(bào)道用電化學(xué)方法研究了槲皮素、紫杉葉素等4種黃酮化合物對(duì)大豆脂肪氧合酶的抑制作用[9]，而麻竹葉黃酮類化合物對(duì)茶葉中的脂肪氧合酶的抑制作用還鮮見報(bào)道。本研究對(duì)麻竹葉中黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行研究，旨在為天然黃酮類物質(zhì)的提取條件的優(yōu)化提供有益的參數(shù)，并且探討了麻竹葉中黃酮類化合物對(duì)都勻毛尖茶葉中的脂肪氧合酶的抑制作用，并與人工合成油脂抗氧化劑BHA和BHT以及抗壞血酸對(duì)毛尖茶葉脂肪氧合酶活性的抑制作用進(jìn)行比較，初步探討天然黃酮類化合物對(duì)脂氧合酶活性的抑制作用。有助于為進(jìn)一步進(jìn)行其失活機(jī)理的研究提供參考和方向，為茶葉保鮮的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1原料、試劑與儀器

麻竹葉，2014年采自都勻市，以水洗凈，烘干，粉碎20目過篩；蕓香葉苷，含量≥95.0 %；茶樹鮮葉采自都勻牛場(chǎng)；亞油酸（Sigma生產(chǎn)，純度為99. 9 %）；吐溫20；麥?zhǔn)暇彌_溶液（pH=6.3，0.1 mol/L，檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液）；叔丁基茴香醚（BHA）；2，6 -二叔丁基-4 -甲基苯酚（BHT）；抗壞血酸（VC），其他化學(xué)試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為黔南民族師范學(xué)院化學(xué)系分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制去離子水。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CL-2型恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PHS-2C精密pH計(jì)：上海理達(dá)儀器廠；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；GTR21-1高速冷凍離心機(jī)：上海趙迪生物科技有限公司；RE-2000Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州英三谷華儀器有限公司；高速萬能粉碎機(jī)：北京科偉永興儀器有限公司；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱；南通市通州區(qū)銳鋒制藥機(jī)械有限公司。

1.2方法

1.2.1麻竹葉總黃酮化合物的提取

稱取一定量的麻竹葉，加入一定體積的石油醚，在64℃左右回流，每次1 h，共3次。抽濾，棄濾液，留濾渣。加入一定濃度和一定體積的乙醇，在80℃下，回流一定時(shí)間，共回流1次。再抽濾，留濾液，棄濾渣。將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。加入無水乙醇或無水甲醇溶解，定容成體積為V2，備用。

1.2.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作建立

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品置于105℃下干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取0.020 0 g樣品，用少量無水甲醇溶解，再用無水乙醇定容至100 mL，得到0.20 mg/ mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、9.00 mL，分別置于7支25 mL的容量瓶中，加入5 %的亞硝酸鈉溶液1.00 mL，搖勻，放置6 min；加入5 %的硝酸鋁溶液1.00 mL，搖勻后，放置5 min；加入4 %的氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻，用無水乙醇溶液定容，放置15 min至20 min，于紫外可見分光光度計(jì)下進(jìn)行光譜掃描，找出500 nm處蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度A，試劑空白參比，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

1.2.3麻竹葉中總黃酮含量測(cè)定

測(cè)定麻竹葉中黃酮類化合物的含量，利用紫外可見分光光度計(jì)，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH比色法[10]，在波長(zhǎng)為500 nm處測(cè)定吸光度。取一定體積麻竹葉黃酮溶液于25 mL容量瓶中，加入5 %的亞硝酸鈉溶液1.00 mL，搖勻，放置6 min；加入5 %的硝酸鋁溶液1.00 mL，搖勻后，放置5 min；加入4 %的氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻，用無水乙醇溶液定容，放置15 min至20 min，于紫外可見分光光度計(jì)下進(jìn)行光譜掃描，找出500 nm處的吸光度A。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出黃酮樣品的濃度，再代入下式計(jì)算總黃酮的含量和提取率。

式中：C為樣品中總黃酮濃度，mg/mL；V1為1.2.3節(jié)中取出測(cè)量的體積，mL；V2為1.2.1節(jié)中定容的體積，mL；m為稱取麻竹葉的質(zhì)量，g。

1.2.4乙醇提取工藝因素水平的確定

通過參考文獻(xiàn)，以麻竹葉作為原料，選擇乙醇濃度、提取時(shí)間、固液比3個(gè)因素，每個(gè)因素選3個(gè)水平，按照L9（34）正交進(jìn)行試驗(yàn)。乙醇濃度選取60 %、80 %、95 % 3個(gè)水平，時(shí)間選取1、2、2.5 h 3個(gè)水平，固液比選取1∶10、1∶20、1∶25（g/mL）3個(gè)水平。其提取工藝試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　乙醇提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The different levels of the factors in orthogonal test

1.2.5毛尖茶葉脂肪氧合酶（LOX）的提取

將茶鮮葉洗凈晾干，粉碎，稱取10.000 0 g，加入200 mL pH為6.3的麥?zhǔn)暇彌_溶液，勻漿2 min，過濾，濾液在4℃時(shí)高速離心5 min，取上清液，加入固體硫酸銨至30 %飽和度，放置冰箱4 h后高速離心5 min，再取上清液，加入固體硫酸銨至70 %飽和度，在冰箱中過夜，取出高速離心10 min，取沉淀加入15 mL麥?zhǔn)暇彌_溶液溶解，得到粗酶液[11]。

1.2.6茶葉脂肪氧合酶（LOX）活性測(cè)定

茶葉脂氧合酶（LOX）的酶活性采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。以50℃，pH 6.3下，亞油酸為底物的15 mL反應(yīng)體系在234 nm處每分鐘增加0.001吸光度值定義為一個(gè)酶活單位[12-13]。

底物的制備：參照Axelrod等的方法[14]，略作修改，具體操作如下，將0.25 mL Tween 20分散于10 mL pH 9.0的0.2 mol/L的硼酸鹽緩沖液中，搖動(dòng)下逐滴加入0.27 mL亞油酸，充分混合，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液使體系澄清，調(diào)pH至9.0，然后用上述緩沖液稀釋到500 mL作為底物。

參照Axelrod等的方法[14]，略作修改，具體操作如下：3 mL反應(yīng)體系中含亞油酸鈉母液50 μL，緩沖液2 750 μL，粗酶液0.2 mL。在50℃下反應(yīng)，于234 nm處測(cè)定消光值。2 min時(shí)記錄一個(gè)數(shù)據(jù)，到4 min時(shí)再記錄一個(gè)數(shù)據(jù)，觀察OD值的變化，酶活性以△OD234·g-1FW·min-1來表示，重復(fù)3次。

LOX計(jì)算公式：A =1 000×[OD4min-OD2min]/2

式中：A為酶活性單位；OD4min為反應(yīng)4 min的OD值；OD2min為反應(yīng)2 min的OD值。

1.2.7茶葉脂肪氧合酶（LOX）的活性抑制性測(cè)定

分別取0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL一定濃度的麻竹葉黃酮化合物加入到含0.2 mL酶液（已稀釋一定倍數(shù)），50 μL底物的3 mL反應(yīng)體系中，混勻后用pH 為6.3的緩沖溶液補(bǔ)足至3 mL，于50℃恒溫水浴中恒溫2 min，進(jìn)行光譜掃描，并記錄234 nm處的吸光度，再于50℃恒溫水浴中恒溫2 min，進(jìn)行光譜掃描，并記錄234 nm處的吸光度。黃酮化合物對(duì)脂肪氧合酶的抑制率按下式計(jì)算：抑制率/% = [（A0- A1）/A0]×100

式中：A0為無抑制劑時(shí)的酶活力；A1為加抑制劑時(shí)的酶活力。

1.2.8人工合成抗氧化劑BHA和BHT以及VC對(duì)茶葉LOX活性抑制性測(cè)定

分別取一定濃度和一定體積的BHA和BHT以及VC化合物加入到含0.2 mL酶液（已稀釋一定倍數(shù)），50 μL底物的3 mL反應(yīng)體系中，混勻后用pH為6.3的麥?zhǔn)暇彌_溶液補(bǔ)足至3 mL，于50℃恒溫水浴中恒溫2 min，進(jìn)行光譜掃描，并記錄234 nm處的吸光度，再于50℃恒溫水浴中恒溫2 min，進(jìn)行光譜掃描，并記錄234 nm處的吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1蘆丁校準(zhǔn)曲線繪制和樣品總黃酮含量的測(cè)定

以500 nm下測(cè)定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值與濃度的關(guān)系，作線性回歸，可得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度C與吸光度A間的回歸方程為y = 10.874 12X + 0.008 6。相關(guān)系數(shù)R2= 0. 999 5，結(jié)果見圖1。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves of rutin

將500 nm處麻竹葉黃酮樣品溶液的吸光度值代入上面的回歸方程得到樣品麻竹葉中總黃酮含量。

2.2乙醇提取黃酮工藝參數(shù)確定

利用乙醇提取麻竹葉總黃酮，對(duì)影響提取率的乙醇濃度、提取時(shí)間和固液比等因素進(jìn)行了正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2　乙醇提取麻竹葉黃酮正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of the orthogonal test for extracting flavonoids by ethanol

續(xù)表2乙醇提取麻竹葉黃酮正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 The results of the orthogonal test for extracting flavonoids by ethanol

由表2可知，各因素對(duì)提取效果影響的主次順序?yàn)椋阂掖紳舛龋ˋ）>提取時(shí)間（B）>固液比（C）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果與分析，最佳條件為A2B2C3，即乙醇濃度為80 %，提取時(shí)間為2 h，固液比為1∶25 g/mL。最佳條件下提取的總黃酮測(cè)得的含量為13.9 mg/g，總黃酮提取率為1.39 %。

2.3茶葉脂肪氧合酶（LOX）活性測(cè)定

根據(jù)酶活力計(jì)算公式，在50℃，pH 6.3條件下，試驗(yàn)測(cè)得茶葉脂氧合酶的酶活力A = 33.9。

2.4麻竹葉黃酮對(duì)茶葉脂肪氧合酶（LOX）的活性抑制作用

在溫度為50℃，pH為6.3條件下，隨著麻竹葉黃酮化合物濃度的增大，黃酮化合物對(duì)茶葉脂肪氧合酶催化亞油酸底物的抑制性也隨之增強(qiáng)，結(jié)果見圖2。

圖2　麻竹葉黃酮對(duì)LOX的抑制率Fig.2 The inhibition rate for LOX of flavonoids from dendrocalamus latifloru

麻竹葉黃酮：IC50= 29.478 mg/mL。

2.5BHA、BHT以及VC化合物對(duì)LOX的抑制作用

在溫度為50℃，pH為6.3，濃度相同條件下，BHA、BHT和VC均對(duì)茶葉脂肪氧合酶催化亞油酸底物有抑制性，且抑制率隨著濃度的增加而增強(qiáng)。結(jié)果見圖3。

圖3　BHA和BHT以及VC對(duì)LOX的抑制率Fig.3 The inhibition rate for LOX of BHA、BHT and VC

計(jì)算得BHA：IC50= 10.938 mg/mL，BHT：IC50= 9.049 mg/mL，VC：IC50= 9.04 mg/mL。

2.6討論

相同條件下，不同黃酮化合物對(duì)大豆脂肪氧合酶抑制性（IC50）與人工合成抗氧化劑叔丁基茴香醚（BHA）、2，6 -二叔丁基- 4 -甲基苯酚（BHT）的抑制作用都不相同，其主要原因可能是因?yàn)椴煌寡趸瘎┑慕Y(jié)構(gòu)不同[15-16]。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了麻竹葉總黃酮乙醇提取工藝，得到影響因素主次順序?yàn)橐掖紳舛?提取時(shí)間>料液比。在最佳提取工藝條件，80 %乙醇，提取時(shí)間2 h，固液比1∶25 g/mL下，提取率可達(dá)1.39 %。麻竹葉中黃酮化合物對(duì)毛尖茶葉脂氧合酶有一定的抑制作用，在溫度為50℃，pH為6.3條件下，隨著黃酮化合物和人工合成抑制劑濃度的增大，天然黃酮化合物和人工合成抗氧化劑均對(duì)茶葉脂肪氧合酶催化亞油酸底物的抑制性也逐漸增強(qiáng)，相比較而言，人工合成抗氧化劑的抑制效果比麻竹葉中黃酮化合物的抑制性強(qiáng)，通過此研究，有助于為進(jìn)一步研究如何控制在干茶中保留的LOX在貯藏中作用于脂肪酸產(chǎn)生低碳醛而使茶葉產(chǎn)生異味，為茶葉保鮮的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]唐浩國(guó),鄭衛(wèi)東,陳宗道.麻竹葉黃酮類成分研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2005,21(4):114-118

[2]王春艷,劉樹立,鐘耕.竹葉黃酮的生理功能及提取工藝[J].食品與藥品,2007,9(4):59-61

[3]何春雷,羅學(xué)平,李麗霞,等.竹葉黃酮提取工藝的研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,24(4):409-412

[4]馬燮,楊虎,華高民,等.麻竹葉總黃酮提取工藝的研究[J].生物質(zhì)化學(xué)工程,2009,43(2):19-22

[5] Costas M, Mehn M P, Jensen M P, et al. Dioxygen activation at mononuclear nonheme iron active sites: enzymes, models, and intermediates[J]. Chem Rev, 2004, 104(2):939-986

[6] Noordermeer M A,Veldink G A, Vliegenthatr J F G. Fatty acid hydroperoxide lyase: a plant cytochrome p450 enzyme involved in wound healing and pest resistance[J]. Chem Bio Chem, 2001, 2(7/8): 494-504

[7]張正竹,施兆鵬,宛曉春.茶葉中的脂氧合酶[J].中國(guó)茶葉加工, 1998(3):31-34

[8]王雪,錢和,成玉梁.碧螺春中脂肪氧合酶的酶學(xué)特性研究[J].食品科技,2013,38(8):128-133

[9] Modesto RR, Adrian TC, Ma riadel CP, et al. Lipoxygenase inhibition by flavonoids: semiempir ical study of the structure2 activity relation[J]. J Mole Stru (Theochem ), 2004, 674: 121-124

[10]嚴(yán)贊開.紫外分光光度法測(cè)定植物黃酮含量的方法[J].食品研究與開發(fā),2007,28(9):164-167

[11]王海濱,包先進(jìn),陳宗道.茶樹脂肪氧化酶對(duì)亞油酸的降解作用[J].貴州茶葉,1990(4):22-23

[12]鐘芳,王璋,許時(shí)嬰. 3種脂肪氧合酶酶活測(cè)定方法[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào),2001,20(1):77-80

[13]陳昆松,徐昌杰,許文平.獼猴桃和桃果實(shí)脂氧合酶活性測(cè)定方法的建立[J].果樹學(xué)報(bào),2003,20(6):436-438

[14] Axelrod B,Cheesbrough T M,Leakso S.Lipoxygenase from soybeans [J].Methods in Enzymology,1981(7):443-451

[15]黃云,胡建安.天然黃酮類抗氧化劑對(duì)脂氧合酶介導(dǎo)四種具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)化合物氧化的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2004,18 (3):212-218

[16]馮濤,莊海寧.黃酮類化合物結(jié)構(gòu)特征與抗氧化性關(guān)系研究進(jìn)展[J].糧食與油脂,2008(10):9-13

Inhibitory Effects of Flavonoids in Leaves of Dendrocalam Latiflorus on the Activity of Lipoxygenase from Maojian Tea Leaves

WU Gui-ling1，WU Yan-ling2，YANG Zai-bo1，LIU Pin-zhen1
（1. Department of Chemistry and Chemical Engineering，Qiannan Normal College for Nationalities，Duyun 558000，Guizhou，China；2. Huarui College，Xinyang Normal University，Xinyang 464000，Henan，China）

Abstract：The optimizing extraction condition on the basis of flavonoids were determined by orthogonal design. The results showed that the optimal conditions were as follows：80 %（volume fraction）ethanol，extraction time at 2 h，1∶25（g/mL）solid-liquid ratio，the yield of total flavonoids on the optimal conditions was 1.39 %. The inhibitory effects of flavonoids from leaves of dendrocalam latiflorus on the activity of lipoxygenase from Maojian tea leaves were also studied. And compared with same concentration of BHA，BHT and VC. Flavonoids from leaves of dendrocalam latiflorus，BHA，BHT and Vc all have inhibitory effects on the activity of lipoxygenase from Maojian tea leaves，IC(50)were 29.478，10.938，9.049，9.04 μg/mL.The flavonoids from leaves of dendrocalam latiflorus had certain inhibition on lipoxygenase from Maojian tea leaves.

Key words：dendrocalamus latifloru；flavonoids of bamboo leaves；orthogonal design；Maojian tea leaves；lipoxygenase；inhibitory effects

收稿日期：2015-03-25

作者簡(jiǎn)介：吳桂玲（1985—），女（漢），講師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物研究。

基金項(xiàng)目：2013年度貴州省科學(xué)技術(shù)廳、黔南州科學(xué)技術(shù)和知識(shí)產(chǎn)權(quán)局、黔南民族師范學(xué)院聯(lián)合基金計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合J字LKS[2013] 17號(hào)）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.007